High-throughput screening per la piccola molecola modulatori di canali di potassio Inward Rectifier

Summary

Metodi per lo sviluppo e la convalida di un metodo quantitativo di fluorescenza per misurare l'attività di potassio raddrizzatore attivo (Kir) canali di screening ad alto rendimento composto è presentato.

Abstract

Membri specifici della famiglia verso l'interno canale del potassio raddrizzatore (Kir) sono postulato bersagli farmacologici per una varietà di disturbi, tra cui l'ipertensione, fibrillazione atriale, e ^1,2 dolore. Per la maggior parte, tuttavia, i progressi verso la comprensione il loro potenziale terapeutico o funzioni fisiologiche anche di base è stata rallentata dalla mancanza di buoni strumenti farmacologici. In effetti, la farmacologia molecolare della famiglia raddrizzatore verso l'interno è rimasta molto indietro quella della superfamiglia S4 del potassio voltaggio-dipendenti (Kv) canali, per i quali un certo numero di nanomolare affinità e altamente modulatori selettivi tossine peptidi sono stati scoperti ^3. Il tertiapin veleno d'api tossina e suoi derivati ​​sono potenti inibitori del Kir1.1 e Kir3 canali ^4,5, ma peptidi sono di uso limitato terapeuticamente nonché sperimentalmente a causa delle loro proprietà antigeniche e scarsa biodisponibilità, stabilità metabolica e penetranza tessuto. Lo sviluppo di potentie selettivi piccole molecole sonde con migliori proprietà farmacologiche sarà una chiave per comprendere appieno la fisiologia e la potenziale terapeutico dei canali Kir.

La molecolare Biblioteche Sonde Produzione Centro connessioni di rete (MLPCN) supportato dal National Institutes of Health (NIH) Fondo comune ha creato opportunità per gli scienziati accademici di avviare campagne di sonda di rilevamento per target molecolari e vie di segnalazione che hanno bisogno di una migliore farmacologia ^6. Il MLPCN fornisce ai ricercatori l'accesso per l'industria scala centri di screening e chimica farmaceutica e informatica sostegno per sviluppare piccole molecole sonde di chiarire la funzione dei geni e delle reti di geni. La fase critica l'ammissione al MLPCN è lo sviluppo di un saggio robusto bersaglio o percorso specifico che è suscettibile di screening ad alto rendimento (HTS).

Qui, descriviamo come sviluppare una fluorescenza a base di tallio (Tl ⁺⁾ flusso assay della funzione Kir canale per screening ad alto rendimento composto ^7,8,9,10. Il saggio è basato sulla permeabilità del poro K ⁺ canale al K ⁺ congenere Tl ^+. A disponibile in commercio fluorescente Tl ⁺ colorante reporter viene utilizzato per rilevare il flusso transmembrana di Tl ⁺ attraverso il poro. Ci sono almeno tre coloranti disponibili in commercio che sono adatti per TL ⁺ saggi flusso: BTC, FluoZin-2, ^7,8 e FluxOR. Questo protocollo descrive lo sviluppo dosaggio con FluoZin-2. Anche se originariamente sviluppati e commercializzati come un indicatore di zinco, FluoZin-2 presenta un incremento robusto e dose-dipendente in emissione di fluorescenza su Tl ⁺ vincolante. Abbiamo iniziato a lavorare con FluoZin-2 prima FluxOR era disponibile ^7,8 e hanno continuato a farlo ^9,10. Tuttavia, le fasi di sviluppo del test sono sostanzialmente identiche per tutti e tre i coloranti, e gli utenti devono determinare quale colorante è più adatto per la loro specifica nresponsabili politici. Discutiamo anche benchmark delle prestazioni del saggio che devono essere raggiunti da considerare per l'ingresso al MLPCN. Poiché Tl ⁺ permea facilmente la maggior parte dei canali del K ^+, il test deve essere adattabile alla maggior parte dei canali K ⁺ obiettivi.

