Criblage à haut débit pour les petites molécules modulateurs de canaux potassiques entrants Rectifier

Summary

Méthodes d'élaboration et de validation d'un dosage quantitatif de fluorescence pour mesurer l'activité de potassium redresseur actif (Kir) des canaux pour le criblage de composés à haut débit est présenté.

Abstract

Certains membres de la famille redresseur canal potassique vers l'intérieur (Kir) sont postulés cibles thérapeutiques pour une variété de troubles, y compris l'hypertension, la fibrillation auriculaire, et de ^1,2 douleur. Pour la plupart, toutefois, les progrès vers la compréhension de leur potentiel thérapeutique, voire fonctions physiologiques a été ralentie par le manque de bons outils pharmacologiques. En effet, la pharmacologie moléculaire de la famille redresseur entrant est restée loin derrière celle de la superfamille S4 de potassium voltage-dépendants (Kv), les canaux pour lesquels un certain nombre d'affinité nanomolaire et très modulateurs sélectifs des toxines peptidiques ont été découverts ^3. La toxine du venin d'abeille tertiapin et ses dérivés sont de puissants inhibiteurs de Kir1.1 et Kir3 canaux ^4,5, mais peptides sont d'une utilité limitée thérapeutique ainsi que expérimentalement en raison de leurs propriétés antigéniques et la biodisponibilité médiocre, la stabilité métabolique et la pénétrance des tissus. Le développement de puissantset sélectifs de petites molécules sondes avec des propriétés pharmacologiques améliorées sera un élément clé pour bien comprendre la physiologie et le potentiel thérapeutique des canaux Kir.

La moléculaire bibliothèques Sondes de production Network Center (MLPCN) supportée par le National Institutes of Health (NIH) Fonds commun a créé des opportunités pour les scientifiques académiques pour initier des campagnes de sonde de découverte de cibles moléculaires et les voies de signalisation dans le besoin d'une meilleure pharmacologie ^6. L'offre aux chercheurs l'accès MLPCN aux centres de dépistage l'échelle industrielle et la chimie médicinale et de l'informatique en charge de développer de petites molécules sondes pour élucider la fonction des gènes et des réseaux de gènes. L'étape critique pour gagner l'entrée à l'MLPCN est le développement d'un test robuste cible ou une voie spécifique qui est susceptible de criblage à haut débit (HTS).

Ici, nous décrivons comment développer une base de fluorescence thallium (Tl ⁺⁾ flux assaY sur Kir canal de fonction pour le criblage à haut débit composé ^7,8,9,10. L'essai est basé sur la perméabilité de la chaîne K ⁺ pores de la Tl ⁺ K ⁺ congénère. Un disponibles dans le commerce fluorescent Tl ⁺ colorant reporter est utilisé pour détecter le flux transmembranaire de Tl ⁺ à travers le pore. Il ya au moins trois colorants disponibles dans le commerce qui sont appropriés pour Tl ⁺ tests de flux: BTC, FluoZin-2, ^7,8 et Fluxor. Ce protocole décrit le développement de tests à l'aide FluoZin-2. Bien qu'à l'origine développés et commercialisés comme un indicateur de zinc, FluoZin-2 présente une augmentation forte et dose-dépendante de l'émission de fluorescence lors de Tl ⁺ contraignant. Nous avons commencé à travailler avec FluoZin-2 avant Fluxor était disponible ^7,8 et ont continué à le faire ^9,10. Cependant, les étapes de développement de tests sont essentiellement identiques pour les trois colorants, et les utilisateurs devraient déterminer quels colorant est le plus approprié pour leur propre needs. Nous discutons également des critères de performance de l'analyse qui doit être atteint à prendre en considération pour l'entrée à l'MLPCN. Depuis Tl ⁺ imprègne facilement la plupart des canaux K ^+, le dosage doit être adapté à la plupart des objectifs de canaux K ^+.

Protocol

1. Génération de lignées stables de cellules polyclonales

1. La mise en place d'une lignée cellulaire stable exprimant de haute qualité du canal Kir d'intérêt est une première étape importante vers l'élaboration d'un test de criblage à haut débit robuste. Constitutif canal K ⁺ surexpression peut conduire à l'activation de voies de mort cellulaire, la dégénérescence lignée cellulaire stable et la perte de performance du test. Pour éviter ces problèmes potentiels et fournir un contrôle pratique interne pour le développement de tests (voir ci-dessous), un système d'expression inductible par la tétracycline est recommandé ^8.
2. Culture du parentale T-rex-cellules HEK293 en utilisant des techniques standard de B-(milieu de croissance DMEM contenant 10% de FBS, 50 U / ml de pénicilline, 50 pg / ml de streptomycine et 5 ug / ml blasticidine S). Utilisez le passage des cellules précoces (par exemple 3-4 passages depuis le dégel de stockage d'azote liquide) pour la transfection et la sélection de clones stables.
3. Plate 4000000 T-Rex-cellules HEK293 dans unFlacon de ⁷⁵ cm2 de sorte que le flacon est d'environ 80% de confluence le jour suivant. Culture d'une nuit dans un 5% de CO ₂ incubateur à 37 ° C.
4. Transfecter les cellules en utilisant 10-15 ug d'ADN et pcDNA5/TO-Kir Lipofectamine LTX / Plus réactif selon le protocole du fabricant. Après 5 heures, remplacer le milieu de transfection par B-support.
5. 24 heures après la transfection, remplacer le B-support avec B-milieu contenant 250 ug / ml d'hygromycine (BH-support) pour commencer la sélection de clones stables. Alimenter les cellules tous les 2-3 jours avec des produits frais BH-support.
6. Plus de 90% des cellules doit mourir au cours des 7 prochains jours, laissant derrière lui de petites colonies de cellules transfectées de façon stable. Permettre aux colonies de se développer pendant 10-14 jours supplémentaires avant de se séparer d'un ballon de 175 cm ² pour l'expansion.
7. Pour la cryoconservation, geler 3 x 10 ⁶ cellules / ml dans un milieu contenant 45% BH-conditionné moyenne, 45% sans antibiotique, contenant du sérum DMEM et 10% de DMSO. Gelerles cellules pendant une nuit à -80 ° C dans un récipient de congélation de cellules, puis passer à l'azote liquide pour stockage à long terme. Décongeler les cellules de l'azote liquide en utilisant le protocole recommandé d'Invitrogen. Notez que la viabilité des cellules seront plus faibles si elles sont congelées à partir d'un ballon qui est supérieure à 75% de confluence au moment de la transformation.

