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Immunology and Infection

Differenziare i ruoli funzionali di espressione genica di cellule immunitarie e non immunitarie in Colite mouse da trapianto di midollo osseo

Published: October 1, 2012 doi: 10.3791/4208

Summary

Il trapianto di midollo osseo fornisce un modo per modificare il genotipo delle cellule del midollo osseo derivate. Se il gene di interesse viene espresso in cellule di midollo osseo sia derivati ​​e non le cellule del midollo osseo derivate, trapianto di midollo osseo può modificare le cellule del midollo osseo derivate da un genotipo diverso senza cambiare la non-genotipo delle cellule del midollo osseo derivate.

Abstract

Per capire il ruolo di un gene nello sviluppo della colite, abbiamo confrontato le risposte dei topi wild-type e geni di interessi topi knockout carenti da colite. Se il gene d'interesse è espressa in cellule di midollo osseo derivate entrambe e non le cellule del midollo osseo derivate dell'ospite, tuttavia, è possibile differenziare il ruolo di un gene di interesse in cellule derivate dal midollo osseo e non midollo osseo cellule derivate da tecnica di trapianto di midollo osseo. Per modificare il midollo osseo derivate genotipo cellule dei topi, il midollo osseo originale di topi riceventi sono stati distrutti mediante irradiazione e poi sostituito da midollo osseo del donatore di nuovo genotipo diverso. Quando wild-type topi donatore di midollo osseo è stato trapiantato in topi knockout, potremmo generare topi wild-type con l'espressione del gene in cellule derivate dal midollo osseo. In alternativa, quando i topi knockout donatore di midollo osseo è stato trapiantato in topi wild-type destinatario, topi wild-type, senza gene d'interesse che esprimeda cellule di midollo osseo derivate sono state prodotte. Tuttavia, il trapianto di midollo osseo non può essere completa al 100%. Pertanto, abbiamo utilizzato cluster di differenziazione (CD) molecole (CD45.1 e CD45.2) come marcatori di cellule del donatore e del ricevente per monitorare la proporzione di cellule del midollo osseo del donatore ottenuti in topi riceventi e il successo del trapianto di midollo osseo. Topi wild-type con CD45.1 topi knockout con genotipo e CD45.2 genotipo sono stati utilizzati. Dopo irradiazione di topi riceventi, le cellule ossee donatore di midollo di diversi genotipi sono stati infusi nei topi riceventi. Quando il midollo osseo nuovo rigenerato di prendere in consegna la sua immunità, i topi sono stati sfidati da agenti chimici (destrano solfato di sodio, 5% di DSS) per indurre colite. Qui abbiamo anche mostrato il metodo per indurre colite in topi e valutare il ruolo del gene di interesse espresso da cellule di midollo osseo derivate. Se il gene d'interesse dalle cellule ossee derivate svolge un ruolo importante nello sviluppo della malattia (come Escherichiatis), il fenotipo dei topi riceventi con trapianto di midollo osseo può essere significativamente modificati. Alla fine della sperimentazione colite, il midollo osseo derivate cellule nel sangue e midollo osseo sono state marcate con anticorpi contro CD45.1 e CD45.2 e il loro rapporto quantitativo di esistenza potrebbe essere utilizzato per valutare il successo del trapianto di midollo osseo mediante citometria a flusso. Riuscito trapianto di midollo osseo dovrebbe mostrare una vasta maggioranza di genotipo dei donatori (in termini di marcatori molecola CD) nel genotipo destinatario sia nel midollo osseo e nel sangue di topi riceventi.