Protocol

1. Generazione di linee cellulari stabili policlonali

1. La creazione di una linea di cellule di alta qualità stabile che esprime il canale Kir di interesse è un primo passo importante verso lo sviluppo di una robusta high-throughput test di screening. Sovraespressione costitutiva K ⁺ canale può portare alla attivazione di vie di morte cellulare, stabile degenerazione linea cellulare e la perdita di prestazioni del dosaggio. Per evitare questi potenziali problemi e fornire un comodo controllo interno di sviluppo dosaggio (vedere sotto), una tetraciclina inducibile sistema di espressione è consigliato ^8.
2. Cultura parentale T-REX-cellule HEK293 utilizzando tecniche standard in B-medium (terreno di crescita DMEM contenente 10% FBS, 50 U / ml di penicillina, 50 mg / ml di streptomicina e 5 ug / ml blasticidina S). Utilizzare cellule passaggio precoce (ad esempio passaggi 3-4 da scongelamento di conservazione in azoto liquido) per la trasfezione e selezione clonale stabile.
3. Piatto 4000000 T-Rex-HEK293 cellule in un75 centimetri ² pallone in modo che il pallone è di circa 80% confluenti il giorno seguente. Coltura durante la notte in un 5% di CO ₂ incubatore a 37 ° C.
4. Trasfettare le cellule con 10-15 pg di DNA e pcDNA5/TO-Kir Lipofectamine LTX / Plus reagente secondo il protocollo del produttore. Dopo 5 ore, sostituire il mezzo trasfezione con B-media.
5. 24 ore dopo la trasfezione, sostituire il B-B-mezzo con terreno contenente 250 mg / ml Hygromycin (BH-media) per iniziare la selezione stabile clone. Nutrire le cellule ogni 2-3 giorni con fresco BH-media.
6. Maggiore del 90% delle cellule dovrebbe morire nei prossimi 7 giorni, lasciando piccole colonie di cellule stabilmente trasfettate. Lasciare le colonie a crescere per altri 10-14 giorni prima di sciogliersi in un pallone da ² cm 175 per l'espansione.
7. Per la crioconservazione, congelare 3 x 10 ⁶ cellule / ml in un mezzo contenente 45% BH-medium condizionato, 45% antibiotico-free, DMEM contenente siero e 10% DMSO. Congelarele cellule notte a -80 ° C in un contenitore di congelamento cella e quindi spostare azoto liquido per conservazione a lungo termine. Scongelare le cellule di azoto liquido tramite il protocollo consigliato Invitrogen. Si noti che la vitalità delle cellule sarà inferiore se sono congelati da un pallone che è maggiore di 75% confluenti al momento della lavorazione.

2. Generazione di linee cellulari stabili monoclonali

1. Lavare un sub-confluenti 75 centimetri ² fiasco di stabili cellule policlonali con bivalente senza HBSS. Aggiungere 1 ml di tripsina e incubare per 3-5 minuti in un 5% di CO ₂ incubatore a 37 ° C. Aggiungere 5 ml di BH-medium al pallone per inibire l'attività della tripsina e triturare ripetutamente (ad esempio a 5 volte) per dissociare completamente le cellule. Ispezionare con cura le cellule al microscopio per assicurare la sospensione è costituito quasi interamente di singole cellule. Questo aumenta la probabilità di ottenere linee di cellule monoclonali.
2. Determinare la densità cellulare e diluirela sospensione ad una concentrazione di 0,7 cellule per 20 pl. Utilizzando un pipettatore multicanale, pipetta 20 microlitri della sospensione di cellule in ciascun pozzetto di BD PureCoat ammina rivestita (o equivalente poli-D-lisina rivestita) 384 pozzetti. In linea di principio, il 70% dei pozzetti devono ricevere una cella con queste condizioni di placcatura. Così, una piastra a 384 pozzetti dovrebbero contenere più di 200 cloni da analizzare. Continuare coltivando le cellule in un 5% di CO ₂ incubatore a 37 ° C.
3. Dopo una settimana, ispezionare le piastre al microscopio per pozzetti contenenti singole colonie. Nota la loro posizione sul coperchio con un pennarello indelebile per riferimento futuro. Annotare anche ed escludere pozzetti contenenti più colonie. Questi sono più facilmente riconoscibile dalla comparsa di colonie che crescono da più lati del pozzo. Essere consapevoli che l'evaporazione tende a verificarsi più rapidamente da pozzi vicino al bordo della piastra. Aggiungi BH-medio e pozzi dove l'evaporazione di notevole gravità. Altrimenti, è necessario to alimentare le cellule.
4. Monitorare i pozzi più frequentemente durante i prossimi giorni 7-10. Le cellule sarà pronto a dividere quando i pozzi di interesse sono almeno 50% confluenti.
5. Dividere le celle di duplicare piastre a 384 pozzetti, una piastra per il saggio con Tl ⁺ flusso e l'altro per la prosecuzione delle linee monoclonali in coltura. Aspirare il terreno dai pozzetti contenenti le linee cellulari di interesse. Lavare le cellule con bivalente-free HBSS, aggiungere 20 ml di tripsina per ciascun pozzetto e trasferire la piastra ad un incubatore 37 ° C per 15-20 min. Dopo aver spostato la piastra posteriore alla cappa coltura cellulare, aggiungere 20 ml di mezzo-BH in ciascun pozzetto e triturare volte dissociare le cellule. Ispezionare i pozzetti al microscopio per assicurare le cellule sono completamente dissociato. Questo può richiedere più cicli di pipettaggio, come le cellule saranno aderente. Una volta che le cellule sono dissociati, trasferire 10 ml di ciascuna sospensione cellulare nei pozzetti duplicati di una nuova BD PureCoat ammina rivestita 384-pozzetti. Assicuratevi di notare il rapporto tra la sorgente e destinazione e pozzetti duplicati in modo che i cloni espositrici robusta attività dei canali Kir (vedi sotto) si può far risalire al pozzo originale. Aggiungere 20 ml di mezzo-BH alla sorgente originaria bene per alimentare le celle rimanenti e continuare in cultura in 5% CO ₂ incubatore a 37 ° C.
6. Consentire alle cellule nella piastra destinazione di aderire e crescere fino ad una settimana. Una volta che la maggior parte dei cloni raggiunge almeno il 50% di confluenza, possono essere valutati per l'attività Kir canale utilizzando il saggio Tl ⁺ flusso descritto di seguito.
7. Il giorno prima del saggio, aspirare il terreno di coltura e sostituirlo con terreno BH contenente 10% FBS dializzato. Questo impedisce l'espressione involontaria canale che potrebbe derivare da tetraciclina siero contaminato. Indurre l'espressione canale Kir in uno solo dei pozzetti duplicati per ciascun clone di cui 1 ug / ml di tetraciclina. Il duplicato uninduced e servirà da"Sfondo" di controllo. Eseguire la Tl ⁺ saggi di flusso come descritto di seguito.