2. Génération de lignées stables de cellules monoclonaux

1. Laver un sous-confluentes flacon de ⁷⁵ cm2 de cellules stables polyclonaux avec divalent sans HBSS. Ajouter 1 ml de trypsine et incuber pendant 3-5 min dans un 5% de CO ₂ incubateur à 37 ° C. Ajouter 5 ml de BH-support dans le ballon pour inhiber l'activité de la trypsine et on triture à plusieurs reprises (par exemple, 5 fois) pour bien dissocier les cellules. Inspectez soigneusement les cellules sous un microscope afin d'assurer la suspension est presque entièrement constitué de cellules individuelles. Cela permettra d'accroître la probabilité d'obtenir des lignées de cellules monoclonaux.
2. Déterminer la densité cellulaire et diluerla suspension à une concentration de 0,7 cellules par 20 pl. En utilisant une pipette multi-canaux, pipette 20 ul de la suspension cellulaire dans chaque puits de la BD PureCoat amine revêtement (ou l'équivalent de poly-D-lysine couché) 384 puits. En principe, 70% des puits devraient recevoir une cellule avec ces conditions de placage. Ainsi, une plaque de 384 puits devraient contenir plus de 200 clones à analyser. Poursuivre la culture des cellules dans un 5% de CO ₂ incubateur à 37 ° C.
3. Après une semaine, inspecter les plaques au microscope pour les puits contenant des colonies isolées. Notez leur position sur le couvercle avec un marqueur permanent pour référence future. Veillez également à noter et excluent les puits contenant des colonies multiples. Ceux-ci sont plus faciles à reconnaître par l'apparition de colonies en croissance à partir de plusieurs côtés du puits. Soyez conscient du fait que l'évaporation a tendance à se produire plus rapidement des puits près du bord de la plaque. Ajouter BH-support aux puits où l'évaporation significative s'est produite. Dans le cas contraire, il est inutile to nourrir les cellules.
4. Surveiller les puits plus fréquemment au cours des prochains jours 7-10. Les cellules seront prêts à se fendre au puits d'intérêt soient au moins 50% de confluence.
5. Fractionner les cellules de dupliquer les plaques 384-puits; une plaque de dosage à flux Tl ⁺ et l'autre pour les lignes monoclonaux continue dans la culture. Aspirer le fluide dans les puits contenant les lignées cellulaires d'intérêt. Laver les cellules avec HBSS sans divalent, ajouter 20 ul de trypsine dans chaque puits et transférer la plaque dans un incubateur à 37 ° C pendant 15-20 min. Après avoir déplacé la plaque arrière de la hotte de culture cellulaire, ajouter 20 ul de BH à moyen et à chaque puits et on triture plusieurs fois pour dissocier les cellules. Inspecter les puits sous un microscope pour s'assurer que les cellules sont totalement dissociés. Cela peut nécessiter plusieurs cycles de pipetage, comme les cellules seront très adhérentes. Une fois que les cellules sont dissociées, transférer 10 ul de chaque suspension cellulaire de dupliquer les puits d'une 38 nouveaux BD PureCoat amine-enduit4-plaque à puits. N'oubliez pas de noter la relation entre la source et puits en double et de destination afin que les clones présentant robuste activité des canaux Kir (voir ci-dessous) on peut faire remonter à l'origine même. Ajouter 20 ul d'BH-support de la source d'origine et de nourrir les cellules restantes et de les poursuivre en culture dans 5% de CO ₂ incubateur à 37 ° C.
6. Laisser les cellules de la plaque de destination à adhérer et à se développer pendant une semaine. Une fois que la plupart des clones atteignent la confluence d'au moins 50%, ils peuvent être évalués pour l'activité du canal Kir en utilisant le test Tl ⁺ de flux décrits ci-dessous.
7. La veille de l'épreuve, aspirer le milieu de culture et le remplacer par du milieu contenant 10% de BH FBS dialyse. Cela empêche l'expression du canal par inadvertance qui pourrait découler de sérum contaminé tétracycline. Induire l'expression de canal Kir dans une seule des deux puits pour chaque clone, en incluant 1 pg / ml de tétracycline. Le double non induit et servira de"Fond" de contrôle. Effectuez la Tl ⁺ tests de flux comme décrit ci-après.

