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Biology

आवक करनेवाला पोटेशियम चैनल के छोटे अणु Modulators के लिए उच्च throughput स्क्रीनिंग

Published: January 27, 2013 doi: 10.3791/4209
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1,2
1Department of Pharmacology, Vanderbilt University School of Medicine, 2Department of Anesthesiology, Vanderbilt University School of Medicine, 3Vanderbilt Institute of Chemical Biology, Vanderbilt University School of Medicine

ERRATUM NOTICE

Summary

आवक सही करनेवाला (कीर) पोटेशियम उच्च throughput यौगिक स्क्रीनिंग के लिए चैनलों की गतिविधि को मापने के लिए एक मात्रात्मक प्रतिदीप्ति परख के लिए विकासशील और मान्य तरीके प्रस्तुत किया है.

Protocol

1. स्थिर पॉलीक्लोनल सेल लाइन्स का सृजन

  1. एक उच्च गुणवत्ता स्थिर सेल लाइन ब्याज की कीर चैनल व्यक्त की स्थापना एक मजबूत उच्च throughput स्क्रीनिंग परख के विकास की ओर एक महत्वपूर्ण पहला कदम है. विधान कश्मीर + चैनल overexpression कोशिका मृत्यु रास्ते, स्थिर सेल लाइन अध: पतन और परख प्रदर्शन के नुकसान की सक्रियता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. इन संभावित समस्याओं से बचने के लिए और परख के विकास के लिए एक सुविधाजनक आंतरिक नियंत्रण (नीचे देखें) प्रदान करते हैं, एक टेट्रासाइक्लिन-inducible अभिव्यक्ति प्रणाली 8 सिफारिश की है.
  2. संस्कृति माता पिता टी - रेक्स - HEK293 कोशिकाओं बी मध्यम (DMEM मध्यम विकास 10% FBS, 50 यू / मिलीलीटर पेनिसिलिन, 50 स्ट्रेप्टोमाइसिन ग्राम / मिलीग्राम और 5 ग्राम / एमएल Blasticidin एस युक्त) में मानक तकनीक का उपयोग कर. अभिकर्मक और स्थिर क्लोन चयन के लिए जल्द पारित कोशिकाओं (तरल नाइट्रोजन भंडारण से विगलन के बाद से जैसे 3-4 मार्ग) का प्रयोग करें.
  3. प्लेट 4 मिलियन में टी - रेक्स HEK293 कोशिकाओं75 सेमी 2 फ्लास्क कि फ्लास्क लगभग 80% अगले दिन मिला हुआ है. 37 में एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में रातोंरात संस्कृति डिग्री सेल्सियस
  4. निर्माता प्रोटोकॉल अनुसार pcDNA5/TO-Kir डीएनए के 10-15 ग्राम और Lipofectamine अभिकर्मक / LTX प्लस का उपयोग कोशिकाओं transfect. 5 घंटे के बाद, बी मध्यम के साथ अभिकर्मक माध्यम की जगह.
  5. अभिकर्मक के बाद 24 घंटा, बी मध्यम 250 छ / मिलीलीटर hygromycin (BH मध्यम) स्थिर क्लोन चयन शुरू युक्त के साथ बी माध्यम की जगह. कोशिकाओं को हर 2-3 दिन फ़ीड ताजा BH मध्यम के साथ.
  6. कोशिकाओं के 90% से अधिक अगले 7 दिनों में मरने, stably ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की छोटी कालोनियों के पीछे छोड़ने चाहिए. कालोनियों के बंटवारे से पहले एक अतिरिक्त 10-14 दिनों के लिए विस्तार के लिए 175 सेमी 2 फ्लास्क विकसित करने के लिए अनुमति दें.
  7. Cryopreservation के लिए, 3 फ्रीज x 10 6 कोशिकाओं / 45% वाले मीडिया में मिलीग्राम BH मध्यम, 45% एंटीबायोटिक मुक्त, सीरम युक्त DMEM और 10% DMSO वातानुकूलित. स्थिर-80 में रातोंरात कोशिकाओं ° एक सेल ठंड कंटेनर में सी और फिर लंबी अवधि के भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन करने के लिए कदम. पिघलना को तरल नाइट्रोजन से कोशिकाओं Invitrogen सिफारिश की प्रोटोकॉल का उपयोग. ध्यान दें कि कोशिकाओं की व्यवहार्यता कम हो सकता है अगर वे एक फ्लास्क कि प्रसंस्करण के समय में अधिक से अधिक 75% सहधारा से जमे हुए हैं.

2. स्थिर मोनोक्लोनल सेल लाइन्स का सृजन

  1. एक उप सहधारा द्विसंयोजक मुक्त HbSS साथ स्थिर पॉलीक्लोनल कोशिकाओं के 75 सेमी 2 फ्लास्क धो लें. एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 3-5 मिनट के लिए 37 बजे trypsin और सेते 1 मिलीलीटर जोड़ें डिग्री सेल्सियस कुप्पी BH-मध्यम के 5 मिलीलीटर जोड़ें trypsin गतिविधि को बाधित करने और बार बार महीन चुर्ण बनाना (उदाहरण के लिए, 5 बार) के लिए पूरी तरह से कोशिकाओं को अलग कर देना. ध्यान से एक खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं का निरीक्षण करने के लिए सुनिश्चित करें निलंबन एकल कक्षों के लगभग पूरी तरह से होते हैं. इस मोनोक्लोनल सेल लाइनों प्राप्त करने की संभावना बढ़ जाएगी.
  2. सेल घनत्व निर्धारण और पतला20 μl प्रति 0.7 कोशिकाओं के एक एकाग्रता के लिए निलंबन. BD amine लेपित PureCoat (या समतुल्य लेपित पाली-D-lysine) 384 अच्छी तरह प्लेटें प्रत्येक कुएं में एक मल्टी चैनल pipettor, सेल निलंबन के 20 μl विंदुक का उपयोग करना. सिद्धांत रूप में, कुओं का 70% इन चढ़ाना शर्तों के साथ एक सेल प्राप्त करना चाहिए. इस प्रकार, एक थाली 384 अच्छी तरह से 200 से अधिक का विश्लेषण करने के क्लोन को शामिल करना चाहिए. 37 में एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में कोशिकाओं संवर्धन ° सी. जारी
  3. एक सप्ताह के बाद, एकल कालोनियों वाले कुओं के लिए एक खुर्दबीन के नीचे प्लेटों का निरीक्षण किया. भविष्य में संदर्भ के लिए एक स्थायी मार्कर के साथ अपने ढक्कन पर स्थिति पर ध्यान दें. यह भी ध्यान रखें और कई कालोनियों युक्त कुओं बाहर रहो. इन सबसे आसानी से अच्छी तरह के कई पक्षों से बढ़ कालोनियों की उपस्थिति के द्वारा मान्यता प्राप्त हैं. ध्यान रखें कि वाष्पीकरण प्लेट के किनारे के पास कुओं से अधिक जल्दी हो जाता है. BH मध्यम कुओं जहां महत्वपूर्ण वाष्पीकरण हुई है. अन्यथा, यह अनावश्यक है टीओ कोशिकाओं फ़ीड.
  4. कुओं अगले 7-10 दिनों के दौरान अधिक बार मॉनिटर. कोशिकाओं को विभाजित करने के लिए करना है जब ब्याज के कुओं सहधारा हैं कम से कम 50% के लिए तैयार हो जाएगा.
  5. कोशिकाओं को विभाजित करने के लिए 384 अच्छी तरह प्लेटें नकल, संस्कृति में मोनोक्लोनल लाइनों के लिए जारी रखने के लिए Tl + प्रवाह और अन्य के साथ परख करने की क्रिया के लिए एक थाली. ब्याज की सेल लाइनों युक्त कुओं से मध्यम Aspirate. द्विसंयोजक मुक्त HbSS साथ कोशिकाओं धो, प्रत्येक के लिए 20 trypsin के μl में अच्छी तरह से जोड़ने और एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 15-20 मिनट के लिए थाली हस्तांतरण. प्लेट सेल संस्कृति हुड के लिए वापस करने के बाद, एक अच्छी तरह से करने के लिए BH-मध्यम के 20 μl जोड़ सकते हैं और कई बार महीन चुर्ण बनाना करने के लिए कोशिकाओं को अलग कर देना. यह सुनिश्चित करने के लिए कोशिकाओं को पूरी तरह अलग हैं खुर्दबीन के नीचे कुओं का निरीक्षण किया. Pipetting के कई दौर की आवश्यकता होती है, के रूप में कोशिकाओं को कसकर पक्षपाती हो जाएगा हो सकता है. एक बार कोशिकाओं को अलग कर रहे हैं, प्रत्येक कोशिका निलंबन के 10 μl हस्तांतरण करने के लिए एक नया बी.डी. PureCoat amine लेपित 38 के कुओं नकलथाली 4-अच्छी तरह से. स्रोत के बीच के रिश्ते को अच्छी तरह से ध्यान दें और डुप्लिकेट गंतव्य कुओं क्लोनों मजबूत कीर चैनल गतिविधि (नीचे देखें) का प्रदर्शन इतना है कि मूल अच्छी तरह से पता लगाया जा सकता यकीन. मूल स्रोत अच्छी तरह से करने के लिए शेष कोशिकाओं को खिलाने के लिए और उन्हें संस्कृति में जारी 37 में 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में डिग्री सेल्सियस BH माध्यम के 20 μl जोड़ें
  6. गंतव्य थाली में कोशिकाओं का पालन करने के लिए एक सप्ताह के लिए बढ़ने की अनुमति दें. क्लोनों की सबसे एक बार कम से कम 50% संगम तक पहुँचने, वे कीर चैनल Tl उपयोग गतिविधि के लिए मूल्यांकन किया जा सकता है + प्रवाह परख नीचे वर्णित है.
  7. परख पहले दिन, संस्कृति के माध्यम aspirate और यह BH 10% dialyzed FBS युक्त मध्यम के साथ बदलें. यह अनजाने चैनल अभिव्यक्ति है कि टेट्रासाइक्लिन दूषित सीरम से पैदा हो सकता है रोकता है. केवल 1 ग्राम / एमएल टेट्रासाइक्लिन सहित प्रत्येक क्लोन के लिए डुप्लिकेट कुओं में से एक में कीर चैनल अभिव्यक्ति को प्रेरित. अच्छी तरह से uninduced लाँगफ़ॉर्म एक के रूप में की सेवा करेंगेनियंत्रण "पृष्ठभूमि". + Tl प्रवाह assays के रूप में अगले वर्णित प्रदर्शन.

