High-throughput screening for små-molekyle modulatorer af indadgående Ensretter kaliumkanaler

Summary

Metoder til udvikling og validering af en kvantitativ fluorescens assay til måling af aktiviteten af ​​indadgående ensretter kalium (Kir) kanaler til high-throughput sammensatte screening er præsenteret.

Abstract

Specifikke medlemmer af aktiv ensretter kalium (Kir) kanal familien postuleres lægemiddelmål for en række lidelser, herunder hypertension, atrieflimren, og smerte ^1,2. For det meste er der dog fremskridt i retning af at forstå deres terapeutiske potentiale eller endda basale fysiologiske funktioner er blevet bremset på grund af manglen på gode farmakologiske værktøjer. Faktisk har den molekylære farmakologi indad ensretter familien haltet langt bagefter S4 superfamilie af spændingsstyrede kalium (KV) kanaler, hvor en række nanomolær affinitet og højselektive peptid toxin modulatorer er blevet opdaget ^3. The bigift toksin tertiapin og dets derivater er kraftige inhibitorer af Kir1.1 og Kir3 kanaler ^4,5, men peptider er af begrænset nytte terapeutisk såvel som eksperimentelt på grund af deres antigene egenskaber og ringe biotilgængelighed, metaboliske stabilitet og væv penetrans. Udviklingen af ​​potenteog selektive små molekyler prober med forbedrede farmakologiske egenskaber vil være en nøgle til fuldt ud at forstå fysiologi og terapeutiske potentiale af Kir-kanaler.

The Molecular Biblioteker Probes Production Center Network (MLPCN) støttet af National Institutes of Health (NIH) fælles fond har skabt muligheder for akademiske forskere at indlede probe opdagelse kampagner for molekylære mål og signalveje, der har behov for bedre farmakologi ^6. Den MLPCN giver forskere adgang til industri-skala screening centre og medicinsk kemi og informatik støtte til at udvikle små molekyler sonder at belyse funktionen af ​​gener og gen netværk. Det kritiske trin i at få adgang til MLPCN er udviklingen af ​​en robust mål-eller pathwaygen-specifikke assay, der er modtagelig for high-throughput screening (HTS).

Her beskriver vi hvordan man udvikler en fluorescens-baseret thallium (Tl ⁺⁾ flux ASSAy af Kir kanalfunktion til high-throughput screening forbindelse ^7,8,9,10. Assayet er baseret på permeabiliteten af K ^+-kanal pore til K ⁺ congener Tl ^+. Et kommercielt tilgængeligt fluorescerende Tl ⁺ rapportør-farvestof anvendes til påvisning transmembrane flux af Tl ⁺ gennem poren. Der er mindst tre kommercielt tilgængelige farvestoffer, som er egnede til Tl ⁺ flux assays: BTC, FluoZin-2, og FluxOR ^7,8. Denne protokol beskriver assay udvikling ved hjælp FluoZin-2. Selvom oprindeligt udviklet og markedsført som en zink-indikator, FluoZin-2 udviser en robust og dosisafhængig stigning i fluorescensemission ved Tl ⁺ binding. Vi begyndte at arbejde med FluoZin-2 før FluxOR var tilgængelig ^7,8 og har fortsat med at gøre det ^9,10. Men trinene i assay udvikling er det væsentlige identiske for alle tre farvestoffer, og brugerne bør afgøre, hvilke farve der er mest hensigtsmæssig for deres specifikke needs. Vi diskuterer også assayet s benchmarks, som skal opfyldes for at komme i betragtning til optagelse i MLPCN. Da Tl ⁺ let gennemtrænger fleste K ^+-kanaler, bør assayet kunne tilpasses til de fleste K ^+-kanal mål.

Protocol

1. Generering af stabile Polyklonale cellelinier

1. Etableringen af ​​en høj kvalitet stabil cellelinie, der udtrykker Kir kanal af interesse er et vigtigt første skridt mod at udvikle en robust high-throughput screening assay. Konstitutiv K ^+-kanal overekspression kan føre til aktivering af celledød veje, stabil cellelinje degeneration og tab af analysens ydeevne. For at undgå disse potentielle problemer og tilvejebringe en bekvem intern kontrol til assay udvikling (se nedenfor), er en tetracyklin-inducerbare ekspressionssystem anbefales ^8.
2. Kultur af parentale T-Rex-HEK293-celler under anvendelse af standardteknikker i B-medium (DMEM dyrkningsmedium indeholdende 10% FBS, 50 U / ml penicillin, 50 ug / ml streptomycin og 5 ug / ml blasticidin S). Benytte tidlige passage-celler (f.eks 3-4 passager da optøning fra flydende nitrogen lagring) til transfektion og stabil klon udvælgelse.
3. Plate 4 millioner T-Rex-HEK293 celler i en⁷⁵ cm2 kolbe, således at kolben er omkring 80% sammenflydende den følgende dag. Kultur natten over i en _5% CO2 inkubator ved 37 ° C.
4. Transficere cellerne under anvendelse af 10 til 15 ug pcDNA5/TO-Kir DNA og Lipofectamin LTX / Plus reagens ifølge producentens protokol. Efter 5 timer udskifte transfektion medium med B-medium.
5. 24 timer efter transfektionen, erstatte B-medium med B-medium indeholdende 250 ug / ml Hygromycin (BH-medium) for at begynde en stabil klon valg. Feed cellerne hver 2-3 dag med frisk BH-medium.
6. Mere end 90% af cellerne skulle dø i løbet af de næste 7 dage og efterlader små kolonier af stabilt transficerede celler. Lad kolonierne til at vokse i yderligere 10-14 dage før opsplitning til en 175 cm ² kolbe til ekspansion.
7. Til kryopræservering, 3 fryse x 10 ⁶ celler / ml i medier indeholdende 45% konditioneret BH-medium, 45% antibiotikum-frit, serumholdigt DMEM og 10% DMSO. Fryscellerne natten over ved -80 ° C i en celle frysning beholder og derefter flytte til flydende nitrogen til langtidsopbevaring. Optø celler fra flydende nitrogen under anvendelse Invitrogen anbefalede protokol. Bemærk, at levedygtigheden af ​​cellerne bliver lavere, hvis de er frosne fra en kolbe, der er større end 75% konfluente på tidspunktet for behandling.