Protocol

1. Prima-voi-iniziare Considerazioni tecniche

  1. Si consiglia di utilizzare entrambi i C57/BL6 topi wild-type e topi knockout per l'esperimento perché i topi con le molecole CD corrispondenti si possono acquistare dai fornitori principali del mouse.
  2. Poiché è difficile tenere traccia dei topi wild-type e topi knockout derivate cellule del donatore dopo il trapianto di midollo osseo, è necessario utilizzare CD45.1 topi per rappresentare topi wild-type. (CD45.1 C57/SJL topi WT magazzino Jackson Laboratories # 002014).
  3. La maggior parte delle colonie del mouse sono CD45.2. I nostri topi knockout appartengono CD45.2 genotipo (in alternativa un CD45.2 fonte topi WT: Jackson Laboratories # 000664). La determinazione di CD45.1 o CD45.2 genotipo può essere eseguita utilizzando la citometria a flusso del midollo osseo e del sangue periferico come indicato al punto 7 in questo protocollo.
  4. I topi dopo l'irradiazione hanno compromesso l'immunità. Tenere topi in patogeni servizio gratuito.
  5. Funzionamento di irradiatore richiede di sicurezza speciale clearance e formazione. Per risparmiare tempo nei processi di formazione e di approvazione, è meglio collaborare con un laboratorio con personale qualificato che è in grado di operare l'irradiatore.
  6. Molte istituzioni hanno laboratori di citometria a flusso con i tecnici esperti. Per ridurre al minimo i problemi con il funzionamento di citometria a flusso, è meglio per discutere il vostro piano di flusso citometria a sperimentare con il tecnico esperto prima di iniziare.
  7. I topi sono stati assegnati in questo modo (10 topi per gruppo):
Gruppo Donatori di midollo osseo al destinatario Trattamento
La BM scambio CD45.1 WT a CD45.2 KO DSS colite
B Acqua normale controllo
C BM scambio CD45.2 KO a CD45.1 WT DSS colite
D Acqua normale controllo
E Finzione CD45.1 WT a CD45.1 WT DSS colite
F Acqua normale controllo
Sol Finzione CD45.2 KO a CD45.2 KO DSS colite
H Acqua normale controllo

* Una breve illustrazione del protocollo sperimentale è mostrato in Figura 1.

2. Destinatario Mice irradiazione

  1. I topi sono allevati e tenuti in esente da organismi patogeni struttura. Luogo in topi torta irradiazione autoclavato con filtro. Mettere un mouse in ciascuno slot di torta di irradiazione. Mettere la torta in irradiatore e assicurarsi che il giradischi e la torta si rivolgono.
  2. Accendere la pompa ad ariaper la ventilazione. Chiudere la porta irradiatore e bloccarlo.
  3. Irradiare i topi con 1000 rad (che è equivalente a 10 Gy) circa 10 minuti (a seconda della fonte di radiazione e emivita). Da questo punto di tempo, i topi irradiati sono immuno-compromessi e hanno l'immunità debole contro le infezioni. Dopo l'irraggiamento, prendere la torta fuori e mettere in un recipiente sterile per il trasporto alla biosicurezza armadio in stabulario. Evitare di esporre i topi all'ambiente esterno per minimizzare possibilità di infezione.
  4. In armadio biosicurezza, trasferire i topi in gabbia topo autoclave con biancheria da letto autoclavato (4 topi per gabbia Aggiungi nuovo acqua sterile con sospensione sulfatrim -. 3,12 ml per 100 ml di acqua).
  5. Avvolgere la bottiglia d'acqua con un foglio di alluminio come gli antibiotici sono sensibili luce. Agitare per miscelare il flacone soluzione sulfatrim ben prima del caricamento alla gabbia.