3. जनरल Tl + फ्लक्स परख प्रक्रिया

  1. एक TL से पहले दिन + प्रवाह प्रयोग, कोशिकाओं को अलग कर देना और quantitate सेल निलंबन के घनत्व के रूप में 2.1 वर्गों और 2.2 में वर्णित है. प्लेट 20,000 मोनोक्लोनल कोशिकाओं stably एक BD PureCoat amine लेपित 384 अच्छी तरह से एक थर्मो multidrop कोम्बी या एक pipettor मल्टी चैनल का उपयोग कर थाली में से प्रत्येक में अच्छी तरह से एक कीर चैनल ब्याज की जीन के साथ ट्रांसफ़ेक्ट. BH चढ़ाना के लिए 10% dialyzed FBS युक्त मध्यम का प्रयोग करें. ध्यान दें कि कुछ कोशिकाओं 1 ग्राम / मिलीलीटर टेट्रासाइक्लिन के साथ रात भर सुसंस्कृत कीर चैनल अभिव्यक्ति को प्रेरित है, जबकि दूसरों को नहीं. स्थान प्रेरित और uninduced कोशिकाओं के प्रयोग के प्रत्येक प्रकार के लिए अलग और चित्र 1 में दिखाया जाएगा.
  2. अगले दिन, एक खुर्दबीन के नीचे प्लेटों का निरीक्षण करने के लिए यह सुनिश्चित करना है कि कोशिकाओं को पक्षपाती हैं और समान नीचे भर में वितरितकुओं की. कुओं 80-90% सहधारा हो चाहिए.
  3. एक ELx405 Microplate वॉशर का उपयोग करने के लिए 20 फीसदी की अच्छी तरह HbSS परख 20 मिमी HEPES युक्त बफर μl के साथ सेल संस्कृति माध्यम की जगह और NaOH साथ 7.3 पीएच buffered. वैकल्पिक रूप से, एक एक झटका और स्लैम "विधि का उपयोग करें, जिसमें थाली उल्टा और तेजी से नीचे बोले एक कचरे के कंटेनर में मध्यम बेदखल करना है, और फिर stacked कागज तौलिए पर पीठ थपथपाई शेष मीडिया को दूर कर सकते हैं. तुरंत वापस थाली HbSS परख बफर desiccating से कोशिकाओं को रोकने जोड़ने.
  4. FluoZin-2 तैयार है, डाई लोड हो रहा समाधान AM. संक्षेप में ट्यूब centrifuging के बाद, निर्जल DMSO के 100 μl में FluoZin-2 पाउडर के 50 ग्राम भंग. इस बिंदु पर, 1000 x स्टॉक समाधान की aliquots -20 डिग्री सेल्सियस पर बाद में उपयोग के लिए भंडारित किया जा सकता है. जब का उपयोग करने के लिए तैयार है, डाई और कोमल pipetting साथ मिश्रण करने के लिए मात्रा Pluronic F-127/DMSO समाधान के प्रति एक 20% वजन के 50 μl जोड़ें. फ्रीज एक बार F-127 Pluronic जोड़ा गया है के रूप में नहीं, डाईsurfactant समाधान का वेग कम तापमान के कारण हो सकता है. 150 μl FluoZin-2 की मात्रा, HbSS परख बफर के AM/Pluronic-F127 100 मिलीलीटर जोड़ें और धीरे मिश्रण करने के लिए डाई लोड बफर बनाने. एक multidrop कोम्बी या मल्टी चैनल pipettor का उपयोग करना, प्रत्येक पहले से ही अच्छी तरह से युक्त HbSS परख बफर के 20 μl डाई लोड बफर के 20 μl जोड़ने. लगभग 1 घंटा (आमतौर पर अंधेरे में ऊष्मायन किया गया किया गया है, हालांकि वहाँ कोई प्रत्यक्ष प्रमाण नहीं है कि यह जरूरी है है) के लिए कमरे के तापमान पर कोशिकाओं सेते हैं.
  5. जबकि कोशिकाओं डाई के साथ लोड कर रहे हैं, एक Tl + प्रोत्साहन थाली तैयार करते हैं. हौसले 5x Tl + प्रोत्साहन 1 मिमी मैग्नीशियम सल्फेट, 1.8 मिमी कैल्शियम सल्फेट, 5 मिमी ग्लूकोज, 10 मिमी HEPES और 12 मिमी सल्फेट + ​​Tl युक्त बफर के 50 मिलीलीटर में 0.5 ग्राम सोडियम बाइकार्बोनेट भंग. वैकल्पिक रूप से, सोडियम बिकारबोनिट सोडियम gluconate के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है अगर, उदाहरण के लिए, समाधान पीएच एक बहुत ही संकीर्ण और कार्बन डाइऑक्साइड की सीमा घटाने के भीतर रखा जाना चाहिएएक चिंता का विषय है. ट्यूब कस कैप कार्बन डाइऑक्साइड के भागने की सीमा और कई बार पलटना तक सोडियम बिकारबोनिट समाधान में चला जाता है. एक pipettor मल्टी चैनल का उपयोग करते हुए, एक polypropylene 384 अच्छी तरह से थाली (1 टेबल) के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए समाधान के 50 μl जोड़ें.
  6. बाद कोशिकाओं FluoZin-2 के साथ लोड किया गया है, AM, एक ELx405 Microplate वॉशर के साथ प्लेटें धोने या "झटका और स्लैम" विधि का उपयोग कर के रूप में 3.3 अनुभाग में ऊपर वर्णित है. Tl + प्रवाह के लिए किया जा प्रयोग के प्रकार पर निर्भर करता है, वापस 20 μl या HbSS परख हर अच्छी तरह से करने के लिए बफर के 40 μl जोड़ें. प्लेटें अब प्रयोगों के लिए तैयार कर रहे हैं.
  7. सेल और Tl एक हमामात्सू कार्यात्मक दवा स्क्रीनिंग सिस्टम (FDSS) या समकक्ष एकीकृत तरल वितरण क्षमताओं के साथ गतिज इमेजिंग प्लेट पाठक में प्लेटें. Fluo-4 के रूप में / fluorescein fluorescein आधारित रंगों के लिए उपयुक्त फिल्टर का उपयोग करें.
  8. एक ऐड - प्रोटोकॉल सेट है कि 10 μl 5x Tl इतना +श्रृंखला सेल HbSS परख बफर के 40 μl युक्त थाली की इसी कुओं को जोड़ा जाता है. एक 1 हर्ट्ज आवृत्ति नमूना में कम से कम 10 सेकंड के लिए रिकॉर्ड आधारभूत प्रतिदीप्ति. अच्छी तरह से करने के लिए अच्छी तरह से प्रतिदीप्ति वर्दी और स्थिर थाली भर में हो सकता है एक बार इष्टतम सेल चढ़ाना धोने, और डाई लोड की स्थिति स्थापित कर रहे हैं चाहिए. एक एकीकृत 384 चैनल pipettor करने के लिए एक साथ एक अच्छी तरह से Tl + प्रोत्साहन बफर जोड़ने के लिए प्रयोग किया जाता है.
  9. इतना है कि कम से कम 2 मिनट के लिए रिकॉर्ड दर और प्रतिदीप्ति में वृद्धि प्रेरित Tl के शिखर बंद लाइन के विश्लेषण के लिए कब्जा कर लिया है.

