De alto rendimiento para los moduladores de molécula pequeña de tráfico de perfeccionamiento activo Canales rectificador de potasio

Summary

Los métodos para desarrollar y validar un ensayo cuantitativo de fluorescencia para medir la actividad de potasio rectificador de entrada (Kir) canales para la investigación de compuestos de alto rendimiento se presenta.

Abstract

Miembros específicos de la familia rectificador de potasio hacia el interior del canal (Kir) se postulan dianas de fármacos para una variedad de trastornos, incluyendo la hipertensión, fibrilación auricular, y ^1,2 dolor. En su mayor parte, sin embargo, el progreso hacia la comprensión de su potencial terapéutico o funciones fisiológicas incluso básicos ha sido retrasado por la falta de buenos herramientas farmacológicas. En efecto, la farmacología molecular de la familia rectificador interno se ha quedado muy por detrás del de la superfamilia de S4 de potasio dependientes de voltaje (Kv) canales, para lo cual se han realizado una serie de afinidad nanomolar y péptidos moduladores selectivos de la toxina altamente descubiertos ^3. El veneno de abeja tertiapin toxina y sus derivados son potentes inhibidores de Kir1.1 y Kir3 canales de ^4,5, pero los péptidos son de uso limitado terapéuticamente así como experimentalmente, debido a sus propiedades antigénicas y una escasa biodisponibilidad, estabilidad metabólica y la penetrancia tejido. El desarrollo de potentesy selectivos de molécula pequeña sondas con mejores propiedades farmacológicas será una clave para un completo entendimiento de la fisiología y el potencial terapéutico de los canales Kir.

El Bibliotecas Molecular Sondas Centro de Producción de red (MLPCN), apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH) Fondo Común ha creado oportunidades para los científicos académicos para iniciar campañas de detección de la sonda para dianas moleculares y vías de señalización que necesitan una mejor farmacología ^6. El MLPCN ofrece a los investigadores acceso a los centros de cribado a escala industrial y química médica y la informática apoyar el desarrollo de pequeñas moléculas sondas para elucidar la función de los genes y las redes de genes. El paso crítico en la obtención de la entrada a la MLPCN es el desarrollo de un ensayo robusto diana específica o vía-que es susceptible de cribado de alto rendimiento (HTS).

Aquí se describe cómo desarrollar una fluorescencia basada en talio (Tl ⁺⁾ flujo ASSAy de Kir función del canal para la investigación de compuestos de alto rendimiento ^7,8,9,10. El ensayo se basa en la permeabilidad de la K ⁺ poro del canal para el K ⁺ Tl ⁺ congénere. A comercialmente disponibles fluorescente Tl ⁺ colorante reportero se utiliza para detectar flujo transmembrana de Tl ⁺ a través del poro. Hay por lo menos tres colorantes comercialmente disponibles que son adecuados para TL ⁺ ensayos de flujo: BTC, FluoZin-2, y Fluxor ^7,8. Este protocolo describe el desarrollo del ensayo utilizando FluoZin-2. Aunque originalmente desarrollado y comercializado como un indicador de zinc, FluoZin-2 exhibe un aumento robusto y dependiente de la dosis en la emisión de fluorescencia tras la unión Tl ^+. Comenzamos a trabajar con FluoZin-2 antes estaba disponible Fluxor ^7,8 y han seguido haciéndolo ^9,10. Sin embargo, los pasos en el desarrollo del ensayo son esencialmente idénticas para los tres tintes, y los usuarios deben determinar qué colorante es más apropiado para su específico nEEDS. También se discuten los puntos de referencia del ensayo de rendimiento que se deben alcanzar para ser considerado para la entrada en el MLPCN. Desde Tl ⁺ penetra fácilmente la mayoría de los canales de K ^+, el ensayo debe ser adaptable a la mayoría de los objetivos de los canales de K ^+.

Protocol

1. Generación de líneas celulares estables policlonales

1. El establecimiento de una línea celular estable que expresa la alta calidad del canal Kir de interés es un primer paso importante hacia el desarrollo de un sólido de alto rendimiento ensayo de cribado. Constitutiva sobreexpresión canal K ⁺ puede conducir a la activación de las vías de muerte celular, degeneración estable línea celular y la pérdida de rendimiento del ensayo. Para evitar estos posibles problemas y proporcionar un control interno conveniente para el desarrollo del ensayo (véase más abajo), un sistema de expresión inducible por tetraciclina se recomienda ^8.
2. Cultura del parental T-Rex-células HEK293 utilizando técnicas estándar en B-medio (medio DMEM de crecimiento que contiene 10% de FBS, 50 U / ml de penicilina, 50 mg / ml de estreptomicina y 5 mg / ml blasticidina S). Usar células tempranas de paso (por ejemplo, pasajes 3-4 desde la descongelación del almacenamiento en nitrógeno líquido) para la transfección y selección de clones estables.
3. Lámina 4 millones de T-Rex-HEK293 células en un75 cm ² matraz de modo que el matraz es de aproximadamente 80% confluentes el día siguiente. Cultura durante la noche en un 5% de CO ₂ incubadora a 37 ° C.
4. Transfectar las células por medio de 10-15 g de pcDNA5/TO-Kir ADN y el reactivo Lipofectamine LTX / Plus de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después de 5 horas, reemplazar el medio de transfección con B-medio.
5. 24 h después de la transfección, sustituir el medio con B-B-medio que contiene 250 mg / ml de Higromicina (BH-medio) para comenzar selección de clones estables. Alimentar a las células cada 2-3 días con un nuevo BH-medio plazo.
6. Mayor que 90% de las células deben morir en los próximos 7 días, dejando atrás las pequeñas colonias de células transfectadas establemente. Permitir a las colonias a crecer durante otros 10-14 días antes de partir a un 175 cm ² frasco de expansión.
7. Para la criopreservación, congelar 3 x 10 ⁶ células / ml en medios que contienen 45% condicionado BH-medio, 45% libre de antibióticos, DMEM que contiene suero y 10% de DMSO. Congelarlas células durante la noche a -80 ° C en un recipiente de congelación celular y luego pasar a nitrógeno líquido para almacenamiento a largo plazo. Descongelar las células de nitrógeno líquido utilizando el protocolo recomendado de Invitrogen. Tenga en cuenta que la viabilidad de las células será menor si se congelan de un matraz que es mayor que 75% confluentes en el momento del procesamiento.