3. Tl Générale ⁺ Procédure d'essai Flux

1. La veille d'une expérience de flux Tl ^+, dissocier les cellules et à quantifier la densité de la suspension cellulaire tel que décrit dans les sections 2.1 et 2.2. Plate 20.000 cellules transfectées de façon stable monoclonaux avec un gène du canal Kir d'intérêt dans chaque puits d'une BD PureCoat amine enduit plaque de 384 puits en utilisant un thermo Combi multipoints ou une pipette multi-canaux. Utiliser un matériau BH contenant 10% de FBS dialyse pour le placage. Notez que certaines cellules seront cultivées pendant une nuit avec 1 pg / ml tétracycline pour induire l'expression du canal Kir, alors que d'autres non. L'emplacement de cellules induites et non induites seront différentes pour chaque type d'expérience et sont présentés dans la figure 1.
2. Le lendemain, inspecter les plaques au microscope pour faire en sorte que les cellules sont adhérentes et répartis uniformément dans le fonddes puits. Les puits doivent être confluentes à 80-90%.
3. Utilisez une Rondelle de microplaques ELx405 pour remplacer le milieu de culture cellulaire avec 20 ul par puits de tampon de dosage HBSS contenant 20 mM d'HEPES et tamponné à pH 7,3 avec NaOH. Alternativement, on peut utiliser un "film et le slam" méthode, dans laquelle la plaque est inversé et a décoché une forte baisse à éjecter le support dans une poubelle, puis tapota sur du papier absorbant pour retirer empilées les médias restantes. Immédiatement rajouter un tampon de dosage HBSS à la plaque pour empêcher les cellules de dessiccation.
4. Préparer le FluoZin-2, AM solution de chargement colorant. Après une brève centrifugation du tube, dissoudre 50 mg de poudre de FluoZin-2 dans 100 ul de DMSO anhydre. À ce stade, des aliquotes de la solution stock x 1000 peuvent être conservés à -20 ° C pour une utilisation ultérieure. Lorsque vous êtes prêt à utiliser, ajouter 50 ul d'un poids de 20% par volume de Pluronic F-127/DMSO solution pour le colorant et mélanger avec le pipetage doux. Ne pas congeler le colorant fois Pluronic F-127 a été ajoutée,à basse température peut provoquer le tensioactif à précipiter hors de la solution. Ajouter le volume 150 ul de FluoZin-2, AM/Pluronic-F127 à 100 ml de tampon de dosage HBSS et mélanger doucement pour faire le tampon de charge colorant. L'utilisation d'un Combi multipoints ou en multi-canal pipette, ajouter 20 ul de tampon de charge de colorant dans chaque puits contenant déjà 20 ul de tampon de dosage HBSS. Incuber les cellules à température ambiante pendant environ 1 heure (en général l'incubation a été fait dans l'obscurité, bien qu'il n'y ait aucune preuve directe qu'il est nécessaire).
5. Bien que les cellules se chargent avec de la teinture, de préparer une plaque de relance Tl ^+. Fraîchement dissoudre 0,5 g de bicarbonate de sodium dans 50 ml de tampon de Tl ⁺ 5x stimulus contenant 1 mM de sulfate de magnésium, du sulfate de calcium 1,8 mM, 5 mM de glucose, 10 mM de HEPES et 12 mM de sulfate de Tl ^+. En variante, le bicarbonate de sodium peut être remplacée par du gluconate de sodium, si, par exemple, le pH de la solution doit être maintenue dans une plage très étroite, et la perte de dioxyde de carboneest une préoccupation. Boucher le tube hermétiquement afin de limiter l'échappement de dioxyde de carbone et retourner plusieurs fois jusqu'à ce que le bicarbonate de sodium passe en solution. En utilisant une pipette multi-canaux, ajouter 50 ul de la solution dans chaque puits d'un polypropylène plaque de 384 puits (tableau 1).
6. Après que les cellules ont été chargées avec FluoZin-2, AM, laver les assiettes avec une Rondelle de microplaques ELx405 ou en utilisant le "film et le slam" méthode, telle que décrite ci-dessus dans la section 3.3. Selon le type de Tl ⁺ expérience de flux à exécuter, rajouter 20 pi ou 40 pi de tampon de dosage HBSS à chaque puits. Les plaques sont maintenant prêts pour les expériences.
7. La cellule et Tl ⁺ plaques dans une Hamamatsu Drug Screening System fonctionnelle (FDSS) ou équivalent lecteur de plaque d'imagerie cinétique avec des capacités intégrées de distribution de liquide. Utilisez des filtres appropriés pour la fluorescéine / fluorescéine à base de colorants tels que le Fluo-4.
8. Mettre en place un protocole simple add sorte que 10 ul du 5x Tl ⁺série est ajouté dans les puits correspondants de la plaque cellulaire contenant 40 pl de tampon de dosage HBSS. Fluorescence de référence d'enregistrement à une fréquence de 1 Hz échantillonnage pendant au moins 10 secondes. La fluorescence du puits à puits doit être uniforme et stable à travers la plaque une fois les conditions de chargement plaquage optimal des cellules, de lavage et de teinture sont établis. Une approche intégrée 384-canal pipette est utilisée pour ajouter simultanément le tampon de Tl ⁺ relance à chaque puits.
9. Dossier pendant au moins 2 min, de manière que le taux de pic et du Tl ^{+-augmentation} de la fluorescence induite est capturée pour une analyse hors ligne.

4. Détermination de la concentration optimale Tl +

1. Tl ⁺ imprègne facilement plus intimes redresseur canaux K ^+. Faire en sorte que Tl ⁺ concentrations ne dépassent pas la plage dynamique du colorant reporter Tl ⁺ FluoZin-2, il convient de déterminer empiriquement la concentration optimale Tl ⁺ pour être utilisé dans un haut-throughput écran. Nous recommandons une concentration ⁺ Tl qui évoque 80% de la réponse maximale de fluorescence (CE ₈₀₎ dans des conditions où le canal est activé au maximum.
2. Plaque, colorant de charge et laver les cellules en BD PureCoat amine enrobés ou équivalent poly-D-lysine-384-plaques revêtues ainsi que décrit ci-dessus dans la section 3, ce qui laisse 40 ul de tampon de dosage HBSS dans chaque puits. Comme le montre la carte plaque de la figure 1A, colonne 1 et les lignes A1-A23 doit contenir des cellules qui n'ont pas été induits par la tétracycline et n'ont donc pas exprimer le canal Kir d'intérêt. Les signaux de fluorescence FluoZin-2 provenant des puits non induites sera utilisé pour déterminer le niveau de Tl ⁺ flux à travers les voies endogènes, comme la Na ⁺ - K ^+-ATPase et de la tension ⁺ K fermée canaux, qui sont normalement exprimées dans des cellules HEK- 293 cellules.
3. Utiliser une plate-forme automatisée Agilent Bravo Liquid Handling ou pipetage manuel de préparer unonze points Tl ⁺ série de dilutions concentration en tampon de dosage HBSS. Typiquement, une série 3-dilution en série allant de 100% à 0,002% Ti ⁺ est évaluée dans le test. La série devrait être composé à une concentration 5x parce que les solutions Tl ⁺ sera dilué à 1:5 dans l'analyse finale. Préparer la dilution en série par dilution de la norme 5x tampon de Tl ⁺ décrit dans la section 3 avec un Tl ⁺ 5x sans tampon contenant 1 mM de sulfate de magnésium, 1,8 mM de sulfate de calcium, 5 mM de glucose et 10 mM d'HEPES. Encore une fois, fraîchement dissoudre 0,5 g de bicarbonate de sodium dans 50 ml de tampon de Tl ⁺ finale juste avant placage dans un polypropylène plaque de 384 puits en fonction de la carte plaque représentée sur la figure 2A.
4. Chargez la cellule et les plaques de relance Tl ⁺ dans le FDSS. Mettre en place un protocole simple add sorte que 10 ul de la série 5x Tl ⁺ est ajouté dans les puits correspondants de la plaque cellulaire contenant 40 pi de HBSUn tampon d'essai S. Enregistrement de base FluoZin-2 fluorescence pendant 10 secondes avant d'ajouter Tl ⁺ à la plaque. Répétez l'expérience sur 3 jours différents pour établir la reproductibilité des résultats.