2. Generering af stabile monoklonale cellelinier

1. Vask et sub-sammenflydende 75 cm ² kolbe af stabile polyklonale celler med divalent-fri HBSS. Tilsættes 1 ml trypsin og inkuberes i 3-5 min i en _5% CO2 inkubator ved 37 ° C. Der tilsættes 5 ml af BH-medium til kolben for at inhibere trypsinaktivitet og tritureres gentagne gange (fx 5 gange) til fuldt ud at dissociere cellerne. Kontrollér omhyggeligt cellerne under mikroskop for at sikre, at suspensionen består næsten udelukkende af enkeltceller. Dette vil øge sandsynligheden for opnåelse af monoklonale cellelinier.
2. Bestemme celletætheden og fortyndsuspensionen til en koncentration på 0,7 celler pr 20 ul. Under anvendelse af en multikanals pipette, pipette 20 pi af cellesuspensionen i hver brønd på BD PureCoat amin-overtrukne (eller tilsvarende poly-D-lysin-overtrukne) 384-brøndsplader. I princippet bør 70% af brønde modtager en celle med disse plating betingelser. Således bør en 384-brøndsplade indeholde mere end 200 kloner at analysere. Fortsætte dyrkning af cellerne i en _5% CO2 inkubator ved 37 ° C.
3. Efter en uge, inspicere pladerne under et mikroskop for brønde indeholdende enkeltkolonier. Bemærk deres position på låget med en permanent markør for fremtidig reference. Vær sikker på også notere og udelukke brønde, der indeholder flere kolonier. Disse kan lettest genkendes af forekomsten af ​​kolonier vokser fra flere sider af brønd. Vær opmærksom på at fordampning tendens til at forekomme hurtigere fra brønde nær kanten af ​​pladen. Tilføj BH-medium til brønde, hvor stor fordampning har fundet sted. Ellers er det ikke nødvendigt to foder cellerne.
4. Overvåge brøndene hyppigere i de næste 7-10 dage. Cellerne vil være klar til at spalte, når brøndene af interesse er mindst 50% sammenflydende.
5. Opdele cellerne at duplikere 384-brøndsplader, en plade til analyse med Tl ⁺ flux og den anden for at fortsætte de monoklonale linjer i kultur. Suges mediet fra brøndene indeholdende cellelinier af interesse. Vask cellerne med divalent-fri HBSS tilsættes 20 ul trypsin til hver brønd og overfører pladen til en 37 ° C inkubator i 15-20 min. Efter at bevæge pladen tilbage til cellekulturen hætte, tilsættes 20 pi BH-medium til hver brønd og tritureres adskillige gange for at dissociere cellerne. Inspicere brønde under et mikroskop for at sikre, at cellerne er fuldt dissocieres. Dette kan kræve flere runder af pipettering, da cellerne vil være tæt vedhæftende. Når cellerne dissocieres, overføres 10 ul af hver cellesuspension til dobbelte brønde i en ny BD PureCoat amin-coated 384-brøndsplade. Sørg for at notere forholdet mellem kilden godt og duplikere destination brønde, således at de kloner udviser robust Kir-kanal aktivitet (se nedenfor) kan spores tilbage til den oprindelige brønd. Der tilsættes 20 ul BH-medium til den oprindelige kilde og at fodre de resterende celler og fortsætte dem i kultur i _5% CO2 inkubator ved 37 ° C.
6. Tillade de celler i destinationen pladen til at klæbe og vokse i op til en uge. Når de fleste af klonerne når mindst 50% konfluens, kan de vurderes for Kir kanalaktivitet ved hjælp af Tl ⁺ flux assay beskrevet nedenfor.
7. Dagen før assayet aspireres dyrkningsmediet og erstatte den med BH medium indeholdende 10% dialyseret FBS. Dette forhindrer utilsigtet kanal udtryk, der kunne opstå ved tetracyclin forurenet serum. Inducere Kir kanal ekspression i kun én af de to brønde for hver klon ved at medtage 1 ug / ml tetracyklin. Den duplikere uinducerede godt vil tjene som et"Baggrund" kontrol. Udføre Tl ⁺ flux assays som beskrevet i det følgende.