2. Generación de líneas celulares estables monoclonales

1. Lave un sub-confluente 75 cm ² frasco de células policlonales estables con divalente libre de HBSS. Añadir 1 ml de tripsina y se incuba durante 3-5 min en un 5% de CO ₂ incubadora a 37 ° C. Añadir 5 ml de BH-medio al matraz para inhibir la actividad de la tripsina y se tritura varias veces (por ejemplo, 5 veces) para disociar completamente las células. Inspeccione cuidadosamente las células bajo un microscopio para asegurar la suspensión se compone casi enteramente de células individuales. Esto aumentará la probabilidad de obtener líneas celulares monoclonales.
2. Determinar la densidad celular y diluirla suspensión a una concentración de 0,7 células por 20 l. Utilizando una pipeta multicanal, una pipeta 20 l de la suspensión celular en cada pocillo de BD PureCoat amina recubierto (o equivalente poli-D-lisina recubierto) placas de 384 pocillos. En principio, el 70% de los pocillos deben recibir una célula con estas condiciones de galvanoplastia. Así, una placa de 384-y debe contener más de 200 clones para analizar. Continuar el cultivo de las células en un 5% de CO ₂ incubadora a 37 ° C.
3. Después de una semana, inspeccionar las placas bajo un microscopio para pocillos que contenían colonias individuales. Tenga en cuenta su posición en la tapa con un marcador permanente para referencia futura. Asegúrese de anotar también y no incluyen pozos que contienen múltiples colonias. Estos son los más fácilmente reconocidos por la aparición de colonias que crecen de múltiples lados del pozo. Tenga en cuenta que la evaporación tiende a ocurrir más rápidamente de pozos cerca del borde de la placa. Añadir BH-medio a los pozos donde la evaporación significativa se ha producido. De lo contrario, es t innecesarioo alimentar a las células.
4. Monitorear los pozos con mayor frecuencia durante los 7-10 días siguientes. Las células estará listo para dividir cuando los pozos de interés son al menos 50% confluente.
5. Dividir las células de duplicar placas de 384-y, una placa para el ensayo con Tl ⁺ flujo y el otro para la continuación de las líneas monoclonales en cultivo. Aspirar el medio de los pocillos que contienen las líneas celulares de interés. Lavar las células con divalente libre de HBSS, añadir 20 l de tripsina a cada pocillo y la placa de transferencia a una incubadora a 37 ° C durante 15-20 min. Después de mover la placa de nuevo a la campana de cultivo de células, añadir 20 l de BH-medio a cada pocillo y se tritura varias veces para disociar las células. Inspeccionar los pocillos bajo un microscopio para asegurar que las células se disocian completamente. Esto puede requerir múltiples rondas de pipeteado, ya que las células serán firmemente adherente. Una vez que las células se disocian, transferir 10 l de cada suspensión celular a pocillos duplicados de una 38 nueva BD PureCoat amina recubierto4 pocillos. Asegúrese de anotar la relación entre el origen y destino y duplicar los pozos para que los clones que presentan una actividad robusta canal Kir (véase más adelante) se remonta a la fuente original. Añadir 20 l de BH-medio a la fuente original bien para alimentar las células restantes y continuar en cultivo en el 5% de CO ₂ incubadora a 37 ° C.
6. Permitir que las células en la placa de destino para adherirse y crecer hasta una semana. Una vez que la mayoría de los clones de alcanzar al menos el 50% de confluencia, pueden ser evaluados para la actividad del canal Kir usando el Tl ⁺ ensayo de flujo se describe a continuación.
7. El día antes del ensayo, aspirar el medio de cultivo y reemplazarlo con BH medio que contiene 10% de FBS dializado. Esto evita canal de expresión involuntaria que podrían surgir a partir de suero de tetraciclina contaminada. Inducir la expresión Kir canal en sólo uno de los pocillos duplicados para cada clon mediante la inclusión de 1 ug / ml de tetraciclina. El duplicado no inducido bien servirá como"Background" de control. Realice el Tl ⁺ ensayos de flujo como se describe a continuación.