5. Détermination de la sensibilité du dosage de DMSO

1. Les petites molécules interrogés dans un écran à haut débit sont dissous dans le dimethyl sulfoxyde organique solvant (DMSO), qui lui-même peut affecter les performances du test. Par conséquent, la sensibilité du test de DMSO doit d'abord être examinée afin d'établir la plus grande concentration de DMSO admissible à l'écran.
2. Plaque, colorant de charge et laver les cellules en BD PureCoat amine enduit des plaques de 384 puits comme décrit ci-dessus dans la section 3, ce qui laisse 20 ul de tampon de dosage HBSS dans chaque puits. La totalité de la plaque doit contenir des cellules qui ont été induits par la tétracycline (figure 3A).
3. Utiliser une plate-forme Bravo automatisé de manipulation des liquides ou pipetage manuel de préparer un D en onze pointsSérie MSO dilution concentration en tampon de dosage HBSS. Typiquement, une série de dilutions 2-pli allant de 10% à 0,01% v / v de DMSO est évaluée pour l'activité dans le dosage. La série devrait être composé à une concentration 2x parce que les solutions de DMSO est dilué de moitié dans le test final. La série de dilutions doivent être déposées dans un polypropylène plaque de 384 puits, selon la carte plaque représentée sur la figure 3A.
4. Préparer une plaque de relance 5x Tl ⁺ basé sur la CE ₈₀ ou optimale Tl ⁺ concentration déterminée à l'article 4.
5. Chargez la cellule, le DMSO et Tl ⁺ plaques de relance dans le FDSS. Mettre en place un protocole en deux add sorte que 20 ul de la concentration de DMSO 2x série est ajouté dans les puits correspondants de la plaque cellulaire contenant 20 pl de tampon de dosage HBSS. Laissez le DMSO sur les cellules de la même quantité de temps, les cellules seront exposées à des véhicules de petites molécules au cours d'un écran. Référence enregistrement FluoZin-2 à fluorescence pourau moins 10 secondes avant d'ajouter 10 ul de tampon de Tl ⁺ 5x dans chaque puits de la plaque de cellule. Répétez l'expérience sur 3 jours différents pour établir la reproductibilité des résultats.
6. Le test doit être tolérant au DMSO concentrations d'au moins 0,1% v / v pour un type d'écran à haut débit dans lequel les composés sont testés à une concentration de 10 uM.

6. Détermination de la sensibilité du test de modulateurs pharmacologiques connus

1. Après avoir déterminé la concentration optimale Tl ⁺ et le DMSO tolérance de l'essai, les effets des substances pharmacologiquement actives connues sur le canal Kir médiée par Tl ⁺ de flux doivent être examinés. Cette série d'expériences permettra d'évaluer la sensibilité du test, la capacité à hiérarchiser les composés en fonction de leur puissance, de capacité à catégoriser les composés en fonction de leur mode de l'efficacité (par exemple, activateur, inhibiteur), et d'identifier les composés contrôle bien élevés pour être utilisé plus tard dans le test développement et l'écran.
2. Plaque, colorant de charge et laver les cellules en BD PureCoat amine enduit des plaques de 384 puits comme décrit ci-dessus dans la section 3, ce qui laisse 20 ul de tampon de dosage HBSS dans chaque puits. Colonne 1 et les lignes A1-A23 devrait contenir des cellules qui n'ont pas été induits par la tétracycline (figure 4A).
3. Utiliser une plate-forme Bravo automatisé de manipulation des liquides ou pipetage manuel de préparer une série de onze points de concentration de dilution de modulateurs connus dans un tampon de dosage HBSS. Typiquement, une série de dilutions 3-pli allant de 100 uM de 2 nM pour l'activité est évaluée dans le test. La série devrait être composé à une concentration 2x parce que les solutions de DMSO est dilué de moitié dans le test final. La série de dilution doit être plaqué en trois exemplaires, un polypropylène plaque de 384 puits, selon la carte plaque représentée à la figure 4A. Assurez-vous que les dilutions sont faites de telle sorte que les concentrations finales de DMSO sont les mêmes entre les traitements médicamenteux et moins tha n ou égale à la concentration de DMSO maximale admissible définie à l'article 5.
4. Préparer une plaque de relance 5x Tl ⁺ basé sur la concentration optimale Tl ⁺ déterminé à l'article 4.
5. Chargez la cellule, composé et plaques de relance Tl ⁺ dans le FDSS. Mettre en place un protocole en deux ajouter 20 ul de sorte que la série 2x composé concentration est ajouté dans les puits correspondants de la plaque cellulaire contenant 20 pl de tampon de dosage HBSS. Ajouter les composés de la plaque cellulaire et laisser incuber jusqu'à 20 min. Notez que le temps d'incubation optimal pour les composés à détecter le meilleur rapport signal sur fond peut être déterminée par l'exécution d'une série d'expériences où en couple différents temps d'incubation sont choisies. Référence enregistrement FluoZin-2 fluorescence pendant au moins 10 secondes avant d'ajouter 10 ul de tampon de Tl ⁺ 5x dans chaque puits de la plaque de cellule. Répétez l'expérience sur 3 jours différents pour établir la reproductibilité des résultats.