3. General Tl ⁺ Flux Analyseprocedure

1. Dagen før en Tl ⁺ flux eksperiment, dissociere cellerne og kvantificere densiteten af cellesuspensionen, som beskrevet i afsnit 2.1 og 2.2. Plate 20000 monoklonale celler transficeres stabilt med en Kir kanal gen af ​​interesse i hver brønd på en BD PureCoat amin-coated 384-brønds plade under anvendelse af en Thermo Multidrop Combi eller en multikanals pipette. Brug BH medium indeholdende 10% dialyseret FBS til udpladning. Bemærk, at nogle celler vil blive dyrket natten over med 1 ug / ml tetracyclin til at inducere Kir kanal ekspression, mens andre ikke vil. Placeringen af inducerede og ikke-inducerede celler vil være forskellige for hver type af forsøg og er vist i figur 1..
2. Den næste dag, inspicere pladerne under et mikroskop for at sikre, at cellerne er adhærerende og jævnt fordelt over bundenaf brøndene. Brøndene skal være 80-90% sammenflydende.
3. Bruge en ELx405 Microplate Washer at erstatte cellekulturmedium med 20 pi per brønd HBSS assaybuffer indeholdende 20 mM HEPES og pufret til pH 7,3 med NaOH. Alternativt kan man anvende et "flick og slam"-metode, hvor pladen vendes om og snappes ned kraftigt at udstøde mediet i en affaldsbeholder, og derefter duppet på stablede papirhåndklæder for at fjerne de resterende medier. Tilføj straks tilbage HBSS assaybuffer til pladen for at forhindre cellerne i at tørrende.
4. Forbered FluoZin-2, AM farvestof loading løsning. Efter en kort centrifugering af røret, opløses 50 ug FluoZin-2 pulver i 100 gl vandfrit DMSO. På dette tidspunkt kan prøver af 1.000 x stamopløsning opbevares ved -20 ° C til senere brug. Når klar til brug, tilsættes 50 pi af en 20% vægt per volumen Pluronic F-127/DMSO løsning på farvestoffet og blandes med forsigtig pipettering. Må ikke nedfryses farvestoffet gang Pluronic F-127 er blevet tilføjet, somlav temperatur kan forårsage det overfladeaktive middel for at udfælde fra opløsningen. Tilsæt 150 pi volumen FluoZin-2, AM/Pluronic-F127 til 100 ml HBSS assaypuffer og blandes forsigtigt for at gøre farvestoffet loadingpufferen. Under anvendelse af en Multidrop Combi eller multi-channel pipette, tilsættes 20 pi farvestof loading buffer til hver brønd, der allerede indeholder 20 ul HBSS assaypuffer. Inkuberes cellerne ved stuetemperatur i cirka 1 time (typisk inkubation blev udført i mørke, selv om der er noget direkte bevis for, at det er nødvendigt).
5. Mens cellerne lægger med farvestof, forberede en Tl ⁺ stimulus plade. Frisk opløses 0,5 g natriumbicarbonat i 50 ml 5x Tl ⁺ stimulus puffer indeholdende 1 mM magnesiumsulfat, 1,8 mM calciumsulfat, 5 mM glucose, 10 mM HEPES og 12 mM Tl ⁺ sulfat. Alternativt kan natriumbicarbonat erstattes med natriumgluconat, hvis for eksempel, skal opløsningens pH holdes inden for et meget snævert område og tab af kuldioxider en bekymring. Sæt hætte på tuben tæt at begrænse udslip af carbondioxid og vend adskillige gange, indtil natriumbicarbonat går i opløsning. Ved anvendelse af en multikanal-pipette, 50 ul af denne opløsning tilsættes til hver brønd af en polypropylen 384-brøndsplade (tabel 1).
6. Efter at cellerne er blevet fyldt med FluoZin-2, AM, vaskes pladerne med en ELx405 Microplate Washer eller ved hjælp af "flick og slam" metoden, som beskrevet ovenfor i afsnit 3.3. Afhængigt af typen af Tl ⁺ flux forsøg skal udføres, igen tilsættes 20 ul eller 40 ul HBSS assaybuffer til hver brønd. Pladerne er nu klar til forsøg.
7. Cellen og Tl ⁺ pladerne i en Hamamatsu Functional Drug Screening System (FDSS) eller tilsvarende kinetisk imaging pladeaflæser med integrerede væskedispensering kapaciteter. Anvende passende filtre til fluorescein / fluorescein-baserede farvestoffer, såsom Fluo-4.
8. Opsæt en enkelt-add protokol, således at 10 pi den 5x Tl ⁺serien sættes til de tilsvarende brønde i cellen pladen indeholdende 40 ul HBSS assaypuffer. Optag basisliniefluorescensen på en 1 Hz samplingfrekvens for mindst 10 sek. Den well-to-godt fluorescens bør være ensartede og stabile hen over pladen, når optimal celle plating, vask og farvestof belastningsforhold er etableret. En integreret 384-kanals pipette anvendes til samtidigt tilføje Tl ⁺ stimulus buffer til hver brønd.
9. Dokumentationen i mindst 2 minutter, således at hastigheden og toppen af Tl ^+-inducerede stigning i fluorescens er fastholdt til off-line-analyse.

4. Bestemmelse af Optimal Tl + Koncentration

1. Tl ⁺ let gennemtrænger mest aktiv ensretter K ^+-kanaler. For at sikre at Tl ^{+-koncentrationer} ikke overstiger det dynamiske område for Tl ⁺ reporter dye FluoZin-2, bør man empirisk bestemme den optimale Tl ^{+-koncentrationen,} der skal anvendes i en høj-throughput skærmen. Vi anbefaler en Tl ^{+-koncentration,} der fremkalder 80% af den maksimale fluorescens respons (EF ₈₀₎ under betingelser, hvor kanalen er maksimalt aktiveret.
2. Plade, farvestof belastning og vask cellerne i BD PureCoat amin-coatede eller tilsvarende poly-D-lysin-coatede 384-brøndsplader som beskrevet ovenfor i afsnit 3, hvilket efterlader 40 ul HBSS assaybuffer i hver brønd. Som vist i pladen kortet i figur 1A, kolonne 1 og rækker A1-A23 bør indeholde celler, der ikke er induceret med tetracyclin og derfor ikke udtrykker Kir-kanal af interesse. De FluoZin-2 fluorescenssignaler fra de ikke-inducerede brønde vil blive anvendt til at bestemme niveauet af Tl ⁺ flux gennem endogene veje, såsom Na ⁺ - K ^+-ATPase pumpe og spændingsfølsomme K ^+-kanaler, som normalt udtrykkes i HEK- 293-celler.
3. Brug en Agilent Bravo Automated Væskehåndtering Platform eller manuel pipettering at udarbejde enelleve punkt Tl ^{+-koncentration} fortyndingsrækken i HBSS assaypuffer. Typisk er en 3-fold seriefortynding serie i området fra 100% til 0,002% Tl ⁺ evalueret i assayet. Serien bør bestå i en 5x koncentration, fordi de Tl ^+-løsninger vil blive fortyndet 1:5 i den endelige analyse. Forbered fortyndingsrække ved fortynding af standard 5x Tl ⁺ puffer beskrevet i afsnit 3 med en 5x Tl ^+-fri puffer indeholdende 1 mM magnesiumsulfat, 1,8 mM calciumsulfat, 5 mM glucose og 10 mM HEPES. Igen frisk opløses 0,5 g natriumbicarbonat i 50 ml af den endelige Tl ⁺ buffer umiddelbart før udpladning i et polypropylen 384-brøndsplade ifølge pladen kortet vist i figur 2A.
4. Indlæs cellen og TL ⁺ stimulus plader i FDSS. Opsæt en enkelt-add protokol, således at 10 pi den 5x Tl ⁺ series er tilføjet til de tilsvarende brønde i cellen plade indeholdende 40 pi HBSS assaybuffer. Record baseline FluoZin-2 fluorescens i 10 sekunder før tilsætning af Tl ⁺ til pladen. Gentag forsøget på 3 forskellige dage for at fastslå reproducerbarheden af ​​resultaterne.