3. General de Tl ⁺ Procedimiento Flux Ensayo

1. El día antes de una Tl ⁺ experimento de flujo, se disocian las células y cuantificar la densidad de la suspensión de células como se describe en las secciones 2,1 y 2,2. Placa 20.000 células monoclonales transfectadas de forma estable con un gen de canal Kir de interés en cada pocillo de una BD PureCoat amina recubierto 384-así placa con un Combi Thermo Multidrop o una pipeta multicanal. Use el medio BH contiene 10% de FBS dializado para el chapado. Tenga en cuenta que algunas células se cultivaron durante la noche con 1 mg / ml de tetraciclina para inducir la expresión Kir canal, mientras que otros no. La ubicación de las células inducidas y no inducido serán diferentes para cada tipo de experimento y se muestra en la figura 1.
2. El día siguiente, inspeccionar las placas bajo un microscopio para asegurar que las células son adherentes y distribuida uniformemente en el fondode los pocillos. Los pocillos deben ser 80-90% de confluencia.
3. Utilice un lavador de microplacas ELx405 para reemplazar el medio de cultivo celular con 20 l por pocillo de tampón de ensayo HBSS que contenía HEPES 20 mM y tamponada a pH 7,3 con NaOH. Alternativamente, se puede utilizar un "flick y slam" método, en donde la placa se invierte y se rompió bruscamente hacia abajo para expulsar el medio en un contenedor de residuos, y luego palmeó sobre toallas de papel apilados para eliminar los medios restantes. Inmediatamente añadir de nuevo tampón de ensayo HBSS a la placa para evitar que las células de desecación.
4. Prepare el FluoZin-2, AM solución de carga de colorante. Después de una breve centrifugación del tubo, se disuelven 50 g de polvo FluoZin-2 en 100 l de DMSO anhidro. En este punto, las alícuotas de la solución madre de 1.000 x puede ser almacenado a -20 ° C para su uso posterior. Cuando esté listo para usar, añadir 50 l de un 20% en peso por volumen de solución de Pluronic F-127/DMSO para el colorante y mezclar con pipeteo suave. No congele el tinte una vez Pluronic F-127 se ha agregado, comobaja temperatura puede causar que el agente tensioactivo a precipitar fuera de la solución. Añadir el volumen de 150 l de FluoZin-2, AM/Pluronic-F127 a 100 ml de tampón de ensayo HBSS y mezclar suavemente para que el tampón de carga del colorante. El uso de un Combi Multidrop o pipeta multicanal, añadir 20 l de tampón de carga de colorante a cada pocillo que ya contenía 20 l de tampón de ensayo HBSS. Se incuban las células a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 h (típicamente de incubación se ha realizado en la oscuridad, aunque no hay evidencia directa de que es necesario).
5. Mientras que las células se cargan con el tinte, preparar un plato Tl ⁺ estímulo. Recién disolver 0,5 g de bicarbonato sódico en 50 ml de tampón de estímulo 5x Tl ⁺ que contiene sulfato de magnesio 1 mM, 1,8 mM de sulfato de calcio, 5 mM de glucosa, 10 mM HEPES y 12 mM de sulfato de Tl ^+. Alternativamente, bicarbonato de sodio puede ser reemplazado con gluconato de sodio si, por ejemplo, el pH de la solución debe mantenerse dentro de un rango muy estrecho y la pérdida de dióxido de carbonoes una preocupación. Se tapa el tubo herméticamente para limitar el escape de dióxido de carbono y se invierte varias veces hasta que el bicarbonato de sodio entra en solución. Utilizando una pipeta multicanal, añadir 50 ml de la solución a cada pocillo de un polipropileno de 384-así placa (Tabla 1).
6. Después de que las células han sido cargados con FluoZin-2, AM, lavar las placas con un lavador de microplacas ELx405 o usando el "flick y slam" método, como se describe anteriormente en la sección 3,3. Dependiendo del tipo de Tl ⁺ experimento de flujo a realizar, añadir de nuevo 20 l o 40 l de tampón de ensayo HBSS a cada pocillo. Las placas están listas para experimentos.
7. La célula y Tl ⁺ placas en un Hamamatsu Funcional Sistema de Control de Drogas (FDSS) o equivalente lector cinético placa de imagen integrado con capacidades de dispensación de líquido. Use filtros apropiados para fluoresceína / fluoresceína colorantes basados ​​tales como Fluo-4.
8. Establecer un protocolo de una sola extensión para que el 5x 10 l Tl ⁺serie se añade a los pocillos correspondientes de la placa de células que contiene 40 l de tampón de ensayo HBSS. Record fluorescencia de referencia a una frecuencia de 1 Hz de muestreo de al menos 10 seg. La fluorescencia acomodado bien debe ser uniforme y estable en toda la placa una vez que las condiciones de recubrimiento celular óptimo, lavado y tinte de carga se establecen. Un sistema integrado de 384 canales pipeta se utiliza para añadir simultáneamente el tampón de Tl ⁺ estímulo a cada pocillo.
9. Registro durante al menos 2 min de manera que la velocidad y el pico de la Tl ^+-inducida por aumento de la fluorescencia se captura para análisis fuera de línea.

4. Determinación de la concentración óptima + Tl

1. Tl ⁺ más fácilmente penetra hacia el interior del rectificador canales de K ^+. Para asegurarse de que las concentraciones de Tl ⁺ no exceden el rango dinámico de la Tl ⁺ colorante reportero FluoZin-2, uno debe determinar empíricamente la concentración óptima Tl ⁺ para ser utilizado en un alto throughput pantalla. Se recomienda una concentración de Tl ⁺ que evoca 80% de la respuesta máxima de fluorescencia (CE ₈₀₎ bajo condiciones donde se máximamente el canal activado.
2. Plate, colorante de carga y se lavan las células en BD PureCoat amina recubiertos o equivalente poli-D-lisina placas 384-y como se describe anteriormente en la sección 3, dejando 40 l de tampón de ensayo HBSS en cada pocillo. Como se muestra en el mapa de placa en la figura 1A, columna 1 y filas A1-A23 debe contener células que no han sido inducidas con tetraciclina y por lo tanto no expresan el canal Kir de interés. Las señales FluoZin-2 de fluorescencia de los pocillos no inducidas se utilizan para determinar el nivel de Tl ⁺ flujo a través de las vías endógenas, tales como la Na ⁺ - K ^+-ATPasa de la bomba y K cerrada voltaje ⁺ canales, que normalmente se expresan en células HEK- 293 células.
3. Utilice un Agilent Bravo Liquid Handling Plataforma Automatizada o manual de pipeteado para preparar unonce puntos Tl ⁺ concentración de diluciones en serie en tampón de ensayo HBSS. Típicamente, una serie de 3-veces la dilución en serie que van desde 100% a 0,002% ⁺ Tl se evaluaron en el ensayo. La serie se compone a una concentración 5 veces debido a que las soluciones de Tl ⁺ se diluyó 1:5 en el ensayo final. Preparar la serie de dilución diluyendo el estándar 5x Tl ⁺ tampón descrito en la sección 3 con un 5x Tl ^+-libre tampón que contiene 1 mM de sulfato de magnesio, 1,8 mM de sulfato de calcio, 5 mM de glucosa y 10 mM HEPES. De nuevo, recién disolver 0,5 g de bicarbonato sódico en 50 ml de tampón de la final Tl ⁺ inmediatamente antes de la siembra en un polipropileno 384-y placas de acuerdo con el mapa de placa mostrada en la Figura 2A.
4. Cargue el celular y Tl ⁺ placas de estímulo a la FDSS. Establecer un protocolo de una sola complemento para que la 10 l 5x Tl ⁺ serie se añade a los pocillos correspondientes de la placa de células que contiene 40 l de HBSS tampón de ensayo. Línea de base Record FluoZin-2 fluorescencia durante 10 segundos antes de la adición de Tl ⁺ a la placa. Repetir el experimento en 3 días diferentes para establecer la reproducibilidad de los resultados.