_title "> 7. damier analyse

1. Dans la prochaine série d'expériences, l'uniformité et la reproductibilité de l'analyse seront évalués à l'aide d'un «damier» analyse. En règle générale, un inhibiteur de la commande est plaqué dans chaque puits autre de chaque colonne et chaque ligne d'une plaque de 384 puits, comme le montre la figure 5A. Pour évaluer rigoureusement le bruit dans l'essai, une CE ₈₀ concentration de l'inhibiteur doit être utilisé. DMSO est ajouté aux puits d'autres sous forme de commande de véhicule. Tl ⁺ de flux dans le DMSO et de drogues des cellules traitées est utilisée pour calculer une valeur pour Z prime, une mesure statistique du puits à la même variabilité entre les deux populations de puits. Z prime est calculée en utilisant la formule:
   Z prime = 1 - _(p + 3SD 3SD _n) / | _p + signifie moyenne _n |
   où SD est l'écart type, p est le flux sans entrave et n est totalement inhibé valeurs de flux. Un test avec des valeurs supérieures ou égales à 0,5 Z 'de 3 jours distincts est considéré suitable de criblage à haut débit.
2. Plaque, colorant de charge et laver les cellules en BD PureCoat amine enduit des plaques de 384 puits comme décrit ci-dessus dans la section 3, ce qui laisse 20 ul de tampon de dosage HBSS dans chaque puits. Notez que la plaque entière devrait être induite par la tétracycline.
3. Faire un plateau composé / DMSO en pipettant dans une plaque en polypropylène de 384 puits en utilisant une pipette multi-canaux, 80 pl / puits d'un inhibiteur connu du canal Kir cible à la concentration déterminée à l'article 6.5, et de 0,1% v / v de DMSO véhicule comme représenté sur la figure 5A. Ajouter l'inhibiteur de départ connu dans le puits A1 à l'aide de la pipette multi-canaux et alternative à bien B2 et ainsi de suite jusqu'à bien B24. Répétez cette procédure avec le DMSO de départ dans le puits B1 et ainsi de suite jusqu'à bien A24. La disposition finale de la plaque doit correspondre à celui d'un damier.
4. Préparer une plaque de relance 5x Tl ⁺ basé sur le optimales Tl ⁺ déterminé à l'article 4.
5. Chargez la cellule, composé et Tl ⁺ plaques de relance dans le FDSS. Mettre en place un protocole en deux ajouter 20 ul de sorte que la série 2x composé concentration est ajouté dans les puits correspondants de la plaque cellulaire contenant 20 pl de tampon de dosage HBSS. Ajouter les composés de la plaque de cellules et incuber à 20 min à température ambiante. Référence enregistrement FluoZin-2 fluorescence pendant au moins 10 secondes avant d'ajouter 10 ul de tampon de Tl ⁺ 5x dans chaque puits de la plaque de cellule. Répétez l'expérience sur 3 jours différents pour établir la reproductibilité des résultats.

8. Écran pilote

1. Dans la phase finale de l'élaboration de tests, effectuer un écran pilote de quelques milliers de composés à évaluer la performance du test dans des conditions qui seront utilisés éventuellement dans la grande échelle à haut débit écran.
2. Plaque, colorant de charge et laver les cellules en BD PureCoat amine plaques enduites de 384 puits comme décrit ci-dessus dans la section 3), ce qui laisse 20 ul de tampon de dosage HBSS dans chaque puits.Notez que la plaque entière devrait être cultivées pendant une nuit avec de la tétracycline pour induire l'expression du canal Kir.
3. Sélectionnez d'environ 2.000 à 3.000 composés structurellement différents à tester. Il est souvent approprié et commode à utiliser les collections de composés avec des activités connues potentiellement enrichis pour des modulateurs de canaux ioniques. Ces collections comprennent la collection du spectre (Microsource) et la collecte Lopac (Sigma). En outre, il est prudent d'inclure modulateurs connus du Kir d'intérêt dans l'écran du pilote. Idéalement, ces composés seront ajoutés dans les puits d'une façon aveugle afin de permettre à un test biaisé des méthodes de cueillette touchés décrits plus loin. Préparer les composés dans des plaques de polypropylène 384-puits (plaques de destination) à l'aide d'un gestionnaire d'écho Labcyte liquide ou outil broche adaptée pour transférer un volume approprié de composés choisis dans le DMSO à partir de la collection MLPCN (plaques de source) pour les plaques de destination à noter que les composés d'essai sont uniquement dans les colonnes 3-22;Dans tous les autres bien des colonnes 1, 2, 23, 24 ajouter un inhibiteur connu à une concentration connue de bien inhiber la Kir tel que déterminé à l'article 7. Dans les puits restants des colonnes 1, 2, 23, et 24, ajouter le volume de DMSO pour produire contrôles DMSO véhicules concentration appariés. Diluer tous les puits avec du tampon de dosage utilisant le Combi multipoint. En règle générale composés d'essai sera de 20 uM, 2-fois-dessus de leur concentration de dépistage cible.
4. Assurez plaques Tl ⁺ de relance basé sur l'optimal Tl ⁺ concentration déterminée à l'article 4.
5. Exécutez l'écran du pilote. Prenez soin de décaler les étapes de l'exécution du protocole de maintenir le calendrier cohérent entre les plaques à long pilote de dépistage.
6. Une fois l'écran de pilote est terminée, l'analyse des puits en damier des colonnes 1, 2, 23, et 24 à l'aide de l'équation Z-prime. Inspecter les plaques qui montrent Z-prime des valeurs inférieures à 0,5 afin de déterminer la source de la mauvaise séparation des populations de commande. Hits Puis-be sélectionnés à l'aide d'un certain nombre de méthodes. Pour les écrans pilotes, il est courant de calculer la moyenne et l'écart type de la population contrôle du véhicule et prendre les hits selon puits de production valeurs> / = 3 écarts-types de la moyenne des commandes du véhicule.
7. Après la cueillette coup, recontrôler le succès sélectionnés en double exemplaire, en 2 jeux d'assiettes. Un ensemble de plaques de la cellule contient Kir stable en l'absence de tétracycline et l'autre contient la ligne de Kir stable de cellules en présence de tétracycline. Hits qui retest positif dans au moins une des deux plaques retest et ne montrent pas d'activité significative dans les plaques non induites peuvent être considérées comme vérifiées hits. Examinez la liste de résultats vérifiés afin de déterminer combien de ces «cachées» des échantillons de contrôle ont été détectés. L'impossibilité de détecter les commandes de l'écran pilote indique la nécessité d'une optimisation des paramètres de sélection ou appuyez sur la cueillette.