4. इष्टतम Tl + एकाग्रता का निर्धारण

  1. Tl + आसानी से सबसे आवक सही करनेवाला कश्मीर + चैनलों permeates. सुनिश्चित करें कि Tl + सांद्रता Tl के गतिशील रेंज से अधिक नहीं होनी + संवाददाता डाई FluoZin-2, एक empirically इष्टतम Tl + एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए एक उच्च टी में इस्तेमाल किया जा चाहिएhroughput स्क्रीन. हम एक TL + एकाग्रता है कि स्थिति है जहां चैनल ज़्यादा से ज़्यादा सक्रिय है, के तहत अधिक से अधिक प्रतिदीप्ति प्रतिक्रिया (80 ईसी) की 80% उदाहरण भी देते हैं सलाह देते हैं.
  2. प्लेट, डाई लोड और BD PureCoat amine लेपित या समकक्ष पाली-D-lysine लेपित 384 अच्छी तरह प्लेटें में कोशिकाओं धोने के रूप में 3 खंड में ऊपर वर्णित है, प्रत्येक अच्छी तरह से में HbSS परख बफर के 40 μl छोड़ने. के रूप में चित्रा 1 ए, 1 स्तंभ और पंक्तियों A1-A23 कोशिकाओं है कि टेट्रासाइक्लिन के साथ प्रेरित नहीं किया गया है और इसलिए ब्याज की कीर चैनल व्यक्त नहीं शामिल करना चाहिए में थाली नक्शे में दिखाया गया है. से FluoZin uninduced कुओं 2 प्रतिदीप्ति संकेतों ना के रूप में अंतर्जात रास्ते, के माध्यम से Tl + प्रवाह के स्तर का निर्धारण किया जाएगा + K +-ATPase पंप ​​और वोल्टेज gated कश्मीर + चैनल, जो सामान्य रूप में व्यक्त कर रहे हैं HEK 293 कोशिकाओं.
  3. एक Agilent ब्रावो स्वचालित तरल हैंडलिंग मंच या पुस्तिका के लिए एक तैयार pipetting का प्रयोग करेंग्यारह सूत्री Tl HbSS परख बफर में एकाग्रता कमजोर पड़ने श्रृंखला. आमतौर पर, एक 3 गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने 100% से 0.002% Tl + लेकर श्रृंखला परख में मूल्यांकन किया है. श्रृंखला एक 5x एकाग्रता पर बना होना चाहिए क्योंकि Tl + समाधान अंतिम परख में 01:05 पतला. मानक 5x Tl + एक 5x Tl +-1 मिमी मैग्नीशियम सल्फेट, 1.8 मिमी कैल्शियम सल्फेट, 5 मिमी ग्लूकोज और 10 मिमी HEPES युक्त बफर के साथ धारा 3 में वर्णित बफर गिराए के द्वारा कमजोर पड़ने श्रृंखला तैयार. फिर, हौसले से अंतिम Tl + बफर के 50 मिलीलीटर में 0.5 ग्राम सोडियम बाइकार्बोनेट तुरंत चढ़ाना पहले थाली चित्रा 2A में दिखाया नक्शे के अनुसार भंग 384 अच्छी तरह से थाली polypropylene में.
  4. FDSS में सेल और Tl + प्रोत्साहन प्लेटें लोड. एक ऐड - प्रोटोकॉल इतना तय है कि 10 μl 5x Tl श्रृंखला + सेल HBS के 40 μl युक्त थाली की इसी कुओं को जोड़ा जाता हैएस परख बफर. रिकॉर्ड पहले Tl जोड़ने प्लेट + आधारभूत FluoZin 2 10 सेकंड के लिए प्रतिदीप्ति. 3 अलग दिनों पर प्रयोग के परिणामों के reproducibility स्थापित दोहराएँ.

5. परख संवेदनशीलता के DMSO के लिए दृढ़ संकल्प

  1. एक उच्च throughput स्क्रीन में पूछताछ की छोटे अणुओं कार्बनिक विलायक डाइमिथाइल (DMSO) sulfoxide है, जो खुद को परख के प्रदर्शन को प्रभावित कर सकते हैं में भंग कर रहे हैं. इसलिए, परख DMSO संवेदनशीलता पहले उच्चतम DMSO स्क्रीन में स्वीकार्य एकाग्रता की स्थापना की जांच की जाना चाहिए.
  2. प्लेट, डाई लोड और BD amine लेपित PureCoat 384 अच्छी तरह प्लेटें में कोशिकाओं धोने की धारा 3 के रूप में ऊपर वर्णित है, हर अच्छी तरह से में HbSS परख बफर के 20 μl छोड़ने. पूरी थाली कोशिकाओं है कि टेट्रासाइक्लिन (चित्रा 3A) के साथ किया गया प्रेरित किया है को शामिल करना चाहिए.
  3. एक ब्रावो स्वचालित तरल हैंडलिंग प्लेटफार्म या पुस्तिका एक ग्यारह सूत्री डी तैयार pipetting का प्रयोग करेंएमएसओ HbSS परख बफर में की एकाग्रता कमजोर पड़ने श्रृंखला. आमतौर पर, एक कमजोर पड़ने 2 गुना 10% से 0.01% v / v DMSO लेकर श्रृंखला परख में गतिविधि के लिए मूल्यांकन किया जाता है. श्रृंखला एक 2x एकाग्रता पर बना होना चाहिए क्योंकि DMSO समाधान अंतिम परख में आधे से पतला जाएगा. कमजोर पड़ने श्रृंखला 384 अच्छी तरह से थाली polypropylene में चढ़ाया प्लेट चित्रा 3A में दिखाया नक्शे के अनुसार किया जाना चाहिए.
  4. एक 5x Tl प्रोत्साहन + 80 ईसी या इष्टतम Tl + 4 अनुभाग में निर्धारित एकाग्रता पर आधारित प्लेट तैयार.
  5. FDSS में सेल, DMSO और Tl + प्रोत्साहन प्लेटें लोड. दो जोड़ने के एक प्रोटोकॉल इतना तय है कि 2x एकाग्रता DMSO श्रृंखला की 20 μl सेल HbSS परख बफर के 20 μl युक्त थाली की इसी कुओं को जोड़ा जाता है. कोशिकाओं को एक स्क्रीन के दौरान छोटे अणु वाहन को उजागर किया जाएगा समय का एक ही राशि के लिए कोशिकाओं पर DMSO छोड़ दें. रिकार्ड पर के लिए आधारभूत FluoZin 2 प्रतिदीप्तिसेल की थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से 5x Tl बफर के 10 μl जोड़ने से पहले कम से कम 10 सेकंड. 3 अलग दिनों पर प्रयोग के परिणामों के reproducibility स्थापित दोहराएँ.
  6. परख करने के लिए एक विशिष्ट उच्च throughput स्क्रीन जो यौगिकों में 10 सुक्ष्ममापी की एकाग्रता पर परीक्षण कर रहे हैं के लिए कम से कम 0.1% v / v की सांद्रता DMSO सहिष्णु होना चाहिए.