5. Bestemmelse af assayfølsomhed til DMSO

1. De små molekyler interrogerede i en high-throughput screen opløses i det organiske opløsningsmiddel dimethylsulfoxid (DMSO), som i sig selv kan påvirke ydeevnen af ​​assayet. Derfor skal assayet følsomhed overfor DMSO første behandles for at fastslå den højeste DMSO-koncentration tilladte i skærmen.
2. Plade, farvestof belastning og vask cellerne i BD PureCoat amin-coated 384-brøndsplader som beskrevet ovenfor i afsnit 3, hvilket efterlader 20 gl i HBSS assaybuffer i hver brønd. Hele pladen skal indeholde celler, som er blevet induceret med tetracyclin (figur 3A).
3. Brug en Bravo Automated Væskehåndtering Platform eller manuel pipettering at udarbejde en elleve-punkt DMSO koncentration fortyndingsrækken i HBSS assaypuffer. Typisk anvendes en 2-ganges fortyndingsserie i området fra 10% til 0,01% v / v DMSO vurderet for aktivitet i assayet. Serien bør bestå i en 2x koncentration fordi DMSO løsninger vil blive udvandet med halvdelen i den endelige analyse. The fortyndingsrække bør udplades i en polypropylen 384-brøndsplade ifølge pladen kortet vist i figur 3A.
4. Forbered en 5x Tl ⁺ stimulus plade baseret på EF ₈₀ eller optimal Tl ⁺ koncentration bestemt i afsnit 4.
5. Indlæs cellen, DMSO og Tl ⁺ stimulus plader i FDSS. Oprette to add protokollen, således at 20 ul af 2x koncentration DMSO series sættes til de tilsvarende brønde i cellen pladen indeholdende 20 ul HBSS assaypuffer. Forlade DMSO på cellerne for det samme tidsrum cellerne vil blive udsat for lille molekyle køretøj på en skærm. Record baseline FluoZin-2 fluorescens imindst 10 sekunder før tilsætning af 10 pi 5x Tl ⁺ buffer til hver brønd af cellen plade. Gentag forsøget på 3 forskellige dage for at fastslå reproducerbarheden af ​​resultaterne.
6. Assayet bør være tolerant over for DMSO koncentrationer på mindst 0,1% volumen / volumen for en typisk high-throughput screen, hvor forbindelser testes ved en koncentration på 10 uM.

6. Bestemmelse af Assay Følsomhed over for kendte farmakologiske modulatorer

1. Efter bestemmelse af optimale Tl ^{+-koncentrationen} og DMSO tolerance af assayet, der er kendt virkningerne af farmakologisk aktive midler til Kir-kanal-medieret Tl ⁺ flux skal undersøges. Denne række forsøg skal vurdere analysen følsomhed, evne til at rang-order forbindelser baseret på deres styrke, evne til at kategorisere forbindelser baseret på deres form for effekt (f.eks aktivator, inhibitor), og identificere velopdragne kontrol forbindelser, der skal bruges senere i assayet ddvikling og skærmen.
2. Plade, farvestof belastning og vask cellerne i BD PureCoat amin-coated 384-brøndsplader som beskrevet ovenfor i afsnit 3, hvilket efterlader 20 gl i HBSS assaybuffer i hver brønd. Kolonne 1 og rækker A1-A23 bør indeholde celler, der ikke er induceret med tetracyclin (figur 4A).
3. Brug en Bravo Automated Væskehåndtering Platform eller manuel pipettering at forberede en elleve-punkts koncentration fortyndingsserie af kendte modulatorer i HBSS assaypuffer. Typisk er en 3-ganges fortyndingsserie i området fra 100 uM til 2 nM bedømt for aktivitet i assayet. Serien bør bestå i en 2x koncentration fordi DMSO løsninger vil blive udvandet med halvdelen i den endelige analyse. The fortyndingsrække bør udpladet in triplo i en polypropylen 384-brøndsplade ifølge pladen kortet vist i figur 4A. Vær sikker på, at fortyndinger fremstilles således, at den endelige DMSO-koncentration er ens i medicinsk behandling og mindre tha n eller lig med den maksimale tilladte DMSO-koncentration defineret i § 5.
4. Forbered en 5x Tl ⁺ stimulus plade baseret på den optimale Tl ⁺ koncentration bestemt i afsnit 4.
5. Indlæs cellen, forbindelse og TL ⁺ stimulus plader i FDSS. Oprette to add protokol, således at 20 pi den 2x koncentration rækken af ​​stoffer sættes til de tilsvarende brønde i cellen pladen indeholdende 20 ul HBSS assaypuffer. Læg forbindelserne til cellen plade og inkuber i op til 20 min. Bemærk, at den optimale inkubationstid for forbindelserne at detektere det bedste signal til baggrund-forhold kan bestemmes ved at køre en række forsøg, hvor par forskellige inkubationstider er valgt. Record baseline FluoZin-2 fluorescens i mindst 10 sekunder før tilsætning af 10 pi 5x Tl ⁺ buffer til hver brønd af cellen plade. Gentag forsøget på 3 forskellige dage for at fastslå reproducerbarheden af ​​resultaterne.