Representative Results

L'utilisation d'un système d'expression inductible par la tétracycline permet un contrôle pratique interne pour distinguer Tl ⁺ flux à travers les voies endogènes et le canal Kir d'intérêt. Figure 1 montre quelques exemples de cartes de placage de cellules utilisées dans différents types d'expériences. Les positions des puits contenant les cellules non induites ou induite par la tétracycline sont indiquées par des couleurs différentes. Figure 2A représente la carte de plaque de source utilisée pour déterminer la concentration optimale Tl ⁺ pour le développement et le criblage de composés d'essai. Le gradient de couleur représente la série de dilutions 3-pli allant de 100% à 0,002% Tl ^+. Une carte représentant l'intensité de fluorescence est montré dans la figure 2B, avec froid au chaud couleurs indiquant moins cher au plus haut les valeurs Tl ⁺ de flux, respectivement. La carte placage cellule représentée sur la figure 1C a été utilisé pour cette expérience. Un ajustement d'une fonction logistique à 4 paramètres à til Tl ⁺ CRC (figure 2C) est utilisée pour déterminer une valeur de CE ₈₀ à 15% Tl ^+. figure 3A montre la carte plaque de source utilisée pour déterminer la tolérance DMSO d'un essai. Colonnes 1 et 24 contiennent uniquement du tampon de dosage, tandis que le gradient de couleur indique la série de dilutions 2-pli allant de 10% à 0,01% de DMSO. Une carte représentant l'intensité de la fluorescence est montré sur la figure 3B, avec de faibles valeurs de flux Tl ⁺ marqués d'un bleu plus foncé. La carte placage cellule représentée sur la figure 1B a été utilisé dans cette expérience. Les moyens Tl ⁺ valeurs de flux enregistrés dans les puits contenant les concentrations indiquées de DMSO sont résumées dans la figure 3C. Les données sont représentées par le pourcentage de Tl ⁺ flux enregistré en l'absence de DMSO. Pour ce canal particulier Kir, DMSO concentrations allant jusqu'à 2,5% n'a eu aucun effet sur ​​les flux de Tl ⁺ et peuvent donc être utilisés dans des expériences. Figure 4A montre la carte plaque de source utilisée pour établir courbes concentration-réponse pour les inhibiteurs connus d'un canal Kir. Chaque composé est indiqué par une couleur différente et est généralement plaqué comme une série de dilutions de 3 fois. Une carte représentant l'intensité de la fluorescence est illustré à la figure 4B. La carte placage cellule représentée sur la figure 1C a été utilisé pour cette expérience. Une expérience représentative montrant l'inhibition dose-dépendante de Tl ⁺ flux par un inhibiteur est représenté sur la figure 4C. La robustesse d'un test est déterminée dits «damier» des essais, qui sont résumées dans la figure 5. Dans la plaque de la carte de source indiqué sur la figure 5A, une concentration maximale efficace d'un inhibiteur ou le DMSO 0,1% comme une commande de véhicule sont étalées en alternance des puits. Figure 5B montre une carte d'intensité représentative de fluorescence. Un diagramme de dispersion du pic de Tl ⁺ flux enregistrés à partir individusal puits est représentée sur la figure 5C. Les valeurs moyennes de fluorescence sont indiqués avec ligne continue, alors que 3 écarts-types sont indiqués par une ligne pointillée. Le Premier valeur Z, une mesure statistique de la façon dont a séparé les deux populations cellulaires sont séparés, calculé pour cette plaque est de 0,75, ce qui est bien au-dessus du seuil de 0,5 nécessaire pour criblage à haut débit.