6. परख ज्ञात भेषज Modulators संवेदनशीलता का निर्धारण

  1. इष्टतम परख की TL + एकाग्रता और DMSO सहिष्णुता का निर्धारण करने के बाद, प्रभाव कीर चैनल मध्यस्थता Tl + प्रवाह पर pharmacologically सक्रिय एजेंटों जाना की जांच की जाना चाहिए. प्रयोगों की यह श्रृंखला परख संवेदनशीलता, उनकी शक्ति, प्रभावकारिता के अपने मोड (जैसे उत्प्रेरक, अवरोध करनेवाला) के आधार पर यौगिकों वर्गीकृत है, और अच्छी तरह से व्यवहार नियंत्रण यौगिकों की पहचान करने के लिए बाद में इस्तेमाल किया जा करने की क्षमता के आधार पर रैंक क्रम यौगिकों के लिए क्षमता का आकलन होगा परख घevelopment और स्क्रीन.
  2. प्लेट, डाई लोड और BD amine लेपित PureCoat 384 अच्छी तरह प्लेटें में कोशिकाओं धोने की धारा 3 के रूप में ऊपर वर्णित है, हर अच्छी तरह से में HbSS परख बफर के 20 μl छोड़ने. 1 कॉलम और A1-A23 पंक्तियों कोशिकाओं है कि टेट्रासाइक्लिन (4A चित्रा) के साथ नहीं किया गया प्रेरित किया है को शामिल करना चाहिए.
  3. एक ब्रावो स्वचालित तरल हैंडलिंग प्लेटफार्म या पुस्तिका HbSS परख बफर में जाना जाता modulators के एक एकाग्रता ग्यारह सूत्री कमजोर पड़ने श्रृंखला तैयार pipetting का प्रयोग करें. आमतौर पर, एक कमजोर पड़ने 3 गुना 100 सुक्ष्ममापी से 2 एनएम को लेकर श्रृंखला परख में गतिविधि के लिए मूल्यांकन किया जाता है. श्रृंखला एक 2x एकाग्रता पर बना होना चाहिए क्योंकि DMSO समाधान अंतिम परख में आधे से पतला जाएगा. कमजोर पड़ने श्रृंखला 384 अच्छी तरह से थाली polypropylene में तीन प्रतियों में चढ़ाया जाना चाहिए प्लेट 4A चित्र में दिखाया नक्शे के अनुसार. सुनिश्चित करें कि dilutions बना रहे हैं कि इस तरह के अंतिम DMSO सांद्रता दवा उपचार और कम था के बीच वही कर रहे हैं अधिकतम स्वीकार्य DMSO खंड 5 में परिभाषित एकाग्रता के बराबर या n.
  4. एक 5x Tl प्रोत्साहन + इष्टतम Tl + 4 अनुभाग में निर्धारित एकाग्रता पर आधारित प्लेट तैयार.
  5. FDSS में लोड सेल, मिश्रित और Tl + प्रोत्साहन प्लेटें. दो जोड़ने के एक प्रोटोकॉल इतना तय है कि 20 μl 2x एकाग्रता मिश्रित श्रृंखला सेल HbSS परख बफर के 20 μl युक्त थाली की इसी कुओं को जोड़ा जाता है. सेल प्लेट यौगिकों जोड़ें और 20 मिनट तक के लिए सेते हैं. ध्यान दें कि यौगिकों के लिए इष्टतम ऊष्मायन समय पृष्ठभूमि अनुपात सबसे अच्छा संकेत का पता लगाने प्रयोगों जहां कुछ अलग ऊष्मायन बार के लिए चुना जाता है की एक श्रृंखला चलाने के द्वारा निर्धारित किया जा सकता है. रिकॉर्ड सेल की थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से 5x Tl बफर के 10 μl जोड़ने से पहले आधारभूत FluoZin 2 कम से कम 10 सेकंड के लिए प्रतिदीप्ति. 3 अलग दिनों पर प्रयोग के परिणामों के reproducibility स्थापित दोहराएँ.
_title विश्लेषण. बिसात> 7

  1. प्रयोगों की अगली श्रृंखला में, और परख की reproducibility एकरूपता एक "बिसात" विश्लेषण का उपयोग मूल्यांकन किया जाएगा. आमतौर पर, एक नियंत्रण अवरोध करनेवाला 384 अच्छी तरह से थाली के स्तंभ प्रत्येक पंक्ति के हर दूसरे कुएं में चढ़ाया जाता है, के रूप में चित्रा 5A में दिखाया. कड़ाई से परख में शोर का आकलन करने के लिए, अवरोध करनेवाला के एक चुनाव आयोग 80 एकाग्रता किया जाना चाहिए. DMSO के एक वाहन पर नियंत्रण के रूप में अन्य कुओं को जोड़ा जाता है. Tl + में प्रवाह DMSO और दवा इलाज कोशिकाओं Z प्रधानमंत्री, कुओं की दो आबादी के बीच में अच्छी तरह से करने के लिए अच्छी तरह से परिवर्तनशीलता के एक सांख्यिकीय माप के लिए एक मूल्य की गणना करने के लिए प्रयोग किया जाता है. Z प्रधानमंत्री सूत्र का उपयोग कर की गणना की है:
    प्रधानमंत्री जेड = 1 - (3SD + पी 3SD n) / | मतलब + पी एन मतलब |
    जहां एसडी मानक विचलन है, पी uninhibited प्रवाह है और पता पूरी तरह से प्रवाह मूल्यों हिचकते है. 3 अलग दिनों पर 'जेड से अधिक या 0.5 के बराबर मूल्यों के साथ एक परख माना जाता हैउच्च throughput स्क्रीनिंग के लिए uitable.
  2. प्लेट, डाई लोड और BD amine लेपित PureCoat 384 अच्छी तरह प्लेटें में कोशिकाओं धोने की धारा 3 के रूप में ऊपर वर्णित है, हर अच्छी तरह से में HbSS परख बफर के 20 μl छोड़ने. ध्यान दें कि पूरी थाली टेट्रासाइक्लिन के साथ प्रेरित किया जाना चाहिए.
  3. एक polypropylene 384 अच्छी तरह से थाली में pipetting एक मल्टी चैनल pipettor का उपयोग कर एक प्लेट यौगिक / DMSO 80 μl / अच्छी तरह से लक्ष्य कीर 6.5 अनुभाग में निर्धारित एकाग्रता में चैनल, और 0.1% v / v DMSO एक ज्ञात अवरोध करनेवाला वाहन के रूप में चित्रा 5A में दिखाया गया है. ज्ञात अच्छी तरह से A1 में शुरू अवरोध करनेवाला पर B24 अच्छी तरह से करने के लिए pipettor मल्टी चैनल और अच्छी तरह से B2 और ऐसा करने के लिए वैकल्पिक का उपयोग कर जोड़ें. DMSO B1 में अच्छी तरह से शुरू करने और इतने पर A24 अच्छी तरह से करने के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएँ. थाली के अंतिम लेआउट एक बिसात के मैच चाहिए.
  4. एक 5x Tl + उत्तेजना इष्टतम Tl पर आधारित प्लेट + 4 अनुभाग में निर्धारित तैयार करो.
  5. लोड सेल, यौगिक और टीएल + FDSS में प्लेटें प्रोत्साहन. दो जोड़ने के एक प्रोटोकॉल इतना तय है कि 20 μl 2x एकाग्रता मिश्रित श्रृंखला सेल HbSS परख बफर के 20 μl युक्त थाली की इसी कुओं को जोड़ा जाता है. सेल प्लेट यौगिकों जोड़ें और कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए सेते हैं. रिकॉर्ड सेल की थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से 5x Tl बफर के 10 μl जोड़ने से पहले आधारभूत FluoZin 2 कम से कम 10 सेकंड के लिए प्रतिदीप्ति. 3 अलग दिनों पर प्रयोग के परिणामों के reproducibility स्थापित दोहराएँ.