3. Bone Marrow Donor Estrazione

  1. Sacrificio topi con anidride carbonica o isoflurzione e poi immergerlo in soluzione disinfettante 1:200. Spruzzare i topi con etanolo 70% per bagnare la pelle e sezionare ossa aperte.
  2. Immergere gli strumenti di dissezione in etanolo al 70% per la sterilizzazione.
  3. Eseguire la dissezione in un armadio biosicurezza. Utilizzare gli strumenti di dissezione sterili per esporre l'omero, femore, tibia e perone ossa, libero di attaccarsi muscoli e legamenti.
  4. Tagliare le due estremità delle ossa per mostrare il midollo osseo rosso. Tenere le ossa con una pinza. Lavare il midollo osseo rosso con PBS freddo con siringa da 3 ml e aghi 25G di una capsula di Petri. Lavare da entrambe le estremità delle ossa per produrre le cellule del midollo osseo più.
  5. Utilizzare 6 siringhe ml e 18G1 / 2 aghi per rompere le spine rosse del midollo osseo attraverso ripetute aspirazione ed espulsione. Trasferire midollo osseo con 50 ml provette Falcon.
  6. Girare il midollo osseo nel 1800 rpm per 5 min a 4 ° C. Gettare il surnatante, risospendere pellet vortexando per 5-10 sec.
  7. Diluire 10 volte tampone di lisi degli eritrociti con acqua sterile. Annunciod 1X tampone di lisi RBC (5 ml per topo donatore), vortex ancora per 5 sec e mantenere esattamente 3 min a temperatura ambiente.
  8. Dopo 3 minuti, riempire i tubi con 20 ml di PBS freddo per fermare la lisi e mescolare. Versare il contenuto attraverso un colino cellula 40 micron direttamente in un nuovo tubo da 50 ml Falcon.
  9. Sciacquare i tubi originali con 5 ml di PBS e trasferire al filtro cella pure. Top a 50 ml con PBS e mescolare.

4. Conteggio osseo cellule del donatore di midollo

  1. Aggiungere 100 pl di Trypan blu ad un tubo Eppendorf e 100 pl di sospensione di midollo osseo di un tubo Eppendorf e mescolare. Pipettare la miscela macchiato cella per un emocitometro.
  2. La quantità di cellule è calcolato conta totale delle cellule del midollo osseo che vivono in provette Falcon = numero di cellule non colorate in 16 quadrati x 2 (a causa della diluizione Trypan blu) x 10.000 x 50 ml
  3. Centrifugare le cellule del midollo osseo in provette Falcon da 50 ml a 2000 rpm per 5 min a 4 ° C.
  4. Rimuovere il surnatante. Basatosulle conta cellulare totale, risospendere il pellet con PBS per 1 x 10 8 cellule per ml

5. Infusione di topi riceventi

  1. Riscaldare le topi riceventi su un tappetino di calore e sotto una lampada di riscaldamento. Mettere i topi riceventi in dispositivo di immobilizzazione. Iniettare 1 x 10 7 cellule per topo in 100-200 microlitri via endovenosa.
  2. L'iniezione di midollo osseo del donatore deve essere effettuato tra 4-24 ore dopo l'irradiazione.
  3. Tieniti 4 topi iniettati per gabbia. Mantenere i topi riceventi iniettati in gabbie autoclave con acqua trattata con antibiotici per le prime 4 settimane di patogeni stabulario libero e lasciare che i topi riconquistare l'immunità. Gabbie Change, trattata con antibiotici acqua e cibo ogni 4 giorni per mantenere l'igiene.

6. L'induzione di colite e di valutazione del colite

  1. 4 settimane dopo il trapianto di midollo osseo e di irradiazione, passare l'acqua normale senza antibiotici e mantenere i topi per 2 settimane per riguadagnare la loro normalegut microflora.
  2. 6 settimane dopo l'iniezione di midollo osseo, misurare il peso corporeo iniziale. Alcuni topi sono date 5% destrano solfato in acqua potabile ad libitum per indurre colite. Alcuni topi sono dato acqua potabile regolare solo come gruppi di controllo normali.
  3. 5 giorni dopo, prelevare il sangue periferico, il trasferimento di eparina provette (Vacutainer) e tenere in ghiaccio. Piscina il sangue da 4 topi a 1 tubo. Combinano 300 microlitri di sangue con 300 pl di tampone di colorazione della cellula = 600 microlitri. Dividere il sangue per 5 provette Eppendorf, ciascuno con 100 ul.
  4. Sacrifica i topi con l'anidride carbonica o isoflurano. Valutare gli spartiti danni macroscopici (si prega di fare riferimento a un'altra pubblicazione dei video JOVE per i dettagli 1). Misurare modifica di peso corporeo. Misurare la lunghezza dell'intestino e spessore con calibro digitale. Osservare consistenza feci (duro, morbido o di sangue). Determinare sangue occulto nelle feci con Hemooccult. Staccare i tessuti del colon e fissare in formalina per la colorazione H & E.
  5. Dissect 1 femore bone per topo, estrarre il midollo osseo e lavare il midollo osseo con PBS freddo tramite l'ago 25G e siringa da 1 ml. Girone 4 midollo osseo tappi a 1 tubo e tenere in ghiaccio.
  6. Versare il midollo osseo a Petri, taglio la spina midollo osseo con l'ago 18G e 5 volte siringa ml più fino a quando non spina midollo osseo è presente.
  7. Spin down con 1.500 rpm per 5 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e risospendere con 600 microlitri di buffer colorazione delle cellule. Dividere il midollo osseo risospeso a 5 provette Eppendorf, ciascuno con 100 ul.