Figure 1. Cartes de placage cellulaires utilisées pour le développement de tests Tl ⁺ de flux. (A) Carte placage de cellules utilisent pour déterminer le dosage optimal Tl ⁺ concentration. Les puits de la colonne 1, lignes A1-23, K1-12, F13-23 et P13-23 contiennent des cellules non induites (-Tet). Les autres puits contiennent des cellules qui ont été traitées avec de la tétracycline (Tet +) pour induire l'expression du canal Kir. (B) Cell plate carte utiliser pour déterminer la tolérance DMSO test et effectuer des analyses en damier. Notez que tous les puits sont traités avec de la tétracycline (Tet +). (C) carte plaque de cellule utilisée pour déterminer la sensibilité du test de modulateurs pharmacologiques connus. Les puits de la colonne 1 et la ligne A1-23 contiennent des cellules non induites (-Tet). Les autres puits contiennent des cellules qui ont été traitées avec de la tétracycline (Tet +). Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 2. Détermination de dosage optimal Tl ⁺ concentration. (A) Carte Source plaque utilisée pour déterminer la concentration Tl ^+, qui évoque environ 80% de l'maximal FluoZin-2 fluorescence augmentation (CE _80). Ligne A et columns 1 et 24 (jaune) contiennent une concentration de 5 x 12 mm LT ₂ SO _4. Les autres lignes contiennent une série de dilutions de 3 fois allant de 12 mM (100%) à 0,024 mm (0,002%) Tl ₂ SO _4. La série est répété dans les colonnes 2-12 et 13-23. (B) Carte illustrant l'intensité de fluorescence Tl ⁺ de flux pour chaque puits d'environ 1 min après Tl ⁺ plus. La barre de pseudo-couleurs sur la droite indique l'étendue de Tl ⁺ de flux, avec des couleurs plus froides et chaudes représentant des valeurs de flux faible et élevée, respectivement. Notez que les couleurs froides dans la colonne 1, lignes A1-23, K1-12, F13-23 et P13-23 sont dus à bas Tl ⁺ de flux dans les cellules non induites. Les puits restants, y compris celles de la colonne 24, contiennent des cellules qui ont été traitées avec de la tétracycline pour induire l'expression du canal Kir (voir la carte placage cellule de la figure 1A). (C) Moyenne ± SEM CRC pour Tl ^{+-dépendantes} des changements dans la fluorescence (n = 3). Mise en place d'une fonction logistique à quatre paramètrestion des données a donné un IC ₈₀ Valeur de 15% Tl ^+. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 3. Essai de tolérance au DMSO. (A) Carte plaque de source utilisée pour déterminer la tolérance d'essai au DMSO. Les colonnes 1 et 24 contiennent un tampon de dosage HBSS. Les lignes contiennent une concentration d'une série 2x 2-dilution DMSO allant de 10% à 0,01% v / v (B) représentant l'intensité de fluorescence carte illustrant Tl ⁺ flux dans chaque puits a enregistré environ 1 min après Tl ⁺ plus. La barre de pseudo-couleurs sur la droite indique l'étendue de Tl ⁺ de flux, avec des couleurs plus froides et chaudes représentant des valeurs de flux faible et élevée, respectivement. (C) moyenne ±, SEM (n = 9) Tl ⁺ flux normalisé à celui enregistré en présence de tampon de dosage HBSS seul. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 4. La sensibilité du dosage de composés connus pharmacologiquement actives. (A) Carte plaque de source utilisé pour évaluer l'activité des composés connus pharmacologiquement actives dans la Tl ⁺ test de flux. La ligne A et des colonnes 1 et 24 contiennent 0,1% v / v de DMSO. La disposition de la plaque permet de tester des composés 10 en trois exemplaires dans les colonnes 2-23. Les lignes contiennent une concentration 2x d'une série de 3 fois dilution en série de composés allant de 100 uM à 2 nM (B) Carte illustrant l'intensité de fluorescence Tl ⁺ de flux pour chaque puits approximately 1 min après Tl ⁺ plus. La barre de pseudo-couleurs sur la droite indique l'étendue de Tl ⁺ de flux, avec des couleurs plus froides et chaudes représentant des valeurs de flux faible et élevée, respectivement. Notez que les puits de la colonne 1 et la ligne A1-23 contiennent des cellules non induites. Les autres puits contiennent la tétracycline induites par les cellules exprimant le canal Kir d'intérêt (voir la carte plaque de cellule dans la figure 1C). (C) représentant Tl ⁺ induit des changements dans FluoZin-2 de fluorescence dans les puits pré-traitées avec la concentration indiquée d'un inhibiteur des canaux Kir. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 5. Détermination de l'aptitude d'essai pour HTS. Plaque de source (a)carte utilisée pour évaluer la variabilité et à bien entre les puits contenant 0,1% (véhicule) de DMSO ou une concentration maximale efficace d'un inhibiteur connu. (B) Carte illustrant l'intensité de fluorescence Tl ⁺ flux dans chaque puits d'environ 1 min après Tl ⁺ plus. Notez que tous les puits contiennent la tétracycline induites par les cellules exprimant le canal Kir d'intérêt (voir la carte plaque de cellule dans la figure 1B). (C) nuage de points représentant des valeurs de fluorescence en régime permanent obtenu à partir de puits ou d'un inhibiteur de véhicules-traité. L'amplitude moyenne de fluorescence de chaque échantillon de la population est indiquée par un trait plein, 3 écarts-types de la moyenne est représentée par une ligne pointillée, et des échantillons en alternance pour véhicule (VHL) et de l'inhibiteur (INH) sont représentées sous différents points. Cliquez ici pour Agrandir la figure .

Discussion

Traitement des données: Une fois les données recueillies, une étape commune dans l'analyse consiste à normaliser réponse de fluorescence de chaque puits, F, à sa valeur initiale au début de l'expérience, F _0. Ceci est communément appelé le "rapport statique» et symbolisé "F / F ^_0". Dans le cas où F ₀ est dominé par le colorant indicateur du fonctionnement rapport statique pour corriger sensiblement nombreux facteurs tels que disuniformities l'éclairage, la collecte du signal, nombre de cellules et. Dans le cas où le signal est faible ou colorant fluorescence de fond ou de réflexions dans le système sont élevés, le rapport statique ne sera pas efficace à moins que le contexte ne peut être traité de façon appropriée avant de calculer le rapport statique. Après la normalisation des données, il est typique pour réduire la forme d'onde de fluorescence à une seule valeur qui sera utilisée pour quantifier l'activité et prendre hits. Le plus souvent, ce sera fait en ajustant les donnéesdes points dans les 10 secondes après l'addition de Tl ⁺ pour obtenir une pente initiale de l'augmentation de fluorescence provoquée. Pour la cueillette succès, une approche populaire est de supposer que la grande majorité des composés dans la population test sont inactifs (l'hypothèse nulle est en vigueur). Une moyenne et l'écart type est calculé pour la population de test et les coups sont sélectionnées qui sont trois écarts-types de la moyenne.