5. Determinación de la sensibilidad del ensayo a DMSO

1. Las moléculas pequeñas interrogados en una pantalla de alto rendimiento se disuelven en el disolvente orgánico sulfóxido de dimetilo (DMSO), que a su vez puede afectar al rendimiento del ensayo. Por lo tanto, la sensibilidad del ensayo para DMSO primero debe ser examinada para establecer la concentración más alta de DMSO permisible en la pantalla.
2. Plate, colorante de carga y se lavan las células en BD PureCoat amina recubierto con placas de 384-y como se describe anteriormente en la sección 3, dejando 20 l de tampón de ensayo HBSS en cada pocillo. La placa entera debe contener células que han sido inducidas con tetraciclina (Figura 3A).
3. Utilice una plataforma automatizada de Bravo Manipulación de líquidos o manual pipetear para preparar una D de once puntosConcentración MSO serie de dilución en tampón de ensayo HBSS. Típicamente, una serie de diluciones de 2 veces que va desde 10% a v / v 0,01% DMSO se evaluó la actividad en el ensayo. La serie debe estar compuesto a una concentración 2x ​​porque las soluciones en DMSO se diluyó a la mitad en el ensayo final. La serie de dilución debe ser chapada en un polipropileno de 384-así placa, de acuerdo con el mapa de placa mostrada en la figura 3A.
4. Prepare una placa 5x ⁺ Tl estímulo basado en la CE ₈₀ o ⁺ Tl óptima concentración determina en el apartado 4.
5. Cargar la célula, DMSO y Tl ⁺ placas de estímulo en el FDSS. Establecer un protocolo de dos complemento de modo que 20 l de la concentración de DMSO 2x serie se añade a los pocillos correspondientes de la placa de células que contiene 20 l de tampón de ensayo HBSS. Deje el DMSO sobre las células durante la misma cantidad de tiempo, las células se exponen al vehículo durante una molécula pequeña pantalla. Línea de base Record FluoZin-2 fluorescencia para aal menos 10 segundos antes de añadir 10 l de 5x tampón de Tl ⁺ a cada pocillo de la placa celular. Repetir el experimento en 3 días diferentes para establecer la reproducibilidad de los resultados.
6. El ensayo debe ser tolerante al DMSO concentraciones de al menos 0,1% v / v para una típica pantalla de alto rendimiento en el que los compuestos se ensayaron a una concentración de 10 mM.

6. Determinación de la sensibilidad del ensayo a conocidos moduladores farmacológicos

1. Después de determinar la óptima Tl ⁺ tolerancia concentración de DMSO y del ensayo, los efectos de los conocidos agentes farmacológicamente activos en Kir canal mediada Tl ⁺ flujo deben ser examinados. Esta serie de experimentos se evaluará el ensayo de sensibilidad, la capacidad de los compuestos de orden de rango en función de su potencia, capacidad de clasificar los compuestos en función de su modo de eficacia (por ejemplo, activador, inhibidor), e identificar de buen comportamiento compuestos control que se utilizarán más adelante en el ensayo desarrollo y la pantalla.
2. Plate, colorante de carga y se lavan las células en BD PureCoat amina recubierto con placas de 384-y como se describe anteriormente en la sección 3, dejando 20 l de tampón de ensayo HBSS en cada pocillo. Columna 1 y filas A1-A23 debe contener células que no han sido inducidas con tetraciclina (Figura 4A).
3. Utilice una plataforma automatizada de Bravo Manipulación de líquidos o manual pipetear para preparar una serie de concentraciones de once puntos dilución de moduladores conocidos en tampón de ensayo HBSS. Típicamente, una serie de diluciones de 3 veces que van desde 100 mM a 2 nM se evaluó la actividad en el ensayo. La serie debe estar compuesto a una concentración 2x ​​porque las soluciones en DMSO se diluyó a la mitad en el ensayo final. La serie de dilución debe ser chapada en triplicado, en un polipropileno de 384-así placa, de acuerdo con el mapa de placa mostrada en la figura 4A. Asegúrese de que las diluciones se hacen de tal manera que las concentraciones finales de DMSO son los mismos entre los tratamientos farmacológicos y THA menos n o igual a la concentración de DMSO máxima admisible definido en la sección 5.
4. Prepare una placa 5x ⁺ Tl estímulo basado en la óptima concentración Tl ⁺ indica en el punto 4.
5. Cargue el celular, compuesto y Tl ⁺ placas de estímulo a la FDSS. Establecer un protocolo de dos complemento de modo que la serie 20 l 2x compuesto concentración se añade a los pocillos correspondientes de la placa de células que contiene 20 l de tampón de ensayo HBSS. Añadir los compuestos a la placa de células y se incuba durante un máximo de 20 min. Tenga en cuenta que el tiempo óptimo de incubación para los compuestos para detectar la mejor relación de señal a fondo se puede determinar mediante la ejecución de una serie de experimentos en los que par de diferentes tiempos de incubación son elegidos. Línea de base Record FluoZin-2 fluorescencia durante al menos 10 segundos antes de añadir 10 l de 5x tampón de Tl ⁺ a cada pocillo de la placa celular. Repetir el experimento en 3 días diferentes para establecer la reproducibilidad de los resultados.