7. Controllo qualità del trapianto di midollo osseo mediante citometria a flusso

  1. Etichettare ogni provette di sangue o di midollo osseo # 1-5:
  2. Preparare la miscela di anticorpi per ogni rispettivo tubo al buio.

# 1 Nessun anticorpo
# 2 30 microlitri controllo isotipico FITC + 30 pl PE isotipo di controllo + 15 pl CD16/32 blocco
# 3 30 microlitri FITC CD45.1 Ab + 15 pl CD16/32 blocco
# 4 30 microlitri PECD45.2 Ab + 15 pl CD16/32 blocco
# 5 30 microlitri FITC CD45.1 Ab + 30 microlitri PE CD45.2 Ab + 15 pl CD16/32 blocco

Aggiungi nulla da sangue o del midollo osseo di esempio # 1
Aggiungere 5 ml di miscela di anticorpi # 2 per ciascun campione di sangue o midollo osseo # 2
Aggiungere 3 ml di miscela di anticorpi # 3 per ciascun campione di sangue o midollo osseo # 3
Aggiungere 3 ml di miscela di anticorpi # 4 per ciascun campione di sangue o midollo osseo # 4
Aggiungere 5 ml di miscela di anticorpi ° 5 di ciascun campione di sangue o midollo osseo # 5
  1. Conservare in buio in ghiaccio per 30 min.
  2. Aggiungere 2 ml di 1X RBC Lysis Buffer ad ogni provetta. Conservare al buio in ghiaccio per 15 min.
  3. Centrifugare le cellule a 1.500 rpm, 5 min a 4 ° C. (GH 3,8 rotore, 1.500 giri = 350 xg) Rimuovere il surnatante. Risospendere il pellet con 500 microlitri di buffer colorazione cella al buio, brevemente e poi vortice. Controllare il CD45.1 (che rappresenta WT) e CD45.2 (rappresentando KO) nel sangue immunocolorate e campioni di midollo osseo mediante citometria a flusso. Selezionare FITC per rappresentare WT CD45.1 e PE per rappresentare KO CD45.2.
  4. Analizzare i risultati citometria a flusso dal software FlowJo. Calcolare il rapporto di FITC: Rapporto PE o PE: rapporto FITC per determinare se il genotipo dei donatori è genotipo dominante nel sangue e nel midollo osseo.

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Representative Results

Se il gene d'interesse gioca un ruolo significativo in cellule immunitarie durante lo sviluppo della colite, i topi che hanno ricevuto midollo osseo di genotipo diverso attraverso il trapianto di midollo osseo (WT per KO o KO per WT) dovrebbe avere un'alterata risposta alla colite DSS. Uno dei parametri più importanti per determinare la gravità della colite è la H & E colorazione dei tessuti del colon. Colon cambiamenti della struttura dei tessuti e dei segni di infiammazione può essere quantitativamente valutati da H & E sistema di punteggio istologico. Criteri per H & E di punteggio istologico per il modello colite DSS può trovare qui 2. In alternativa, colite indotta chimica può anche essere indotta da trinitrobenzene solfonico (TNBS). Metodi di induzione colite TNBS e H & E criteri di valutazione istologici può essere trovato in una precedente pubblicazione 3. Punteggio differenza Istologia tra i gruppi possono essere analizzati da studente t-test.