_title "> 7. Checkerboard Analyse

1. I den næste serie af eksperimenter vil ensartetheden og reproducerbarheden af ​​assayet vurderes under anvendelse af en "skakbræt"-analyse. Typisk er en kontrol-inhibitor udpladet i hver brønd i hver søjle og række i et 384-brøndsplade, som vist i figur 5A. Til nøje vurdere støjen i assayet, skal en EF ₈₀ koncentration af inhibitor, anvendes. DMSO sættes til de andre brønde som en vehikelkontrol. Tl ⁺ flux i DMSO-og lægemiddel-behandlede celler bruges til at beregne en værdi for Z primtal, et statistisk mål for well-to-godt variation blandt de to populationer af brønde. Z prime beregnes ved hjælp af formlen:
   Z prime = 1 - (3SD _p + 3SD _n) / | betyde _p + betyde _n |
   hvor SD er standardafvigelsen, p er uhæmmet bevægelse, og n er fuldt inhiberet fluxværdierne. Et assay med Z 'værdier større end eller lig med 0,5 på 3 forskellige dage anses suitable for high-throughput screening.
2. Plade, farvestof belastning og vask cellerne i BD PureCoat amin-coated 384-brøndsplader som beskrevet ovenfor i afsnit 3, hvilket efterlader 20 gl i HBSS assaybuffer i hver brønd. Bemærk, at hele pladen skal induceres med tetracyclin.
3. Gøre en forbindelse / DMSO plade ved pipettering i en 384-brønds polypropylen plade under anvendelse af en multikanal-pipette, 80 gl / brønd af en kendt inhibitor af mål-Kir kanal på koncentration bestemt i afsnit 6.5, og 0,1% volumen / volumen DMSO køretøj som vist i figur 5A. Tilsæt kendt inhibitor starter i brønd A1 ved hjælp af multi-kanal pipette og suppleant til godt B2 og så videre op til godt B24. Gentag denne procedure med DMSO starter i godt B1 og så videre op til godt A24. Den endelige udformning af pladen skal stemme overens med en skakternet.
4. Forbered en 5x Tl ⁺ stimulus plade baseret på den optimale TI ⁺ bestemt i punkt 4.
5. Indlæse cellen, forbindelsen og Tl ⁺ stimulus plader i FDSS. Oprette to add protokol, således at 20 pi den 2x koncentration rækken af ​​stoffer sættes til de tilsvarende brønde i cellen pladen indeholdende 20 ul HBSS assaypuffer. Læg forbindelserne til cellen plade og inkuber i op til 20 minutter ved stuetemperatur. Record baseline FluoZin-2 fluorescens i mindst 10 sekunder før tilsætning af 10 pi 5x Tl ⁺ buffer til hver brønd af cellen plade. Gentag forsøget på 3 forskellige dage for at fastslå reproducerbarheden af ​​resultaterne.

8. Pilot Screen

1. I den afsluttende fase af assay udvikling udføre en pilot skærm af et par tusinde forbindelser for at evaluere assayet ydeevne under betingelser, der vil blive anvendt til sidst i det store high-throughput screen.
2. Plade, farvestof belastning og vask cellerne i BD PureCoat amin-coatede 384-brøndsplader som beskrevet ovenfor i afsnit 3), hvilket efterlader 20 gl i HBSS assaybuffer i hver brønd.Bemærk, at hele pladen skal dyrkes natten over med tetracyclin at inducere Kir kanal ekspression.
3. Vælg cirka 2.000 til 3.000 strukturelt forskellige forbindelser, der skal testes. Det er ofte hensigtsmæssigt og praktisk at bruge forbindelser samlinger med kendte aktiviteter potentielt beriget for ion-kanal modulatorer. Sådanne samlinger omfatter Spectrum Collection (MicroSource) og LOPAC samlingen (Sigma). Desuden er det fornuftigt at inkludere kendte modulatorer af Kir af interesse i pilot skærmen. Ideelt disse forbindelser vil blive tilsat til brønde i en blindet måde for at muliggøre en objektiv afprøvning af hit plukkemetoder beskrives senere. Forbered forbindelserne i 384-hullers polypropylenplader (Destination plader) med en Labcyte Echo væskehåndteringsudstyr eller egnet pin værktøj til at overføre et passende volumen af ​​udvalgte forbindelser i DMSO fra MLPCN samling (kilde plader) til destinationen pladerne Bemærk at testforbindelser er Kun i kolonne 3-22;I enhver anden godt af kolonne 1, 2, 23, tilføje 24 en kendt inhibitor ved en kendt koncentration til fuldt ud at hæmme Kir som bestemt i punkt 7. I de resterende brønde i kolonne 1, 2, 23 og 24 tilføjer det passende volumen af ​​DMSO til frembringelse DMSO-koncentration-matchede vehikelkontroller. Fortynd alle brønde med analysebuffer hjælp af Multidrop Combi. Typisk testforbindelser er 20 uM, 2-fold over deres mål screening koncentration.
4. Gør Tl ⁺ stimulus plader baseret på den optimale Tl ⁺ koncentration bestemt i afsnit 4.
5. Udfør pilot-skærmen. Vær omhyggelig med at forskyde trin i protokollen henrettelse at opretholde konsekvent timing mellem plader i pilot screening løb.
6. Når piloten skærmen er afsluttet, analysere skakternede brønde fra kolonne 1, 2, 23 og 24 ved hjælp af Z-prime ligning. Undersøg plader, der viser Z-prime-værdier på mindre end 0,5 for at bestemme kilden til dårlig adskillelse af kontrol populationer. Hits kan be vælges ved hjælp af en række metoder. For pilot skærme er det almindeligt at beregne middelværdi og standardafvigelse af et køretøjs kontrol befolkning og pluk hits baseret på brønde producerer værdier> / = 3 standardafvigelser fra middelværdien af ​​vehikelkontroller.
7. Efter hit plukning, duplikere retest udvalgte hits i i 2 sæt plader. Ét sæt plader indeholder den stabile Kir cellen i fravær af tetracyclin og den anden indeholder den stabile Kir-cellelinien i nærværelse af tetracyclin. Hits, retest positiv i mindst en af ​​de to retest plader og ikke udviser signifikant aktivitet i de ikke-inducerede plader kan anses verificeres hits. Undersøg den verificerede emnelisten at afgøre, hvor mange af de "skjulte" kontrolprøver blev påvist. Manglende opdage kontrollerne i pilot-skærmen viser behov for yderligere optimering af screening eller hit-picking parametre.