_title "> 7. Tablero de Análisis

1. En la siguiente serie de experimentos, la uniformidad y reproducibilidad del ensayo se evaluó utilizando un "tablero de ajedrez" análisis. Típicamente, un inhibidor de control se colocaron en placas en cada pocillo otro de cada columna y fila de una placa de 384-y, como se muestra en la Figura 5A. Para evaluar rigurosamente el ruido en el ensayo, una CE ₈₀ concentración de inhibidor se debe utilizar. DMSO se añadió a los otros pocillos como control de vehículo. Tl ⁺ flujo en DMSO-y células tratadas con fármaco se utiliza para calcular un valor para Z principal, una medida estadística de pozo a pozo variabilidad entre las dos poblaciones de pozos. Z prime se calcula utilizando la fórmula:
   Z prime = 1 - _(p + 3DS 3DS _n) / | + _p significa decir _n |
   donde SD es la desviación estándar, p es el flujo desinhibido y n es completamente inhibida valores de flujo. Un ensayo con valores mayores que o igual a 0,5 Z ', en 3 días separados se considera spto de cribado de alto rendimiento.
2. Plate, colorante de carga y se lavan las células en BD PureCoat amina recubierto con placas de 384-y como se describe anteriormente en la sección 3, dejando 20 l de tampón de ensayo HBSS en cada pocillo. Tenga en cuenta que toda la placa debe ser inducido con tetraciclina.
3. Hacer una placa de compuesto / DMSO al vaso una placa de polipropileno de 384-y usando una pipeta multicanal, 80 l / pocillo de un inhibidor conocido de la canal Kir objetivo en la concentración determinada en la sección 6,5, y 0,1% v / v DMSO vehículo como se muestra en la Figura 5A. Añadir el inhibidor conocido de partida en el pocillo A1 usando el canal multi-pipeta y alternativo para así B2 y así sucesivamente hasta bien B24. Repita este procedimiento con DMSO a partir de B1 bien y así sucesivamente hasta bien A24. El diseño final de la placa debe coincidir con el de un tablero de ajedrez.
4. Prepare una placa estímulo 5x Tl ⁺ basado en la óptima Tl ⁺ indica en el punto 4.
5. Cargar la célula, compuesto y Tl ⁺ estímulo placas en el FDSS. Establecer un protocolo de dos complemento de modo que la serie 20 l 2x compuesto concentración se añade a los pocillos correspondientes de la placa de células que contiene 20 l de tampón de ensayo HBSS. Añadir los compuestos a la placa de células y se incuba durante hasta 20 min a temperatura ambiente. Línea de base Record FluoZin-2 fluorescencia durante al menos 10 segundos antes de añadir 10 l de 5x tampón de Tl ⁺ a cada pocillo de la placa celular. Repetir el experimento en 3 días diferentes para establecer la reproducibilidad de los resultados.

8. Pilot Screen

1. En la etapa final del desarrollo del ensayo, realizar una pantalla de piloto de unos pocos miles de compuestos para evaluar el rendimiento del ensayo, bajo condiciones que serán utilizados eventualmente en la gran escala de alto rendimiento pantalla.
2. Plate, colorante de carga y se lavan las células en BD PureCoat amina placas recubiertas con 384-y como se describe anteriormente en la sección 3), dejando 20 l de tampón de ensayo HBSS en cada pocillo.Tenga en cuenta que toda la placa deben ser cultivadas durante la noche con tetraciclina para inducir la expresión Kir canal.
3. Seleccione aproximadamente 2.000 a 3.000 compuestos estructuralmente diferentes a probar. A menudo es apropiado y conveniente de usar colecciones de compuestos con actividades conocidas potencialmente enriquecidas en moduladores del canal iónico. Tales colecciones incluyen la Colección Spectrum (Microsource) y la colección LOPAC (Sigma). Además, es prudente incluir moduladores conocidos de la Kir de interés en la pantalla del piloto. Idealmente, estos compuestos se añaden a los pocillos en un modo ciego con el fin de permitir un análisis imparcial de los métodos descritos más adelante golpe de picking. Preparar los compuestos en placas de polipropileno de 384-y placas (de destino) usando un manipulador líquido Echo Labcyte o herramienta pasador adecuado para transferir un volumen apropiado de los compuestos seleccionados en DMSO a partir de la colección MLPCN (placas de origen) a las placas de destino Tenga en cuenta que los compuestos de ensayo son sólo en las columnas 3-22;En cada bien otra de las columnas 1, 2, 23, 24 añadir un conocido inhibidor a una concentración conocida para inhibir completamente la Kir como se determina en la sección 7. En los demás pocillos de las columnas 1, 2, 23, 24 y añadir el volumen apropiado de DMSO para producir DMSO-emparejados concentración controles del vehículo. Diluir todos los pocillos con tampón de ensayo utilizando el Combi Multidrop. Típicamente los compuestos de ensayo será de 20 mM, 2-veces por encima de su concentración de cribado de destino.
4. Hacer Tl ⁺ placas de estímulo basado en la óptima concentración de Tl ⁺ indica en el punto 4.
5. Ejecutar la pantalla del piloto. Tenga cuidado de escalonar las medidas de ejecución del protocolo para mantener la sincronización constante entre las placas en el largo piloto de cribado.
6. Una vez que la pantalla piloto se ha completado, analizar los pocillos de tablero de ajedrez de las columnas 1, 2, 23 y 24 utilizando la ecuación Z-prime. Inspeccionar las placas que muestran Z-prime valores de menos de 0,5 para determinar la fuente de la escasa separación de poblaciones de control. Golpea ¿pueden los be seleccionadas usando un número de métodos. Para pantallas de piloto es común para calcular la media y la desviación estándar de la población de control del vehículo y recoger los accesos basado en pozos productores valores> / = 3 desviaciones estándar de la media de los controles del vehículo.
7. Después de la cosecha éxito, compruebe de nuevo los accesos seleccionados por duplicado en 2 juegos de placas. Un conjunto de placas contiene la celda Kir estable en ausencia de tetraciclina y el otro contiene la línea celular estable Kir en presencia de tetraciclina. Muestras que retest positiva en al menos una de las dos placas retest y no muestran una actividad significativa en las placas no inducidas pueden ser considerados verificadas accesos. Examine la lista de resultados verificados para determinar cuántas de las muestras "ocultos" de control fueron detectados. Si no se detectan los controles de la pantalla piloto indica la necesidad de una mayor optimización de los parámetros de selección o golpe picking.