I topi possono avere in modo significativomigliorata o peggiorata colite rispetto a topi con trapianto di midollo osseo farsa (WT di WT o KO per KO). Se il gene d'interesse gioca un ruolo significativo nella colite con cellule del midollo osseo derivate, i topi con midollo osseo scambiate dovrebbero rispondere significativamente diverso dai topi con trapianto di midollo osseo sham.

Per il modello colite DSS, il cambiamento istologia possono essere valutati il punteggio istologico (vedi Figura 4). Un cambiamento significativo del punteggio istologico possono indicare lo sviluppo della colite mediata dal gene d'interesse in cellule derivate dal midollo osseo. Per esempio, è un gene cathelicidin peptide antimicrobico e anti-infiammatori (gene d'interesse nel nostro caso) 4. Senza trapianto di midollo osseo, catelicidina topi KO generalmente sviluppati peggio colite di topi wild-type ha fatto in risposta al DSS. La trasfusione di wild-type (WT) midollo osseo a eliminazione diretta catelicidina (KO) topi porta alla colite migliorati mentre transfusisu di midollo osseo da cathelicidin knockout (KO) topi ai topi di tipo selvatico (WT) porta alla colite aggravata quando esposti ad DSS (Figura 2).

Per verificare l'espressione del gene d'interesse, l'espressione di mRNA del gene d'interesse (ad es. Catelicidina) dal donatore wild-type midollo osseo deve essere riscontrabile nei colon (o altro) tessuti di topi knockout catelicidina deficienti destinatario dopo osso Trapianto di midollo. E 'anche interessante sapere se l'espressione del gene d'interesse in topi wild-type destinatario si riduce dopo la donazione di midollo osseo knockout mice.

Attecchimento di successo di midollo del donatore osseo è rappresentato dal rapporto dominante di isotipo donatore CD oltre isotipo destinatario CD sia nelle cellule del sangue periferico e del midollo osseo di topi riceventi. Midollo osseo mostra migliore etichettatura di CD45.1 e CD45.2 in citometria a flusso come sangue ha molte cellule non marcate (Figura 2 e 3).


Figura 1. Il protocollo sperimentale di trapianto di midollo osseo.

Figura 2
Figura 2. Dati di citometria a flusso di midollo osseo di topi riceventi dopo il trapianto di midollo osseo. L'asse Y mostra coniugati con fluoresceina CD45.1 segnale e asse X mostra PE marcato CD45.2 segnale. Trapianto di midollo successo è definito dal cambiamento di CD45.1 o CD45.2 genotipo sia midollo osseo e nel sangue dei topi riceventi. Clicca qui per ingrandire la figura .


Figura 3. Dati di citometria a flusso di sangue di topi riceventi dopo il trapianto di midollo osseo. L'asse Y mostra coniugati con fluoresceina CD45.1 segnale e asse X mostra PE marcato CD45.2 segnale. Trapianto di midollo successo è definito dal cambiamento di CD45.1 o CD45.2 genotipo sia midollo osseo e nel sangue dei topi riceventi. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 4
Figura 4. Valutazione della colite nei topi dopo il trapianto di midollo osseo. (A) Esempio di H & E le immagini di due punti con normal istologia e DSS colite. (B) segna Istologia. Induzione di successo di colite DSS può essere confermata da un aumento significativo del punteggio istologico dopo 5 giorni di trattamento DSS. Dopo lo scambio di midollo osseo al genotipo diverso, il punteggio istologico dovrebbe cambiare in modo significativo. Questo suggerisce corso alterata della colite dal gene d'interesse esprimere in cellule di midollo osseo derivate. Dati sono rappresentate da media ± errore standard di mezzi.