Representative Results

Anvendelsen af en tetracyklin-inducerbare ekspressionssystem tilvejebringer en passende intern kontrol for at skelne Tl ⁺ flux gennem endogene veje og Kir kanal af interesse. Figur 1 viser nogle eksempler på Celleudpladning kort, der anvendes i forskellige typer af eksperimenter. Positionerne af brønde indeholdende uinducerede eller tetracyclin-inducerede celler angives med forskellige farver. Figur 2A viser kilden pladediagram anvendes til at bestemme den optimale Tl ^{+-koncentration} for assay udvikling og forbindelse screening. Den farveovergang repræsenterer 3-ganges fortyndingsserie i området fra 100% til 0,002% TI ^+. En repræsentativ fluorescensintensitet kort er vist i figur 2B, med cool-til-varme farver, der angiver lav-til-høj Tl ⁺ flux-værdier. Cellen plating kort vist i figur 1C blev anvendt til dette eksperiment. En tilpasning af en 4-parameter logistisk funktion til tHan Tl ⁺ CRC (figur 2C) anvendes til at bestemme en EF ₈₀ værdi på 15% Tl ^+. Figur 3A viser kilden pladediagram anvendes til at bestemme DMSO tolerance af et assay. Kolonne 1 og 24 indeholder assaypuffer alene, hvorimod farveovergang indikerer 2 gange fortyndingsserie i området fra 10% til 0,01% DMSO. En repræsentativ fluorescensintensitet kort er vist i figur 3B med lave Tl ⁺ flux-værdier, der angives med mørkere blå. Cellen plating kort vist i figur 1B blev anvendt i dette eksperiment. De gennemsnitlige Tl ⁺ flux er registreret fra brønde indeholdende de angivne koncentrationer af DMSO er opsummeret i figur 3C. Dataene er plottet som procentdelen af Tl ⁺ flux optaget i fravær af DMSO. For denne særlige Kir kanal, havde DMSO koncentrationer på op til 2,5% ingen virkning på Tl ⁺ flux og kan derfor anvendes til forsøg. Figure 4A viser kilden pladediagram bruges til at etablere koncentrationsresponskurver for kendte inhibitorer af en Kir kanal. Hver forbindelse er angivet med en anden farve og er typisk udpladet som en 3-ganges fortyndingsserie. En repræsentativ fluorescensintensitet kort er vist i figur 4B. Cellen plating kort vist i figur 1C blev anvendt til dette eksperiment. Et repræsentativt eksperiment, der viser dosisafhængig inhibering af Tl ⁺ flux af en inhibitor er vist i figur 4C. Robustheden af et assay bestemmes i såkaldte "skakternede"-assays, som er sammenfattet i fig. 5. I kilden pladediagram vist i figur 5A, en maksimalt effektiv koncentration af en inhibitor eller 0,1% DMSO som vehikelkontrol udplades i skiftende brønde. Figur 5B viser et repræsentativt fluorescens-intensitet kort. En scatter plot af top Tl ⁺ flux optaget fra individueltal brønde er afbildet i figur 5C. De gennemsnitlige fluorescens-værdier er angivet med fuldt optrukket linie, mens 3 standardafvigelser er angivet med en stiplet linje. The Z primære værdi, et statistisk mål for, hvor godt adskilt de to cellepopulationer er adskilt, beregnet for denne plade er 0,75, hvilket er et godt stykke over de 0,5 tærskel, der gælder for high-throughput screening.

Figur 1. Celleudpladning kort, der anvendes til Tl ⁺ flux assay udvikling. (A) Cell plating kort bruger at bestemme den optimale assay Tl ^{+-koncentration.} Brøndene i kolonne 1, række A1-23, K1-12, F13-23 og P13-23 indeholder ikke-inducerede celler (-Tet). De resterende brønde indeholder celler, der blev behandlet med tetracyclin (+ Tet) at inducere Kir kanal ekspression. (B) Cell plate kort bruge til at afgøre assay DMSO tolerance og udføre skakternet analyse. Bemærk, at alle brøndene behandles med tetracyclin (+ Tet). (C) Cell pladediagram anvendt til at bestemme assayets følsomhed med kendte farmakologiske modulatorer. Brøndene i kolonne 1 og række A1-23 indeholder ikke-inducerede celler (-Tet). De resterende brønde indeholder celler, der blev behandlet med tetracyclin (+ Tet). Klik her for at se større figur .

Figur 2. Bestemmelse af optimal assay Tl ^{+-koncentration.} (A) Kilde pladediagram anvendes til at bestemme Tl ^{+-koncentration,} der fremkalder 80% af den maksimale FluoZin-2 fluorescens stigning (EF _80). Række A og COLUMns 1 og 24 (gul) indeholder en 5x koncentration på 12 mM Tl ₂ SO _4. De resterende rækker indeholder en 3-ganges fortyndingsserie i området fra 12 mM (100%) til 0,024 mm (0,002%) Tl ₂ SO _4. Serien er gentaget i kolonne 2-12 og 13-23. (B) Fluorescensintensitet kort afbilder Tl ⁺ flux for hver brønd Ca. 1 min efter Tl ⁺ tilsætning. Den pseudo-farvebjælken til højre viser omfanget af Tl ⁺ flux, med køligere og varmere farver, der repræsenterer lave og høje fluxværdierne hhv. Bemærk, at de køligere farver i kolonne 1, rækker A1-23, K1-12, F13-23 og P13-23 er på grund af lav Tl ⁺ flux i ikke-inducerede celler. De resterende brønde, herunder dem i kolonne 24, indeholder celler, der blev behandlet med tetracyclin at inducere Kir kanal ekspression (se felt plating kortet i figur 1A). (C) Mean ± SEM CRC for Tl ^+-afhængige ændringer i fluorescens (n = 3). Montering af en fire-parameter logistisk funktioni forhold til de oplysninger fremkommet en IC ₈₀ værdien af 15% Tl ^+. Klik her for at se større figur .