8. पायलट स्क्रीन

  1. परख विकास के अंतिम चरण में, एक कुछ हजार यौगिकों के एक पायलट स्क्रीन प्रदर्शन करने की स्थिति है कि बड़े पैमाने पर उच्च throughput स्क्रीन में जा अंततः किया जाएगा के तहत परख प्रदर्शन का मूल्यांकन करने के लिए.
  2. प्लेट, डाई लोड और BD PureCoat amine लेपित 384 अच्छी तरह प्लेटें में कोशिकाओं धोने की धारा 3 में ऊपर वर्णित के रूप में), प्रत्येक अच्छी तरह से में HbSS परख बफर के 20 μl छोड़ने.ध्यान दें कि पूरी थाली टेट्रासाइक्लिन साथ रातोंरात सुसंस्कृत चाहिए कीर चैनल अभिव्यक्ति को प्रेरित.
  3. 2000 के लिए लगभग 3000 structurally विविध यौगिकों का परीक्षण किया जा चयन करें. यह अक्सर उचित और ज्ञात संभावित आयन चैनल modulators के लिए समृद्ध गतिविधियों के साथ यौगिकों संग्रह का उपयोग करने के लिए सुविधाजनक है. इस तरह के संग्रह स्पेक्ट्रम (Microsource) के संग्रह और LOPAC संग्रह (सिग्मा) शामिल हैं. इसके अलावा, यह समझदारी है पायलट स्क्रीन में ब्याज की कीर के ज्ञात modulators शामिल है. आदर्श रूप में इन यौगिकों एक अंधा फैशन में कुओं को जोड़ा जाएगा क्रम में हिट उठा बाद में वर्णित विधियों के एक निष्पक्ष परीक्षण की अनुमति. 384 अच्छी तरह polypropylene (गंतव्य प्लेटें) प्लेटें एक Labcyte इको तरल हैंडलर या उपयुक्त पिन उपकरण का उपयोग करने के लिए MLPCN संग्रह (स्रोत प्लेटें) से गंतव्य प्लेटों को DMSO में चयनित यौगिकों के उचित मात्रा हस्तांतरण में यौगिकों तैयार नोट कि परीक्षण यौगिकों केवल 3-22 स्तंभों में;1 कॉलम, 2, 23 के हर दूसरे कुएं में, 24 एक ज्ञात एकाग्रता में एक ज्ञात अवरोध करनेवाला जोड़ने के लिए पूरी तरह से कीर को बाधित रूप में धारा 7 में निर्धारित है. 1 कॉलम, 2, 23, और 24 के शेष कुओं में DMSO की उचित मात्रा में जोड़ने के लिए मिलान वाहन नियंत्रण DMSO एकाग्रता का उत्पादन. परख multidrop कोम्बी का उपयोग बफर के साथ सभी कुओं पतला. आम तौर पर परीक्षण यौगिकों उनके लक्ष्य स्क्रीनिंग एकाग्रता के ऊपर 2 गुना 20 सुक्ष्ममापी, हो जाएगा.
  4. Tl + उत्तेजना इष्टतम Tl + 4 अनुभाग में निर्धारित एकाग्रता पर आधारित प्लेटों बनाओ.
  5. पायलट स्क्रीन चलाएँ. प्रोटोकॉल निष्पादन के कदम विचलता पायलट स्क्रीनिंग के समय में प्लेटों के बीच लगातार समय बनाए रखने के लिए ध्यान रखना.
  6. एक बार पायलट स्क्रीन पूरा हो गया है, स्तंभों 1, 2, 23, और 24 समीकरण Z प्रधानमंत्री का उपयोग कर से बिसात कुओं का विश्लेषण. प्लेटें कि नियंत्रण आबादी के गरीब जुदाई के स्रोत का निर्धारण करने के लिए कम से कम 0.5 के Z प्रधानमंत्री मूल्यों को दिखाने का निरीक्षण किया. हिट्स ख कर सकते हैंई तरीकों का एक नंबर का उपयोग कर चुना. पायलट स्क्रीन के लिए यह आम बात है वाहन नियंत्रण जनसंख्या का मतलब है और मानक विचलन की गणना और वाहन नियंत्रण के माध्य से /> = 3 मानक विचलन मूल्यों उत्पादन कुओं पर आधारित हिट लेने.
  7. हिट उठा के बाद, retest में चयनित हिट प्लेटों के 2 सेट में डुप्लिकेट. प्लेटों का एक सेट टेट्रासाइक्लिन और अन्य टेट्रासाइक्लिन की उपस्थिति में स्थिर कीर सेल लाइन शामिल हैं के अभाव में स्थिर कीर सेल शामिल हैं. हिट्स है कि कम से कम दो retest प्लेटों की एक में सकारात्मक retest और uninduced प्लेटों में महत्वपूर्ण गतिविधि को दिखाने में विफल माना जा सकता है हिट सत्यापित. सत्यापित हिट करने के लिए निर्धारित "छिपा" नियंत्रण नमूनों की कितने पाया गया सूची की जांच. पायलट स्क्रीन में नियंत्रण का पता लगाने में विफलता स्क्रीनिंग या हिट उठा मापदंडों के आगे अनुकूलन के लिए की जरूरत को इंगित करता है.