3. Generale Tl ⁺ Procedura del test Flux

1. Il giorno prima un Tl ⁺ esperimento flusso, dissociare le cellule e quantificare la densità della sospensione cellulare come descritto nelle sezioni 2.1 e 2.2. Piastra 20.000 cellule monoclonali stabilmente transfettate con un gene canale Kir di interesse in ciascun pozzetto di una ammina PureCoat BD rivestita piastra a 384 pozzetti utilizzando un Combi Multidrop Thermo o un pipettatore multicanale. Utilizzare medie BH contenente 10% FBS dializzato per la placcatura. Si noti che alcune cellule saranno coltivate durante la notte con 1 mg / ml di tetraciclina per indurre l'espressione dei canali Kir, mentre altri no. La posizione di cellule indotte e uninduced sarà differente per ciascun tipo di esperimento e sono mostrati in figura 1.
2. Il giorno successivo, ispezionare le piastre al microscopio per assicurare che le cellule sono aderenti e distribuita in modo uniforme sul fondodei pozzetti. I pozzetti devono essere 80-90% confluenti.
3. Utilizzare un ELx405 Rondella micropiastre per sostituire il mezzo di coltura cellulare di 20 pl per pozzetto di tampone HBSS contenente 20 mM HEPES e tamponata a pH 7,3 con NaOH. In alternativa, si può utilizzare un metodo "flick e slam", in cui la piastra è invertito e scattò in forte diminuzione per espellere il mezzo in un contenitore per rifiuti, e poi diede un colpetto su tovaglioli di carta impilati di rimuovere il supporto rimanenti. Aggiungere immediatamente indietro tampone HBSS saggio alla piastra per evitare che le cellule da essiccare.
4. Preparare la FluoZin-2, AM soluzione colorante carico. Dopo aver brevemente centrifugazione del tubo, sciogliere 50 mg di polvere di FluoZin-2 in 100 pl di DMSO anidro. A questo punto, aliquote della soluzione 1000 x magazzino possono essere conservati a -20 ° C per un uso successivo. Al momento dell'uso, aggiungere 50 microlitri di una ponderazione del 20% per volume di soluzione Pluronic F-127/DMSO al colorante e mescolare con pipettaggio gentile. Non congelare il colorante una volta Pluronic F-127 è stato aggiunto, comebassa temperatura può provocare il tensioattivo a precipitare dalla soluzione. Aggiungere il volume di 150 ml di FluoZin-2, AM/Pluronic-F127 a 100 ml di tampone HBSS e mescolare delicatamente per fare il buffer di colorante di caricamento. Utilizzo di un Combi Multidrop o multi-canale pipetta, aggiungere 20 ml di tampone di caricamento colorante in ciascun pozzetto già contenente 20 microlitri di tampone HBSS. Incubare le cellule a temperatura ambiente per circa 1 ora (tipicamente incubazione è stata eseguita di notte, anche se non vi è alcuna prova diretta che è necessario).
5. Mentre le cellule si caricano con la tintura, preparare uno stimolo Tl ⁺ piastra. Appena sciogliere 0,5 g di bicarbonato di sodio in 50 ml di tampone 5x stimolo Tl ⁺ contenente 1 mM di solfato di magnesio, solfato di calcio 1,8 mM, glucosio 5 mM, HEPES 10 mM e 12 mM Tl ⁺ solfato. In alternativa, bicarbonato di sodio può essere sostituito con gluconato di sodio, se, per esempio, il pH della soluzione deve essere mantenuta entro un intervallo molto stretto e perdita di anidride carbonicaè una preoccupazione. Chiudere la provetta saldamente per limitare la fuga di anidride carbonica e capovolgere più volte fino a che il bicarbonato di sodio passa in soluzione. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 50 microlitri della soluzione ad ogni pozzetto di un polipropilene piastra a 384 pozzetti (Tabella 1).
6. Dopo che le cellule sono state caricate con FluoZin-2, AM, lavare i piatti con una Rondella ELx405 micropiastre o utilizzando il "flick e slam" metodo, come descritto sopra nella sezione 3.3. A seconda del tipo di Tl ⁺ esperimento flusso da eseguire, aggiungere nuovamente 20 pl o 40 microlitri di tampone HBSS a ciascun pozzetto. Le piastre sono ora pronti per gli esperimenti.