Figur 3. Assay tolerance over for DMSO. (A) Kilde pladediagram anvendes til at bestemme assay tolerance over for DMSO. Kolonne 1 og 24 indeholder HBSS assaypuffer. Rækkerne indeholder en 2x koncentration af et 2-fold DMSO fortyndingsserie i området fra 10% til 0,01% v / v. (B) repræsentant fluorescensintensitet kort afbilder Tl ⁺ flux i hver brønd registreres cirka 1 min efter Tl ⁺ tilsætning. Den pseudo-farvebjælken til højre viser omfanget af Tl ⁺ flux, med køligere og varmere farver, der repræsenterer lave og høje fluxværdierne hhv. (C) Mean ±, SEM (n = 9) Tl ⁺ flux normaliseret til det, som i nærværelse af HBSS assaypuffer alene. Klik her for at se større figur .

Figur 4. Assayfølsomhed med kendte farmakologisk aktive forbindelser. (A) Kilde pladediagram anvendes til at vurdere aktiviteten af kendte farmakologisk aktive forbindelser i TI ⁺ flux assay. Række A og søjler 1 og 24 indeholder 0,1% v / v DMSO. Pladen indretning tillader testning af 10 forbindelser in triplo i kolonner 2-23. Rækkerne indeholder en 2x koncentration af et 3-fold seriefortynding række forbindelser i området fra 100 uM til 2 nM (B) Fluorescensintensitet kort afbilder Tl ⁺ flux for hver brønd approximately 1 min efter Tl ⁺ tilsætning. Den pseudo-farvebjælken til højre viser omfanget af Tl ⁺ flux, med køligere og varmere farver, der repræsenterer lave og høje fluxværdierne hhv. Bemærk, at boringer i kolonne 1 og række A1-23 indeholder ikke-inducerede celler. De resterende brønde indeholder tetracyklin-inducerede celler, der udtrykker Kir-kanal af interesse (se cell pladediagram i figur 1C). (C) Repræsentative Tl ^+-inducerede ændringer i FluoZin-2 fluorescens i brønde forbehandlet med den angivne koncentration af en Kir-kanal inhibitor. Klik her for at se større figur .

Figur 5. Bestemmelse af assay egnethed til HTS. (A) Kilde pladekort anvendes til at evaluere well-til-brønd variabiliteten blandt brønde indeholdende 0,1% DMSO (vehikel) eller en maksimalt effektiv koncentration af en kendt inhibitor. (B) Fluorescensintensitet kort afbilder Tl ⁺ flux i hver brønd Ca. 1 min efter Tl ⁺ tilsætning. Bemærk, at alle brønde indeholder tetracyklin-inducerede celler, der udtrykker Kir kanal af interesse (se cell pladediagram i figur 1 B). (C) Repræsentant scatter plot af steady-state fluorescens værdier opnået fra køretøjets-eller inhibitor-behandlede brønde. Den gennemsnitlige fluorescens amplitude af hver prøve befolkning er angivet med en fuldt optrukket linie, er 3 standardafvigelser fra middelværdien vist med en stiplet linie, og skiftende prøver til køretøj (VHL) og inhibitor (INH) tegnes som individuelle punkter. Klik her for at se større figur .

Discussion

Databehandling: Når data indsamles, indbefatter et almindeligt trin i analysen normalisere hver brønd er fluorescensresponset, F, til den oprindelige værdi ved begyndelsen af eksperimentet, F _0. Dette omtales ofte som "statisk forholdet" og symboliseret "F / F ^_0". Hvis F ₀ domineres af indikatorfarvestoffet den statiske forhold operation vil det væsentlige korrigere for mange faktorer såsom disuniformities i belysningen, signal samling, og celleantal. I tilfælde, hvor farvestoffet signalet er svagt eller baggrundsfluorescens eller refleksioner i systemet er høj, vil den statiske forhold ikke være effektiv, medmindre baggrunden kan hensigtsmæssigt behandles før beregning af statiske forhold. Efter data normalisering, er det typisk at reducere fluorescens bølgeform til en enkelt værdi, der skal anvendes til at kvantificere aktiviteten og pick hits. Mest almindeligt vil dette ske ved tilpasning af dataenepunkter i de 10 sekunder efter tilsætning af Tl ⁺ for at opnå en indledende hældning af den fremkaldte fluorescens forøgelse. For hit picking, er en populær tilgang til at antage, at det store flertal af forbindelser i testpopulationen er inaktive (nulhypotesen er i kraft). En middel-og standardafvigelse beregnes for testpopulationen og hits vælges som er tre standardafvigelser fra middelværdien.

Opdeling af protokollen for lange sammensatte inkubationer: Til detektering Kir-kanal hæmmere, især dem, der handler på intracellulære bindingssteder, kan det være værdifuldt at inkubere cellerne med testforbindelser i en længere periode (fx 20 min) før tilsætning af Tl ^+. Hvis forbindelserne tilsættes "offline" før assay indføres i pladelæser, kan de optiske egenskaber af testforbindelser (fx fluorescens) ikke let genkendes og kan have negativ indflydelse almindeligt anvendtedata normalisering metoder, for eksempel "statiske forhold" F / F ₀ ovenfor beskrevne resulterer i falsk positive og / eller falske negative. For at undgå dette problem, samtidig med at man undgår at skulle holde en assayplade i en læser for en lang inkubation, den ene løsning er at anvende en "to read"-protokollen. Den første læsning er en kort (fx 30 sekunder) eksperiment, hvor forbindelsen tilsættes efter 10 sekunder for at tillade indfangning af præ-forbindelsen tilsætning F ₀ og vurdere forbindelsernes optiske virkninger på systemet. Pladen fjernes derefter fra læseren og inkuberes i den ønskede periode og vendte tilbage til læseren for thallium tilsætning. Efter begge læser er afsluttet, først læse F ₀ kan bruges til at normalisere data fra den anden læste så man undgår mange spørgsmål i forbindelse med tilsætning af forbindelser "offline", samtidig med at muligheden for at holde læseren travlt indsamle data dermed forbedre screening gennemløb. De to read tilgang er lettest implemterede ved anvendelse af et automatiseret screeningssystem. Det er vigtigt at bemærke, at de to read fremgangsmåde ikke vil fjerne problemerne i forbindelse med fluorescerende forbindelser, der mætter detektoren og / eller forårsage udlæsning artefakter i CCD-kameraet.