Representative Results

El uso de un sistema de expresión inducible por tetraciclina proporciona un conveniente control interno para distinguir Tl ⁺ flujo a través de las vías endógenas y el canal Kir de interés. Figura 1 muestra algunos ejemplos de los mapas de galvanoplastia celulares utilizadas en diferentes tipos de experimentos. Las posiciones de los pocillos que contienen células no inducidas o tetraciclina inducida-se indican con diferentes colores. Figura 2A muestra el mapa de placa de fuente utilizado para determinar la concentración óptima Tl ⁺ para el desarrollo y ensayo de cribado de compuestos. El gradiente de color representa la serie de dilución de 3 veces que van desde 100% a 0,002% Tl ^+. Un mapa representante intensidad de fluorescencia se muestra en la Figura 2B, con frío a caliente colores que indican bajo-a-alto Tl ⁺ valores de flujo, respectivamente. El mapa de placas de células se muestra en la Figura 1C se utilizó para este experimento. Un ajuste de una función logística de 4 parámetros a tél Tl ⁺ CRC (Figura 2C) se utiliza para determinar un valor de CE ₈₀ 15% Tl ^+. Figura 3A muestra el mapa de placa de fuente utilizado para determinar la tolerancia de DMSO de un ensayo. Las columnas 1 y 24 contienen sólo tampón de ensayo, mientras que el gradiente de color indica la serie de dilución de 2 veces que va desde 10% a 0,01% de DMSO. Un mapa representante intensidad de fluorescencia se muestra en la Figura 3B, con bajos valores de flujo ⁺ Tl indicados con un azul más oscuro. El mapa de placas de células se muestra en la Figura 1B se utilizó en este experimento. Los medios TL ⁺ valores de flujo registrados a partir de los pocillos que contienen las concentraciones indicadas de DMSO se resumen en la Figura 3C. Los datos se representan como el porcentaje de Tl ⁺ flujo registrada en ausencia de DMSO. Para este particular canal Kir, DMSO concentraciones de hasta 2,5% no tuvo efecto en Tl ⁺ flujo y por lo tanto pueden ser utilizados en experimentos. Fig.ure 4A muestra el mapa de placa de fuente utilizado para establecer curvas concentración-respuesta para los inhibidores conocidos de un canal Kir. Cada compuesto se indica con un color diferente y se sembraron típicamente como una serie de dilución de 3 veces. Un mapa representante intensidad de fluorescencia se muestra en la Figura 4B. El mapa de placas de células se muestra en la Figura 1C se utilizó para este experimento. Un experimento representativo que muestra una inhibición dosis dependiente de Tl ⁺ flujo por un inhibidor se muestra en la Figura 4C. La consistencia de un ensayo se determina en los llamados "tablero de ajedrez" ensayos, que se resumen en la Figura 5. En el mapa de placa de fuente que se muestra en la Figura 5A, una concentración máximamente efectiva de un inhibidor o un 0,1% de DMSO como un control de vehículo se sembraron en placas de pocillos alterna. Figura 5B muestra un mapa representativo intensidad de fluorescencia. Un gráfico de dispersión del flujo pico Tl ⁺ grabado de individuosal pocillos se representa en la Figura 5C. Los valores de fluorescencia media se indican con línea continua, mientras que 3 desviaciones estándar se indican con una línea de puntos. El primer valor de Z, una medida estadística de lo bien que se separaron las dos poblaciones de células se separó, se calcula para esta placa es de 0,75, lo que está muy por encima del umbral de 0,5 se requiere para cribado de alto rendimiento.

Figura 1. Mapas célula de recubrimiento utilizados para TL ⁺ de desarrollo de flujo ensayo. (A) Mapa de célula de recubrimiento utilizar para determinar el ensayo óptimo Tl ⁺ concentración. Los pocillos de la columna 1, filas A1-23, K1-12, F13-23 y 23-P13 contienen células no inducidas (-Tet). Los pocillos restantes contienen las células que fueron tratados con tetraciclina (+ Tet) para inducir la expresión Kir canal. (B) Cell plamapa te utilizan para determinar la tolerancia DMSO ensayo y realizar análisis de tablero de ajedrez. Tenga en cuenta que todos los pozos son tratados con tetraciclina (+ Tet). (C) Mapa de la célula placa que se utiliza para determinar la sensibilidad del ensayo a conocidos moduladores farmacológicos. Los pocillos de la columna 1 y la fila A1-23 contienen células no inducidas (-Tet). Los pozos restantes contienen las células que fueron tratados con tetraciclina (Tet +). Haga clic aquí para ampliar la cifra .

Figura 2. Determinación de ensayo óptimo Tl ⁺ concentración. (A) mapa Fuente placa que se utiliza para determinar la concentración de Tl ⁺ que evoca aproximadamente 80% de la máxima FluoZin-2 fluorescencia aumento (CE _80). Fila A y columns 1 y 24 (amarillo) contienen una concentración de 5 x 12 mm LT ₂ SO _4. Las filas restantes contienen una serie de diluciones de 3 veces que van desde 12 mM (100%) a 0,024 mm (0,002%) Tl ₂ SO _4. La serie se repite en las columnas 2-12 y 13-23. (B) mapa que representa la intensidad de fluorescencia Tl ⁺ flujo para cada pocillo aproximadamente 1 min después de la adición Tl ^+. La barra de pseudo-color de la derecha indica el grado de Tl ⁺ flujo, con colores más fríos y más calientes que representan valores de flujo bajo y alto, respectivamente. Tenga en cuenta que los colores más frescos en la columna 1, filas A1-23, K1-12, F13-23 y 23-P13 son debido a la baja Tl ⁺ flujo en células no inducidas. Los pocillos restantes, incluyendo aquellos en la columna 24, contiene las células que fueron tratados con tetraciclina para inducir la expresión Kir canal (véase el mapa célula de recubrimiento en la Figura 1A). (C) Media ± SEM CRC para TL ^{+-dependientes} de cambios en la fluorescencia (n = 3). Ajuste de una función logística de cuatro parámetrosción de los datos se obtuvo un valor de IC ₈₀ Tl 15% ^+. Haga clic aquí para ampliar la cifra .