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Representative Results

एक टेट्रासाइक्लिन-inducible अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग अंतर्जात रास्ते और ब्याज की कीर चैनल के माध्यम से Tl प्रवाह + भेद के लिए एक सुविधाजनक आंतरिक नियंत्रण प्रदान करता है. चित्रा 1 से पता चलता है सेल चढ़ाना प्रयोगों के विभिन्न प्रकार में इस्तेमाल नक्शे के कुछ उदाहरण. uninduced या टेट्रासाइक्लिन प्रेरित कोशिकाओं से युक्त कुओं के पदों के लिए अलग अलग रंग के साथ संकेत कर रहे हैं चित्रा 2A स्रोत थाली परख विकास और यौगिक स्क्रीनिंग के लिए इष्टतम Tl + एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए प्रयोग किया जाता नक्शे से पता चलता है. रंग ढाल 3 गुना कमजोर पड़ने 100% से 0.002% Tl लेकर श्रृंखला का प्रतिनिधित्व करता है +. चित्रा 2B में एक प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति तीव्रता नक्शा दिखाया गया है, कम करने के लिए उच्च Tl + प्रवाह मूल्यों, यह दर्शाता है शांत करने के लिए गर्म रंग के साथ. सेल चढ़ाना चित्रा 1C में दिखाया नक्शा इस प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया गया था. 4-पैरामीटर एक रसद समारोह की एक टी के लिए फिटवह Tl + सीआरसी (चित्रा 2C) के लिए 15% की एक चुनाव आयोग 80 मूल्य Tl + चित्रा. 3A स्रोत थाली नक्शे से पता चलता है एक परख की DMSO सहिष्णुता का निर्धारण करने के लिए प्रयोग किया जाता है का निर्धारण करने के लिए प्रयोग किया जाता है. 1 और 24 कॉलम परख बफर ही होते हैं, जबकि रंग ढाल 2 गुना कमजोर पड़ने 10% से 0.01% DMSO लेकर श्रृंखला को इंगित करता है. कम Tl + प्रवाह गहरे नीले के साथ संकेत मूल्यों के साथ, एक प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति तीव्रता नक्शा चित्रा 3B में दिखाया गया है. सेल चढ़ाना चित्रा 1 बी में दिखाया नक्शा इस प्रयोग में इस्तेमाल किया गया था. औसत Tl + प्रवाह DMSO के संकेत सांद्रता युक्त कुओं से दर्ज मान चित्र 3C में संक्षेप हैं. डेटा DMSO के अभाव में दर्ज Tl + प्रवाह के प्रतिशत के रूप में प्लॉट किए जाते हैं. इस विशेष कीर चैनल के लिए, 2.5% करने के लिए DMSO ऊपर सांद्रता Tl + प्रवाह पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा है और इसलिए प्रयोगों में इस्तेमाल किया जा सकता है अंजीर.ure 4A स्रोत प्लेट लिए एक कीर चैनल के ज्ञात inhibitors के लिए एकाग्रता प्रतिक्रिया घटता स्थापित किया नक्शे से पता चलता है. प्रत्येक परिसर में एक अलग रंग के साथ संकेत दिया है और आम तौर पर एक कमजोर पड़ने 3 गुना श्रृंखला के रूप में चढ़ाया. 4B चित्रा में एक प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति तीव्रता नक्शा दिखाया गया है. सेल चढ़ाना चित्रा 1C में दिखाया नक्शा इस प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया गया था. एक प्रतिनिधि एक अवरोध करनेवाला द्वारा खुराक पर निर्भर Tl + प्रवाह के निषेध दिखा प्रयोग चित्रा 4C में दिखाया गया है. एक परख की मजबूती तथाकथित "बिसात" assays, जो चित्रा 5 में संक्षेप में निर्धारित किया जाता है. स्रोत थाली चित्रा 5A, एक अवरोध की ज़्यादा से ज़्यादा प्रभावी एकाग्रता या एक वाहन पर नियंत्रण के रूप में 0.1% DMSO में दिखाया नक्शा कुओं बारी में चढ़ाया जाता है चित्रा 5B एक प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति तीव्रता के नक्शे से पता चलता है. शिखर Tl + प्रवाह का एक तितर बितर साजिश individu से दर्जअल कुओं चित्रा 5C में साजिश रची है. मतलब प्रतिदीप्ति मानों को ठोस लाइन के साथ संकेत कर रहे हैं, जबकि 3 मानक विचलन एक बिंदीदार रेखा के साथ संकेत कर रहे हैं. Z प्रधानमंत्री मूल्य, कैसे अच्छी तरह से अलग दो सेल आबादी अलग हो रहे हैं एक सांख्यिकीय माप है, इस प्लेट के लिए गणना 0.75 है, जो 0.5 उच्च throughput स्क्रीनिंग के लिए आवश्यक सीमा से ऊपर अच्छी तरह से है.

चित्रा 1
चित्रा 1. सेल चढ़ाना Tl के लिए इस्तेमाल नक्शे + प्रवाह परख विकास (ए) सेल चढ़ाना नक्शा इष्टतम परख Tl एकाग्रता + का निर्धारण करने के लिए उपयोग. 1 स्तंभ में कुओं, A1-23 पंक्तियों K1-12, F13-23, और P13-23 uninduced कोशिकाओं (Tet) होते हैं. शेष कुओं कोशिकाओं कि टेट्रासाइक्लिन (Tet +) के साथ इलाज किया गया कीर चैनल अभिव्यक्ति को प्रेरित होते हैं. (बी) सेल पीएलएते नक्शा परख DMSO सहिष्णुता का निर्धारण करने के लिए उपयोग और बिसात विश्लेषण प्रदर्शन. ध्यान दें कि सभी कुओं टेट्रासाइक्लिन (Tet +) के साथ व्यवहार कर रहे हैं. (सी) सेल प्लेट नक्शा परख ज्ञात औषधीय modulators संवेदनशीलता का निर्धारण करने के लिए प्रयोग किया जाता है. 1 स्तंभ और A1-23 पंक्ति में कुओं uninduced कोशिकाओं (Tet) होते हैं. शेष कुओं कोशिकाओं है कि टेट्रासाइक्लिन (Tet +) के साथ इलाज किया गया. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2. इष्टतम परख का निर्धारण TL + एकाग्रता (ए) स्रोत थाली नक्शा Tl + एकाग्रता है कि अधिक से अधिक वृद्धि FluoZin-2 प्रतिदीप्ति (80 ईसी) का लगभग 80% उदाहरण भी देते हैं निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. पंक्ति और colum1 एनएस और 24 (पीला) 12 मिमी 2 Tl अतः 4 के एक 5x एकाग्रता होते हैं. शेष पंक्तियाँ एक कमजोर पड़ने 3 गुना 12 मिमी (100%) से लेकर 0.024 मिमी (0.002%) Tl 2 अतः 4 श्रृंखला होते हैं. श्रृंखला 2-12 और 13-23 स्तंभों में दोहराया है. (बी) प्रतिदीप्ति तीव्रता के नक्शे में एक अच्छी तरह से Tl + के बाद इसके अलावा लगभग 1 मिनट के लिए TL + प्रवाह चित्रण. छद्म रंग सही पर बार Tl + प्रवाह की मात्रा इंगित करता है, कूलर और hotter निम्न और उच्च प्रवाह मूल्यों का प्रतिनिधित्व के रंग के साथ क्रमशः. ध्यान दें कि 1 कॉलम में कूलर रंग, A1-23 पंक्तियों K1-12, F13-23, और P13-23 कम uninduced कोशिकाओं में Tl प्रवाह + के कारण कर रहे हैं. 24 कॉलम में उन सहित शेष कुओं, कोशिकाओं है कि टेट्रासाइक्लिन के साथ इलाज किया गया कीर चैनल अभिव्यक्ति को प्रेरित (चित्र 1 ए में सेल चढ़ाना नक्शा देखें) होते हैं. (सी) TL प्रतिदीप्ति + निर्भर परिवर्तन (n 3 =) के लिए ± SEM सीआरसी मतलब. एक रसद चार पैरामीटर समारोह फिटिंगडेटा के लिए tion 15% Tl + एक आईसी 80 मूल्य मिले. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 3
चित्रा 3. परख DMSO सहिष्णुता (ए) स्रोत थाली नक्शा परख DMSO के लिए सहिष्णुता का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया. 1 कॉलम और 24 HbSS परख बफर होते हैं. पंक्तियाँ एक 2 गुना DMSO कमजोर पड़ने के 10% से 0.01% v / v. लेकर श्रृंखला के एक 2x एकाग्रता होते हैं (बी) के प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति तीव्रता नक्शा प्रत्येक Tl + अलावा एक के बाद अच्छी तरह से दर्ज लगभग 1 मिनट में Tl + प्रवाह चित्रण. छद्म रंग सही पर बार Tl + प्रवाह की मात्रा इंगित करता है, कूलर और hotter निम्न और उच्च प्रवाह मूल्यों का प्रतिनिधित्व के रंग के साथ क्रमशः. (सी) का मतलब ±, SEM (n = 9) TL + सामान्यीकृत प्रवाह HbSS परख बफर अकेले की उपस्थिति में दर्ज की गई है कि बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .