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Discussion

Questo approccio di midollo osseo trapianto è adatto per la ricerca di immunologia colite, infezioni, cancro, obesità e altre malattie. Questo esperimento midollo osseo trapianto è necessaria quando il gene d'interesse è espresso in entrambi derivate dal midollo osseo e non le cellule del midollo osseo derivate e il gene d'interesse si sospetta di mediare malattia da parte delle cellule da entrambe le popolazioni. Per esempio, peptide antimicrobico cathelicidin viene mostrato per modulare colite acuta. Ma è espresso in cellule epiteliali e cellule immunitarie (ad esempio macrofagi). Poi abbiamo usato trapianto di midollo per definire quale popolazione di cellule modula colite acuta nei topi. La gravità colite è risultata significativamente modificata dopo il cambio di genotipi osseo catelicidina midollo tramite trapianto di midollo osseo. Quindi possiamo concludere che cathelicidin espresso in cellule di midollo osseo derivate gioca un ruolo importante nella modulazione della colite acuta in risposta al DSS.

Bone macellule derivate RROW includono tipicamente i globuli rossi, globuli bianchi e piastrine. Il trapianto di midollo osseo cambia il genotipo di queste cellule ma non altri. Lateralmente parlando, questo esperimento non può che differenziare il ruolo del gene d'interesse in cellule derivate dal midollo osseo rispetto ai non-midollo osseo cellule derivate. Ma questo esperimento non può ulteriormente definire quale popolazione di derivate dal midollo osseo cellule media sono derivate la colite come tutti i globuli rossi, globuli bianchi e piastrine dal midollo osseo. Il destino delle cellule del midollo osseo derivate migrati in due punti durante la colite è un'area attiva di ricerca e controverso. Dopo trapianto di midollo osseo e induzione della colite murina, è probabile che alcuni di cellule di midollo osseo derivate esistere come cellule linfoidi e miofibroblasti in due punti 5. Un altro rapporto ha suggerito che le cellule derivate dal midollo osseo servire come cellule progenitrici endoteliali per neovascolarizzazione nel processo di recupero 6. C'è anche evidencelettroniche mostrano cellule di midollo osseo derivate sono associati con la differenziazione delle cellule epiteliali in pazienti con colite 7. Non possiamo escludere la possibilità che alcune delle cellule del midollo osseo derivate possono differenziare in altre celle di tipiche cellule del sistema immunitario e svolgono un ruolo nello sviluppo modulare colite. Tuttavia, midollo osseo derivate monociti / macrofagi popolazione è importante per la protezione contro i danni causati da sostanze chimiche colonic mucosa 8,9. Questa relazione è coerente con la nostra constatazione che catelicidina espresso dalle cellule del midollo osseo derivate modula colite DSS mentre catelicidina è secreta da monociti / macrofagi 4.

D'altra parte, vi sono molti modi per monitorare il successo del trapianto di midollo osseo. L'analisi di citometria a flusso CD45.1 e CD45.2 genotipi può fornire un metodo quantitativo per determinare la percentuale di donatori cellule staminali del midollo osseo cellulari derivate nei topi riceventi. Derivate dal midollo osseo cellules possono differenziarsi in molteplici tipi di cellule 10. Quando l'analisi citometria di flusso non è fattibile, è possibile utilizzare maschi (XY cromosoma) topi donatori e femminili (cromosoma XX) topi riceventi 11. I topi donatori porteranno cromosomi Y uniche nel corpo di topi riceventi XX solo femminili. Cromosoma Y può essere identificato da ibridazione in situ fluorescente 11. Inoltre, immunoistochimica di CD45.1, CD45.2 e / o il gene d'interesse nei tessuti può essere necessario visualizzare le cellule del midollo osseo del donatore derivati.