Figura 3. Ensayo de tolerancia al DMSO. (A) Mapa de Fuente placa utilizada para determinar la tolerancia de ensayo para DMSO. Las columnas 1 y 24 contienen tampón HBSS ensayo. Las filas contienen una concentración 2x ​​de una serie de diluciones de 2 veces DMSO que van desde 10% a 0,01% v / v (B) Representante mapa que representa la intensidad de fluorescencia Tl ⁺ flujo en cada pozo registró aproximadamente 1 minuto después de Tl adición ^+. La barra de pseudo-color de la derecha indica el grado de Tl ⁺ flujo, con colores más fríos y más calientes que representan valores de flujo bajo y alto, respectivamente. (C) Media ±, SEM (n = 9) ⁺ Tl flujo normalizado a la registrada en presencia de tampón de ensayo HBSS solo. Haga clic aquí para ampliar la cifra .

Figura 4. Ensayo de sensibilidad a los conocidos compuestos farmacológicamente activos. (A) mapa Fuente placa que se utiliza para evaluar la actividad de conocidos compuestos farmacológicamente activos en el ensayo de flujo Tl ^+. Fila A y columnas 1 y 24 contienen 0,1% v / v de DMSO. La disposición de la placa permite la prueba de 10 compuestos por triplicado en las columnas 2-23. Las filas contienen una concentración 2x de una serie de diluciones de 3 veces en serie de compuestos que van desde 100 mM a 2 nM (B) mapa que representa la intensidad de fluorescencia Tl ⁺ flujo para cada pocillo approximately 1 min después de Tl ⁺ adición. La barra de pseudo-color de la derecha indica el grado de Tl ⁺ flujo, con colores más fríos y más calientes que representan valores de flujo bajo y alto, respectivamente. Tenga en cuenta que los pozos de la columna 1 y la fila A1-23 contienen células no inducidas. Los pocillos restantes contienen tetraciclina inducida por las células que expresan el canal Kir de interés (véase el mapa de celdas placa en la Figura 1C). (C) Representante Tl ^+-inducida por cambios en FluoZin-2 fluorescencia en los pozos pre-tratadas con la concentración indicada de un inhibidor de la canal Kir. Haga clic aquí para ampliar la cifra .

Figura 5. Determinación de la aptitud de ensayo para HTS. (A) Placa Fuentemapa utilizado para evaluar la variabilidad bien a pocillo entre los pocillos que contenían 0,1% de DMSO (vehículo) o una concentración máximamente efectiva de un inhibidor conocido. (B) mapa que representa la intensidad de fluorescencia Tl ⁺ flujo en cada pocillo aproximadamente 1 min después de la adición Tl ^+. Tenga en cuenta que todos los pocillos contienen tetraciclina inducida por las células que expresan el canal Kir de interés (ver mapa de celdas placa en la Figura 1B). (C) parcela Representante de dispersión de los valores de fluorescencia en estado estacionario obtenida de pozos de vehículos-o tratada inhibidor. La amplitud media de fluorescencia de cada población de la muestra se indica con una línea sólida, 3 desviaciones estándar de la media se muestra con una línea discontinua, y las muestras alternas para vehículo (VHL) y el inhibidor (INH) se representan como puntos individuales. Haga clic aquí para ampliar la cifra .

Discussion

Tratamiento de datos: Una vez recogidos los datos, un paso común en el análisis consiste en la normalización de la respuesta de fluorescencia de cada pocillo, F, a su valor inicial al comienzo del experimento, F _0. Esto se conoce comúnmente como la "relación estática" y simbolizado "F / F ^_0". En los casos en que F ₀ está dominado por el colorante indicador de la relación de operación estática sustancialmente para corregir muchos factores tales como desuniformidades en la iluminación, la recogida de la señal, y el número de células. En los casos en que la señal es débil o colorante fluorescencia de fondo o reflexiones en el sistema son altos, la relación estática no será eficaz a menos que el fondo puede ser apropiado tratar antes de calcular la relación estática. Después de la normalización de datos, que es típico para reducir la forma de onda de fluorescencia en un único valor que se utilizará para cuantificar la actividad y recoger muestras. Más comúnmente, esto será realizado por ajuste de los datospuntos en los 10 segundos después de la adición de Tl ⁺ para obtener una pendiente inicial de la fluorescencia incremento evocado. Para picking hit, un método popular es asumir que la gran mayoría de los compuestos en la población de ensayo son inactivos (la hipótesis nula está en vigor). A media y la desviación estándar se calcula para la población de prueba y los accesos son seleccionados que son tres desviaciones estándar de la media.

Dividir el Protocolo para incubaciones largas compuestos: Para la detección de inhibidores de los canales Kir, en particular aquellos que actúan en sitios de unión intracelular, que puede ser valioso para incubar las células con compuestos de prueba durante un período prolongado de tiempo (por ejemplo, 20 min) antes de la adición de Tl ^+. Si los compuestos se añaden "desconectado" antes de que el ensayo se introduce en el lector de placas, las propiedades ópticas de los compuestos de ensayo (por ejemplo, fluorescencia) no puede ser reconocida fácilmente y puede afectar negativamente comúnmente utilizadonormalización de datos enfoques como la "relación estática" F / F ₀ se ha descrito anteriormente dando lugar a falsos positivos y / o negativos falsos. Para evitar este problema al mismo tiempo que se evita tener que mantener una placa de ensayo en un lector para un largo período de incubación, una solución consiste en utilizar un "doble lectura" protocolo. La primera lectura es una breve (por ejemplo 30 segundos) experimento en el que se añade el compuesto después de 10 segundos para permitir la captura de la adición de pre-compuesto F ₀ y para evaluar los efectos de los compuestos 'ópticos en el sistema. Después la placa se retira del lector y se incubaron durante el período deseado y regresó al lector para la adición de talio. Después de que tanto las lecturas se han completado, la primera lectura F ₀ se puede utilizar para normalizar los datos de la segunda lectura evitando así muchos problemas asociados con la adición de compuestos "fuera de línea" al tiempo que permite la oportunidad de mantener el lector ocupado recogida de datos mejorando así el rendimiento de detección. El método read dos es más fácil implemle dio cuando se utiliza un sistema de detección automatizada. Es importante destacar que el enfoque de leer dos no eliminará los problemas causados ​​por los compuestos fluorescentes que saturan el detector y / o causar lectura de artefactos en la cámara CCD.