Konfiguration af et assay for aktivatorer: Ikke alle Kir kanaler maksimalt aktiveres under hvilende betingelser, det kan således være muligt at udforme et assay, der kan detektere små molekyler aktivatorer. I disse tilfælde, ⁺ vælge en EF ₈₀ koncentration af Tl kan ikke give nok "headroom" for analysen til detektere aktivatorer. Man kan således vælge at anvende en lavere koncentration af Tl ⁺ (fx EC ₂₀₎ i aktivator assays. I nogle tilfælde kan assayet udviser tilstrækkelig lav variabilitet for at muliggøre anvendelsen af _en EC50-koncentrationen af Tl ⁺ og stadig tilvejebringe passende opløsning af både aktiverede og inhiberede kanal populationer. I dette tilfælde assayet may gennemføres i dobbelt aktivator / inhibitor-tilstand. Når tilgængelig, kan en kendt aktivator anvendes til at hjælpe med at bestemme den passende Tl ⁺ koncentration til at maksimere chancerne for at opdage kanalaktivatorer.

Begrænsninger: Der er nogle begrænsninger, som bør overvejes i forbindelse med udvikling og gennemførelse af en Tl ⁺ flux-baserede high-throughput skærm. For eksempel afhænger assayet på et indirekte mål for Kir kanalaktivitet ved anvendelse af en fluorescerende probe, hvis optiske egenskaber kan blive direkte påvirket af forbindelser i en skærm. Derfor skal vigtige observationer fra Tl ⁺ flux forsøg bekræftes ved hjælp spænding clamp elektrofysiologi, der betragtes som "guldstandard"-fremgangsmåde til ion-kanal farmakologi. Endvidere kan små molekyler direkte på den endogene Tl ⁺ flux pathways udtrykt i HEK-293-celler, der fører til identifikation af falske positive hits. Den tetracykline-inducerbare system er især nyttigt til at skelne falske positive hits fra Kir-kanal-rettet modulatorer fordi hits hurtigt kan screenes i ikke-inducerede celler for virkninger på endogene veje. Endelig den lave opløselighed af Tl ⁺ i chlorid-holdige buffere begrænse koncentrationen af Tl ^+, som kan anvendes i et assay, kræver anvendelse af en ikke-fysiologisk Tl ⁺ stimulus buffer, som kan forøge farmakologi af emnet ^11. Kompatibiliteten af ​​forskellige buffere med målet af interesse bør vurderes nøje under assay udvikling. Dette kan gøres ved at etablere CRC'er for kendte modulatorer ved hjælp af forskellige Tl ⁺ stimulus buffere og vælge forhold, som farmakologi passer bedst, der blev observeret ved hjælp af fysiologiske buffere.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
pcDNA5/TO	Invitrogen	V1033-20	Tetracycline-inducible expression vector
T-REx-HEK293 cells	Invitrogen	R71007	Tetracycline-inducible cell line
Lipofectamine LTX/Plus Reagent	Invitrogen	15338100	Transfection reagent
FBS	ATLANTA Biologicals	S11550	Cell culture media
DMEM	Invitrogen	11965	Cell culture media
Hygromycin B	Invitrogen	10687-010	Cell culture media
Blasticidin S	Invitrogen	R210-01	Cell culture media
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140	Cell culture media
HBSS-divalent free	Mediatech	21022CV	Cell washing
Trypsin-0.25%	Mediatech	25053CI	Cell dissociation
Tetracycline-HCl	Sigma	T9823	Induction reagent
Dialyzed FBS	ATLANTA Biologicals	S12650	Plating media
FluoZin-2	Invitrogen	F24189	Fluorescent dye
Pluronic F-127	Invitrogen	P-3000MP	Dye loading
HBSS	Invitrogen	14175	Assay buffer
HEPES	Invitrogen	15630	Assay buffer
NaHCO3	Sigma	S6297	Tl+ stimulus buffer
MgSO4	Sigma	M2643	Tl+ stimulus buffer
CaSO4∙2H2O	Sigma	C3771	Tl+ stimulus buffer
D-Glucose	Sigma	G7528	Tl+ stimulus buffer
Thallium sulfate	Aldrich	204625	Tl+ stimulus buffer
HEPES	Sigma	H4034	Tl+ stimulus buffer
DMSO	Sigma	D4540	Solvent
Eight-channel electronic pipettor	Biohit	E300	Cell plating in 384-well plates
BD PureCoat amine-coated 384-well plates	BD Biosciences	356719	Assay microplates
Echo qualified 384-Well polypropylene microplate (384PP)	Labcyte	P-05525	Compound source microplates
384-well polypropylene microplates	Greiner Bio-One	781280
Multidrop Combi reagent dispenser	Thermo Scientific	5840300
ELx405 microplate washer	BioTek	ELx405HT	Automated cell washing
Echo liquid handler	Labcyte	Labcyte Echo 550
Bravo automated liquid handling platform	Agilent Technologies	Standard model
Hamamatsu FDSS 6000	Hamamatsu		Kinetic imaging plate reader
Table 1. List of Materials and Reagents.