Ma CD45 analisi di citometria a flusso e cromosoma Y nelle procedure di ibridazione in situ si realizza dopo che i topi sono stati sacrificati. Per monitorare la posizione di cellule del donatore nei topi riceventi utilizzati per studiare malattie croniche come il cancro senza sacrificare i topi, è possibile utilizzare la proteina fluorescente verde topi transgenici come topi donatori 12. Pertanto, l'osso donatore marcellule derivate fila possono essere monitorati nel corpo dei topi riceventi sotto non invasiva alta risoluzione ottica sotto anestesia transitoria e questo può essere fatto ripetutamente.

Non tutti i topi hanno trapianto di midollo osseo di successo 13. Abbiamo osservato ~ 10-20% dei topi muoiono nelle prime 2 settimane dopo l'irradiazione a causa di anemia o infezioni. Pertanto, più del necessario topi dovrebbe essere preparato all'inizio dell'esperimento. Ad esempio, si dovrebbe preparare 10 topi per gruppo all'inizio di esperimento, se vi aspettate 8 topi per gruppo disponibile alla fine dell'esperimento colite. Inoltre, assicurarsi di rimuovere i topi morti nel più breve tempo possibile. La velocità di ricostituzione immunitaria è correlato al numero di cellule staminali ematopoietiche nel midollo osseo infuso nei topi riceventi 14. Pertanto, è fondamentale avere un numero sufficiente di cellule vive di midollo osseo (1 x 10 7 cellule per topo) infuse in topi riceventi per tr successo midollo osseoansplantation.

Topi riceventi, dopo irradiazione hanno compromesso l'immunità. Donatori dissezione topi e procedure di preparazione del midollo osseo dovrebbe essere fatto nella norma stessa esperimenti di coltura cellulare. L'uso di strumenti sterili e contenitori, le tecniche di manipolazione asettica deve essere applicato. Durante tutti gli esperimenti, PBS contenente 1% di penicillina-streptomicina e 10 U / ml di eparina deve essere utilizzato durante la manipolazione di zucchine ossee. Tutti i reagenti sono di grado coltura cellulare. Ulteriori discussione tecnica può essere trovato in riferimento 13.

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Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato finanziato da pilota e Borsa di studio di fattibilità da UCLA-CURE Center, il morbo di Crohn e Colite Foundation of Career Development Award America (# 2691) e Istituto Superiore di Sanità NIDDK K01 (DK084256) finanziamenti per Hon Wai Koon.

Midollo osseo irradiazione operazione è stata assistita da Bernard Levin e cucina Scott di UCLA Center for Research mouse AIDS / umano Core Facility Chimera. Citometria di flusso operazione è stata assistita da impianto UCLA Nucleo Vector.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell staining buffer Biolegend #420201
10X RBC lysis buffer Biolegend #420301
FITC mouse isotype control Biolegend #400207
PE mouse isotype control Biolegend #400211
PE anti-mouse CD45.2 Biolegend #109807
FITC anti-mouse CD45.1 Biolegend #110705
Anti-mouse CD16/32 blocking Biolegend #101301
40 μm cell strainer Fisherbrand #22363547
PBS 1X MP biomedicals #1860454
Heparin Fisherbrand #BP2425
Sulfatrim (SMZ) Qualitest NC9242720 (fisher)
Lysol IC Andwin Scientific NC9745686 (fisher)
Vaccutainer BD #8000813
Mouse restrainer Braintree Scientific #TV-150
Irradiator J.L. Shepherd and Associates Mark I 68A
Flow cytometer BD BD FACSCanto II
Flow cytometer test-tube Falcon #352052
Digital caliper Fisherbrand 14-648-17
Hemoccult ICT Beckman Coulter G0328QW

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References

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Immunologia Numero 68 Genetica Biologia Cellulare Fisiologia trapianto di midollo osseo la colite i topi l'irradiazione
Differenziare i ruoli funzionali di espressione genica di cellule immunitarie e non immunitarie in Colite mouse da trapianto di midollo osseo
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Koon, H. W., Ho, S., Cheng, M.,More

Koon, H. W., Ho, S., Cheng, M., Ichikawa, R., Pothoulakis, C. Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation. J. Vis. Exp. (68), e4208, doi:10.3791/4208 (2012).

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