चित्रा 4
चित्रा 4. परख ज्ञात pharmacologically सक्रिय यौगिकों के लिए संवेदनशीलता (ए) स्रोत थाली नक्शा Tl में ज्ञात pharmacologically सक्रिय यौगिकों की गतिविधि + प्रवाह परख का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया. पंक्ति और स्तंभों 1 और 24 0.1% DMSO v / v होते हैं. प्लेट लेआउट 2-23 स्तंभों में तीन प्रतियों में 10 यौगिकों के परीक्षण के लिए अनुमति देता है. पंक्तियाँ एक 3 गुना 100 सुक्ष्ममापी से 2 एनएम लेकर यौगिकों के धारावाहिक कमजोर पड़ने श्रृंखला के एक 2x एकाग्रता होते हैं (बी) प्रतिदीप्ति तीव्रता नक्शा Tl चित्रण हर अच्छी तरह approximatel के लिए प्रवाह +y Tl के बाद 1 मिनट + अलावा. छद्म रंग सही पर बार Tl + प्रवाह की मात्रा इंगित करता है, कूलर और hotter निम्न और उच्च प्रवाह मूल्यों का प्रतिनिधित्व के रंग के साथ क्रमशः. ध्यान दें कि 1 स्तंभ और A1-23 पंक्ति में कुओं uninduced सेल होते हैं. शेष कुओं टेट्रासाइक्लिन प्रेरित कीर चैनल (चित्रा 1C में सेल प्लेट नक्शा देखें) ब्याज की कोशिकाओं को व्यक्त होते हैं. (सी) प्रतिनिधि Tl + FluoZin-2 कुओं में प्रतिदीप्ति में परिवर्तन प्रेरित एक कीर चैनल अवरोध करनेवाला के संकेत एकाग्रता के साथ पूर्व इलाज. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 5
चित्रा 5. HTS के लिए परख उपयुक्तता के निर्धारण (ए) स्रोत थाली.नक्शा कुओं के बीच परिवर्तनशीलता अच्छी तरह से करने के लिए अच्छी तरह से 0.1% (वाहन) DMSO या एक ज्ञात अवरोध करनेवाला का ज़्यादा से ज़्यादा प्रभावी एकाग्रता युक्त मूल्यांकन किया जाता है. (बी) प्रतिदीप्ति तीव्रता नक्शा प्रत्येक Tl + अलावा एक के बाद अच्छी तरह लगभग 1 मिनट में Tl + प्रवाह चित्रण. ध्यान दें कि सभी कुओं टेट्रासाइक्लिन प्रेरित सेल होते हैं ब्याज की कीर चैनल (सेल चित्रा 1 बी में थाली नक्शा देखें) व्यक्त. (सी) प्रतिनिधि स्थिर राज्य प्रतिदीप्ति मूल्यों की तितर बितर साजिश वाहन या अवरोध करनेवाला इलाज कुओं से प्राप्त की. प्रत्येक नमूना जनसंख्या का मतलब प्रतिदीप्ति आयाम एक ठोस लाइन के साथ संकेत दिया है, एक टकराया लाइन मध्यमान से 3 मानक विचलन के साथ दिखाया गया है, और वाहन के लिए बारी नमूने (VHL) और अवरोध करनेवाला (INH) अलग - अलग बिंदुओं के रूप में रेखांकन कर रहे हैं. लिए यहाँ क्लिक करें बड़ा आंकड़ा देखें .

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Discussion

डेटा उपचार: एक बार डेटा एकत्र कर रहे हैं, इस विश्लेषण में एक आम कदम शामिल प्रत्येक अच्छी तरह से प्रतिदीप्ति प्रतिक्रिया, एफ, प्रयोग, एफ 0 की शुरुआत में अपने प्रारंभिक मूल्य सामान्य. यह आमतौर पर "स्थिर अनुपात" के रूप में जाना जाता है और ऐसे मामलों में जहां एफ 0 सूचक डाई का प्रभुत्व है स्थिर अनुपात आपरेशन काफी रोशनी में disuniformities, संकेत संग्रह के रूप में कई कारकों के लिए सही होगा प्रतीक "/ एफ 0 एफ". और सेल नंबर. मामलों में जहां डाई संकेत कमजोर है या पृष्ठभूमि या प्रणाली में प्रतिदीप्ति प्रतिबिंब उच्च हैं, स्थिर अनुपात प्रभावी नहीं हो सकता है जब तक उचित पृष्ठभूमि से पहले स्थिर अनुपात की गणना के साथ निपटा जा सकता है. डेटा सामान्यीकरण के बाद, यह ठेठ प्रतिदीप्ति तरंग को कम करने के लिए एक मूल्य है कि गतिविधि यों और हिट लेने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. सबसे अधिक इस डेटा फिटिंग द्वारा किया जाएगा10 सेकंड में अंक के अलावा Tl + पैदा प्रतिदीप्ति वृद्धि की एक प्रारंभिक ढलान प्राप्त करने के बाद. हिट चुनने के लिए एक लोकप्रिय तरीका करने के लिए मान लेते हैं कि परीक्षण आबादी में यौगिकों के विशाल बहुमत के निष्क्रिय (अशक्त परिकल्पना बल में है) है. एक मतलब है और मानक विचलन परीक्षण जनसंख्या के लिए गणना की है और हिट का चयन कर रहे हैं कि मध्यमान से तीन मानक विचलन कर रहे हैं.

बंटवारे लंबी मिश्रित incubations के लिए प्रोटोकॉल: intracellular बाध्यकारी साइटों पर कीर चैनल inhibitors, विशेष रूप से उन लोगों के अभिनय का पता लगाने के लिए, यह मूल्यवान हो परीक्षण यौगिकों के साथ समय की एक विस्तारित अवधि (जैसे 20 मिनट) के लिए कोशिकाओं को सेते हैं Tl के अलावा से पहले हो सकता है +. यदि यौगिकों "ऑफ़लाइन" जोड़ रहे हैं पहले परख प्लेट पाठक के लिए शुरू की है, परीक्षण यौगिकों (जैसे प्रतिदीप्ति) के ऑप्टिकल गुण आसानी से हो सकता है मान्यता प्राप्त नहीं है और हो सकता है पर प्रतिकूल असर आमतौर पर इस्तेमाल किया जा सकता हैडेटा सामान्य "स्थिर अनुपात" एफ / एफ 0 झूठी सकारात्मक और / या झूठी नकारात्मक में जिसके परिणामस्वरूप ऊपर वर्णित के रूप में इस तरह के दृष्टिकोण. इस समस्या से बचने, जबकि एक साथ एक रीडर में एक लंबी ऊष्मायन के लिए एक परख की थाली रखने से परहेज, एक समाधान के लिए एक "दो पढ़ा" प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए है. पहले पढ़ा एक छोटी (उदाहरण के लिए 30 सेकंड) प्रयोग जहां परिसर में 10 सेकंड के बाद जोड़ा जाता है पूर्व मिश्रित अलावा 0 एफ के कब्जा करने की अनुमति है और सिस्टम पर 'यौगिकों ऑप्टिकल प्रभाव का आकलन है. प्लेट तो पाठक से निकाल दिया जाता है और वांछित अवधि के लिए incubated और थालियम इसके अलावा करने के लिए पाठक के लिए लौट आए. बाद दोनों पढ़ता पूरा कर रहे हैं, पहली बार पढ़ा 0 एफ 2 से डेटा मानक के अनुसार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है पढ़ने के इस प्रकार कई यौगिकों "ऑफ़लाइन" जोड़ने, जबकि पाठक डेटा इस प्रकार स्क्रीनिंग throughput में सुधार इकट्ठा करने में व्यस्त रखने के लिए अवसर की अनुमति के साथ जुड़े मुद्दों से परहेज. दो पढ़ा दृष्टिकोण सबसे अधिक आसानी से कार्यान्वयनented जब एक स्वचालित स्क्रीनिंग प्रणाली का उपयोग कर. यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि दो पढ़ा दृष्टिकोण फ्लोरोसेंट यौगिकों कि डिटेक्टर और / तर या पढ़ने के बाहर सीसीडी कैमरे में कलाकृतियों के कारण की वजह से समस्याओं को समाप्त नहीं होगा.