Fractionnement du protocole pour les incubations longues composées: Pour la détection des inhibiteurs des canaux Kir, en particulier ceux qui agissent au intracellulaires sites de liaison, il peut être utile d'incuber les cellules avec des composés d'essai pendant une période de temps prolongée (par exemple 20 min) avant l'ajout de Tl ^+. Si les composés sont ajoutés "offline" avant l'essai est introduit dans le lecteur de plaque, les propriétés optiques des composés d'essai (fluorescence, par exemple) ne peuvent pas être facilement reconnaissable et peut nuire couramment utilisénormalisation des données approches telles que le "rapport statique" F / F ₀ décrit ci-dessus résulte des faux positifs et / ou faux négatifs. Pour éviter ce problème, tout en évitant d'avoir à maintenir une plaque d'essai à un lecteur pour une longue période d'incubation, une solution consiste à utiliser un «deux en lecture" protocole. La lecture est une première courte (par exemple 30 secondes) expérience où le composé est ajouté, après 10 secondes pour permettre la capture de l'addition pré-composé F ₀ et à évaluer les effets des composés «optiques du système. La plaque est ensuite retirée du lecteur et incubées pendant la période souhaitée et renvoyé au lecteur pour plus de thallium. Après deux lectures sont terminées, la première lecture F ₀ peuvent être utilisés pour normaliser les données de la deuxième lecture afin d'éviter de nombreux problèmes liés à l'ajout de composés «hors ligne», tout en permettant la possibilité de garder le lecteur occupé à rassembler un débit de données de dépistage améliorant ainsi. L'approche à deux en lecture est plus facile implemdonné lors de l'utilisation d'un système de contrôle automatisé. Il est important de noter que l'approche à deux lecture ne va pas éliminer les problèmes causés par des composés fluorescents qui saturent le détecteur et / ou causer de lecture des artefacts dans la caméra CCD.

Configuration d'un test pour des activateurs: Pas tous les canaux Kir sont au maximum activé dans des conditions de repos, il sera donc possible de concevoir un test qui permet de détecter de petites molécules activateurs. Dans ces cas, la sélection d'une CE ₈₀ concentration de Tl ⁺ ne peut pas fournir assez de "marge" pour le dosage de détecter de façon fiable activateurs. Ainsi, on peut choisir d'utiliser une concentration plus faible de Tl ⁺ (par exemple CE ₂₀₎ dans des essais d'activateur. Dans certains cas, l'analyse peut montrer faible variabilité suffisante pour permettre l'utilisation d'une concentration de ₅₀ CE Tl ⁺ et encore fournir une résolution adaptée à la fois actif et inhibe populations de canal. Dans ce cas, le test may être réalisée en double activateur / inhibiteur de la mode. Lorsque disponible, un activateur connu peut être utilisé pour aider à déterminer la concentration appropriée Tl ⁺ afin de maximiser les chances de découvrir des activateurs de canaux.

Limitations: Il ya quelques limitations qui devraient être considérés lors de l'élaboration et de l'exécution d'un Tl ⁺ basé sur les flux à haut débit écran. Par exemple, l'essai repose sur une mesure indirecte de l'activité des canaux Kir utilisant une sonde fluorescente dont les propriétés optiques pourraient être directement touchés par les composés dans un écran. Par conséquent, d'importantes observations de Tl ⁺ expériences de flux doivent être confirmés à l'aide voltage clamp électrophysiologie, qui est considéré comme le «gold standard" méthode pour la pharmacologie des canaux ioniques. En outre, les petites molécules peuvent avoir des effets directs sur les voies endogènes Tl ⁺ de flux exprimés en cellules HEK-293, conduisant à l'identification de faux positifs hits. La tétracyclinee-inductible système est particulièrement utile pour distinguer des faux positifs hits de Kir-canal dirigé modulateurs parce que les coups peuvent être rapidement sélectionnés dans les cellules non induites pour les effets sur les voies endogènes. Enfin, la faible solubilité de Tl ⁺ dans des tampons contenant du chlorure de limiter la concentration de Tl ⁺ qui peut être utilisée dans un test, nécessitant l'utilisation d'un tampon non physiologique Tl ⁺ stimulus qui peut augmenter la pharmacologie de la cible ^11. La compatibilité des différents tampons avec l'objectif d'intérêt doivent être soigneusement évalués au cours du développement dosage. Cela peut être fait en mettant en place des CRC pour des modulateurs connus en utilisant différents tampons de relance Tl ⁺ et en choisissant des conditions dans lesquelles la pharmacologie correspond le mieux à celle observée en utilisant des tampons physiologiques.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
pcDNA5/TO	Invitrogen	V1033-20	Tetracycline-inducible expression vector
T-REx-HEK293 cells	Invitrogen	R71007	Tetracycline-inducible cell line
Lipofectamine LTX/Plus Reagent	Invitrogen	15338100	Transfection reagent
FBS	ATLANTA Biologicals	S11550	Cell culture media
DMEM	Invitrogen	11965	Cell culture media
Hygromycin B	Invitrogen	10687-010	Cell culture media
Blasticidin S	Invitrogen	R210-01	Cell culture media
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140	Cell culture media
HBSS-divalent free	Mediatech	21022CV	Cell washing
Trypsin-0.25%	Mediatech	25053CI	Cell dissociation
Tetracycline-HCl	Sigma	T9823	Induction reagent
Dialyzed FBS	ATLANTA Biologicals	S12650	Plating media
FluoZin-2	Invitrogen	F24189	Fluorescent dye
Pluronic F-127	Invitrogen	P-3000MP	Dye loading
HBSS	Invitrogen	14175	Assay buffer
HEPES	Invitrogen	15630	Assay buffer
NaHCO3	Sigma	S6297	Tl+ stimulus buffer
MgSO4	Sigma	M2643	Tl+ stimulus buffer
CaSO4∙2H2O	Sigma	C3771	Tl+ stimulus buffer
D-Glucose	Sigma	G7528	Tl+ stimulus buffer
Thallium sulfate	Aldrich	204625	Tl+ stimulus buffer
HEPES	Sigma	H4034	Tl+ stimulus buffer
DMSO	Sigma	D4540	Solvent
Eight-channel electronic pipettor	Biohit	E300	Cell plating in 384-well plates
BD PureCoat amine-coated 384-well plates	BD Biosciences	356719	Assay microplates
Echo qualified 384-Well polypropylene microplate (384PP)	Labcyte	P-05525	Compound source microplates
384-well polypropylene microplates	Greiner Bio-One	781280
Multidrop Combi reagent dispenser	Thermo Scientific	5840300
ELx405 microplate washer	BioTek	ELx405HT	Automated cell washing
Echo liquid handler	Labcyte	Labcyte Echo 550
Bravo automated liquid handling platform	Agilent Technologies	Standard model
Hamamatsu FDSS 6000	Hamamatsu		Kinetic imaging plate reader
Table 1. List of Materials and Reagents.