7. La cellula e Tl ⁺ piatti in un funzionale sistema Drug Screening Hamamatsu (FDSS) o equivalente cinetica lettore di piastre di imaging con funzionalità integrate di erogazione del liquido. Utilizzare i filtri appropriati per fluoresceina / fluoresceina basati coloranti come Fluo-4.
8. Impostazione di un singolo componente aggiuntivo protocollo in modo che il 10 microlitri 5x ⁺ Tlserie viene aggiunto ai pozzetti della piastra cella contenente 40 microlitri di tampone HBSS. Record basale della fluorescenza a una frequenza di campionamento 1 Hz per almeno 10 sec. Il ben-di-bene fluorescenza devono essere uniformi e stabili in tutta la piastra una volta condizioni di carico placcatura cellulare ottimale, il lavaggio e la tintura sono stabiliti. Integrato 384-canale pipettatore viene utilizzata per aggiungere contemporaneamente lo stimolo Tl ⁺ tampone di.
9. Dati per almeno 2 minuti in modo che la velocità e il picco della Tl ⁺ indotta aumento della fluorescenza viene catturato per analisi off-line.

4. Determinazione della concentrazione ottimale + Tl

1. Tl ⁺ permea più facilmente verso l'interno del raddrizzatore canali del K ^+. Per garantire che le concentrazioni ⁺ Tl non superano la gamma dinamica del Tl ⁺ colorante reporter FluoZin-2, si dovrebbe determinare empiricamente la concentrazione ottimale Tl ⁺ da utilizzare in un high-throughput schermo. Si consiglia una concentrazione ⁺ Tl che evoca 80% della risposta massima di fluorescenza (EC ₈₀₎ in condizioni in cui il canale è massimamente attivati.
2. Piatto, carico colorante e lavare le cellule in BD PureCoat ammina rivestite o equivalente piastre da 384 pozzetti poli-D-lisina rivestite come descritto in precedenza nella sezione 3, lasciando 40 microlitri di tampone HBSS in ciascun pozzetto. Come mostrato nella mappa piastra in Figura 1A, colonna 1 e righe A1-A23 devono contenere cellule che non sono state indotte con tetraciclina e pertanto non esprimono il canale Kir di interesse. Le FluoZin-2 segnali di fluorescenza dai pozzetti uninduced saranno utilizzati per determinare il livello di Tl ⁺ flusso attraverso percorsi endogeni come il Na ⁺ - K ^+-ATPasi pompa e tensione K ⁺ gated canali, che sono normalmente espressi in cellule HEK- 293 cellule.
3. Utilizzare una piattaforma Agilent Bravo liquidi Manipolazione automatizzata o manuale pipettaggio di preparare unundici punti Tl ⁺ diluizione serie di concentrazioni in tampone di saggio HBSS. Tipicamente, una serie di 3 volte diluizione seriale dal 100% al 0,002% Tl ⁺ viene valutata nel test. La serie dovrebbe essere composto ad una concentrazione 5x perché le soluzioni ⁺ Tl sarà diluito 1:5 nel saggio finale. Una serie di diluizioni diluendo lo standard 5x Tl ⁺ tampone descritto al punto 3 con un 5x ⁺ Tl privo tampone contenente 1 mM di solfato di magnesio, solfato di calcio 1,8 mM, glucosio 5 mM e HEPES 10 mM. Ancora una volta, appena sciogliere 0,5 g di bicarbonato di sodio in 50 ml di tampone finale Tl ⁺ immediatamente prima placcatura in polipropilene piastra a 384 pozzetti secondo la mappa piastra mostrata nella Figura 2A.
4. Caricare il cellulare e Tl ⁺ piastre di stimolo nel FDSS. Impostare un singolo aggiuntivo protocollo in modo che il 10 microlitri 5x Tl ⁺ serie viene aggiunto ai pozzetti della piastra cella contenente 40 ml di HBSS assay buffer. Record basale FluoZin-2 fluorescenza per 10 secondi prima di aggiungere Tl ⁺ alla piastra. Ripetere l'esperimento su 3 giorni separati per stabilire la riproducibilità dei risultati.