Activators के लिए एक परख का विन्यास: सभी चैनलों कीर नहीं ज़्यादा से ज़्यादा आराम कर रही शर्तों के तहत सक्रिय कर रहे हैं, इस प्रकार यह संभव हो सकता है एक परख कि छोटे अणु activators का पता लगा सकते हैं डिजाइन कर सकते हैं. इन मामलों में, Tl के एक चुनाव आयोग 80 एकाग्रता का चयन करने के लिए मज़बूती से activators का पता लगाने की परख के लिए पर्याप्त "headroom" नहीं प्रदान कर सकता है. इस प्रकार, एक उत्प्रेरक assays में + TL (उदाहरण के लिए 20 ईसी) की एक कम एकाग्रता का उपयोग करने के लिए चुन सकते हैं. कुछ मामलों में, परख काफी कम परिवर्तनशीलता दिखाने के रूप में Tl के एक चुनाव आयोग 50 एकाग्रता + उपयोग की अनुमति देने के लिए हो सकता है और अभी भी दोनों सक्रिय और चैनल आबादी हिचकते उपयुक्त समाधान प्रदान करते हैं. इस मामले में, परख मीटरप्र दोहरी मोड / उत्प्रेरक अवरोध करनेवाला में आयोजित किया जाएगा. जब उपलब्ध है, एक ज्ञात उत्प्रेरक मदद करने के लिए उपयुक्त Tl + चैनल activators की खोज की संभावना को अधिकतम करने के लिए एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

सीमाएं: वहाँ कुछ सीमाएँ हैं कि विकास और एक TL के निष्पादन + प्रवाह आधारित उच्च throughput स्क्रीन के दौरान विचार किया जाना चाहिए. उदाहरण के लिए, परख कीर चैनल गतिविधि का एक अप्रत्यक्ष उपाय जिसका ऑप्टिकल गुण सीधे एक स्क्रीन में यौगिकों से प्रभावित हो सकता है एक फ्लोरोसेंट जांच का उपयोग पर निर्भर करता है. इसलिए, Tl + प्रवाह प्रयोगों से महत्वपूर्ण टिप्पणियों वोल्टेज क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, जो "" आयन चैनल औषध विज्ञान के लिए सोने की मानक तरीका माना जाता है का उपयोग कर पुष्टि की जानी चाहिए. इसके अलावा, छोटे अणुओं अंतर्जात Tl + प्रवाह HEK 293 कोशिकाओं में व्यक्त रास्ते, झूठी सकारात्मक हिट की पहचान करने के लिए अग्रणी पर सीधा असर हो सकता है. tetracyclinई - inducible प्रणाली कीर से झूठी सकारात्मक हिट भेद modulators चैनल निर्देश क्योंकि तेजी से हिट अंतर्जात रास्ते पर प्रभाव के लिए किया जा सकता है uninduced कोशिकाओं में जांच के लिए विशेष रूप से उपयोगी है. अंत में, Tl की कम + क्लोराइड युक्त buffers में विलेयता Tl की एकाग्रता की सीमा + कि एक परख में इस्तेमाल किया जा सकता है, एक गैर शारीरिक TL + प्रोत्साहन बफर कि 11 लक्ष्य के औषध विज्ञान में वृद्धि कर सकते हैं के उपयोग की आवश्यकता होती है. ब्याज के लक्ष्य के साथ अलग buffers की अनुकूलता को ध्यान से परख विकास के दौरान मूल्यांकन किया जाना चाहिए. यह ज्ञात अलग Tl + प्रोत्साहन buffers का उपयोग modulators के लिए सीआरसी की स्थापना और जिन स्थितियों में औषध सबसे अधिक बारीकी से मेल खाता है कि शारीरिक buffers का उपयोग कर देखा चुनने के द्वारा किया जा सकता है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

यह काम स्वास्थ्य 1R21NS073097-01 और 1R01DK082884 (JSD) और राष्ट्रीय संस्थानों अनुदान PIER11VCTR के लिए फाउंडेशन अनुदान के राष्ट्रीय संस्थानों से धन के द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pcDNA5/TO Invitrogen V1033-20 Tetracycline-inducible expression vector
T-REx-HEK293 cells Invitrogen R71007 Tetracycline-inducible cell line
Lipofectamine LTX/Plus Reagent Invitrogen 15338100 Transfection reagent
FBS ATLANTA Biologicals S11550 Cell culture media
DMEM Invitrogen 11965 Cell culture media
Hygromycin B Invitrogen 10687-010 Cell culture media
Blasticidin S Invitrogen R210-01 Cell culture media
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140 Cell culture media
HBSS-divalent free Mediatech 21022CV Cell washing
Trypsin-0.25% Mediatech 25053CI Cell dissociation
Tetracycline-HCl Sigma T9823 Induction reagent
Dialyzed FBS ATLANTA Biologicals S12650 Plating media
FluoZin-2 Invitrogen F24189 Fluorescent dye
Pluronic F-127 Invitrogen P-3000MP Dye loading
HBSS Invitrogen 14175 Assay buffer
HEPES Invitrogen 15630 Assay buffer
NaHCO3 Sigma S6297 Tl+ stimulus buffer
MgSO4 Sigma M2643 Tl+ stimulus buffer
CaSO4∙2H2O Sigma C3771 Tl+ stimulus buffer
D-Glucose Sigma G7528 Tl+ stimulus buffer
Thallium sulfate Aldrich 204625 Tl+ stimulus buffer
HEPES Sigma H4034 Tl+ stimulus buffer
DMSO Sigma D4540 Solvent
Eight-channel electronic pipettor Biohit E300 Cell plating in 384-well plates
BD PureCoat amine-coated 384-well plates BD Biosciences 356719 Assay microplates
Echo qualified 384-Well polypropylene microplate (384PP) Labcyte P-05525 Compound source microplates
384-well polypropylene microplates Greiner Bio-One 781280
Multidrop Combi reagent dispenser Thermo Scientific 5840300
ELx405 microplate washer BioTek ELx405HT Automated cell washing
Echo liquid handler Labcyte Labcyte Echo 550
Bravo automated liquid handling platform Agilent Technologies Standard model
Hamamatsu FDSS 6000 Hamamatsu Kinetic imaging plate reader

Table 1. List of Materials and Reagents.

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References

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Erratum

Formal Correction: Erratum: High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels
Posted by JoVE Editors on 10/10/2017. Citeable Link.

An erratum was issued for: High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels. The Protocol section has been updated.

The formula in step 7.1 of the Protocol has been updated from:

Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp + meann |

to:

Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp - meann |

आवक करनेवाला पोटेशियम चैनल के छोटे अणु Modulators के लिए उच्च throughput स्क्रीनिंग
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Raphemot, R., Weaver, C. D., Denton, … More

Raphemot, R., Weaver, C. D., Denton, J. S. High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels. J. Vis. Exp. (71), e4209, doi:10.3791/4209 (2013).

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