Configuración de un ensayo para activadores: No todos los canales KIR son máximamente activa bajo condiciones de reposo, por lo que puede ser posible diseñar un ensayo que puede detectar pequeñas moléculas activadores. En estos casos, la selección de una concentración de CE ₈₀ Tl ⁺ no puede proporcionar suficiente "espacio libre" para el ensayo para detectar con fiabilidad activadores. Así, uno puede elegir usar una concentración más baja de Tl ⁺ (por ejemplo, CE ₂₀₎ en ensayos de activadores. En algunos casos, el ensayo puede mostrar variabilidad suficiente bajo como para permitir el uso de una concentración de CE ₅₀ Tl ⁺ y todavía proporcionar resolución adecuada de ambos activan e inhiben poblaciones de canal. En este caso, el ensayo de may se llevó a cabo en doble activador / inhibidor modo. Cuando está disponible, un conocido activador se puede utilizar para ayudar a determinar la concentración apropiada Tl ⁺ para maximizar las posibilidades de descubrir activadores de los canales.

Limitaciones: Existen algunas limitaciones que deben tenerse en cuenta durante el desarrollo y ejecución de una Tl ⁺ de flujo de alto rendimiento basado en pantalla. Por ejemplo, el ensayo se basa en una medida indirecta de la actividad del canal Kir usando una sonda fluorescente cuyas propiedades ópticas pueden ser directamente afectada por compuestos en una pantalla. Por lo tanto, las observaciones importantes de Tl ⁺ experimentos de flujo debe ser confirmado mediante voltaje clamp electrofisiología, que se considera el "gold-standard" método para la farmacología canal iónico. Además, las pequeñas moléculas pueden tener efectos directos sobre endógenos TL ⁺ vías de flujo expresados ​​en células HEK-293, que conducen a la identificación de falsos positivos hits. La tetraciclinae-inducible sistema es particularmente útil para distinguir falsos positivos éxitos de canal Kir-dirigida moduladores porque los accesos puede ser defendido rápidamente en las células no inducidas por sus efectos sobre las vías endógenas. Finalmente, la baja solubilidad de Tl ⁺ en tampones que contienen cloruro de limitar la concentración de Tl ⁺ que se puede utilizar en un ensayo, que requiere el uso de un tampón no fisiológico Tl ⁺ estímulo que puede aumentar la farmacología de la diana ^11. La compatibilidad de los buffers diferentes con el objetivo de interés deben ser cuidadosamente evaluados durante el desarrollo del ensayo. Esto se puede hacer mediante el establecimiento de CRC para los moduladores conocidos usando diferentes tampones de estímulo Tl ⁺ y la elección de las condiciones en las que la farmacología más se asemeje a la observada usando tampones fisiológicos.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
pcDNA5/TO	Invitrogen	V1033-20	Tetracycline-inducible expression vector
T-REx-HEK293 cells	Invitrogen	R71007	Tetracycline-inducible cell line
Lipofectamine LTX/Plus Reagent	Invitrogen	15338100	Transfection reagent
FBS	ATLANTA Biologicals	S11550	Cell culture media
DMEM	Invitrogen	11965	Cell culture media
Hygromycin B	Invitrogen	10687-010	Cell culture media
Blasticidin S	Invitrogen	R210-01	Cell culture media
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140	Cell culture media
HBSS-divalent free	Mediatech	21022CV	Cell washing
Trypsin-0.25%	Mediatech	25053CI	Cell dissociation
Tetracycline-HCl	Sigma	T9823	Induction reagent
Dialyzed FBS	ATLANTA Biologicals	S12650	Plating media
FluoZin-2	Invitrogen	F24189	Fluorescent dye
Pluronic F-127	Invitrogen	P-3000MP	Dye loading
HBSS	Invitrogen	14175	Assay buffer
HEPES	Invitrogen	15630	Assay buffer
NaHCO3	Sigma	S6297	Tl+ stimulus buffer
MgSO4	Sigma	M2643	Tl+ stimulus buffer
CaSO4∙2H2O	Sigma	C3771	Tl+ stimulus buffer
D-Glucose	Sigma	G7528	Tl+ stimulus buffer
Thallium sulfate	Aldrich	204625	Tl+ stimulus buffer
HEPES	Sigma	H4034	Tl+ stimulus buffer
DMSO	Sigma	D4540	Solvent
Eight-channel electronic pipettor	Biohit	E300	Cell plating in 384-well plates
BD PureCoat amine-coated 384-well plates	BD Biosciences	356719	Assay microplates
Echo qualified 384-Well polypropylene microplate (384PP)	Labcyte	P-05525	Compound source microplates
384-well polypropylene microplates	Greiner Bio-One	781280
Multidrop Combi reagent dispenser	Thermo Scientific	5840300
ELx405 microplate washer	BioTek	ELx405HT	Automated cell washing
Echo liquid handler	Labcyte	Labcyte Echo 550
Bravo automated liquid handling platform	Agilent Technologies	Standard model
Hamamatsu FDSS 6000	Hamamatsu		Kinetic imaging plate reader
Table 1. List of Materials and Reagents.