5. Determinazione della sensibilità del test di DMSO

1. Le piccole molecole interrogato in un high throughput schermo vengono disciolti nel solvente organico dimetil solfossido (DMSO), che può incidere sulla prestazione del saggio. Pertanto, la sensibilità del saggio di DMSO deve prima essere esaminata per stabilire la concentrazione massima ammissibile DMSO nella schermata.
2. Piatto, carico colorante e lavare le cellule in piastre BD PureCoat ammina rivestite da 384 pozzetti, come descritto nella precedente sezione 3, con 20 pl di tampone HBSS in ciascun pozzetto. L'intera piastra devono contenere cellule che sono state indotte con tetraciclina (Figura 3A).
3. Utilizzare una piattaforma automatizzata Bravo di gestione dei liquidi o di pipettaggio manuale per preparare un undici punti DMSO diluizione serie di concentrazioni in tampone di saggio HBSS. Tipicamente, un 2-fold serie di diluizione variabile dal 10% al 0,01% v / v di DMSO viene valutata per l'attività nel saggio. La serie dovrebbe essere composto ad una concentrazione 2x, perché la soluzione di DMSO viene diluito mezzo nel saggio finale. La serie di diluizione deve essere placcato in polipropilene piastra a 384 pozzetti, secondo la mappa piastra mostrata in Figura 3A.
4. Preparare un 5x Tl ⁺ piastra stimolo in base alla CE ₈₀ o TI ⁺ ottimale concentrazione determinato al punto 4.
5. Caricare la cella, DMSO e Tl ⁺ piastre stimolo nella FDSS. Impostare due add protocollo in modo che 20 microlitri della concentrazione di DMSO 2x serie viene aggiunto ai pozzetti della piastra di cella contenente 20 microlitri di tampone HBSS. Lasciare il DMSO sulle cellule per la stessa quantità di tempo le cellule saranno esposte a piccola molecola veicolo durante una schermata. Record di base FluoZin-2 fluorescenza peralmeno 10 secondi prima di aggiungere 10 ml di 5x Tl ⁺ tampone a ciascun pozzetto della piastra di cella. Ripetere l'esperimento su 3 giorni separati per stabilire la riproducibilità dei risultati.
6. Il dosaggio dovrebbe essere tollerante al DMSO concentrazioni di almeno 0,1% v / v per una tipica high throughput schermo in cui vengono testati i composti ad una concentrazione di 10 pM.

6. Determinazione della sensibilità del test per noti Modulatori farmacologici

1. Dopo aver determinato l'ottimale Tl ⁺ tolleranza concentrazione e DMSO del saggio, gli effetti di noti agenti farmacologicamente attivi sul canale Kir-mediata Tl ⁺ flusso dovrebbe essere esaminato. Questa serie di esperimenti valuterà il test di sensibilità, capacità di rango ordine composti in base alla loro potenza, capacità di classificare i composti in base alla loro modalità di efficacia (ad esempio attivatore, inibitore), e identificare composti di controllo ben educati da utilizzare successivamente in il saggio dviluppo e schermo.
2. Piatto, carico colorante e lavare le cellule in piastre BD PureCoat ammina rivestite da 384 pozzetti, come descritto nella precedente sezione 3, con 20 pl di tampone HBSS in ciascun pozzetto. Colonna 1 e righe A1-A23 devono contenere cellule che non sono state indotte con tetraciclina (Figura 4A).
3. Utilizzare una piattaforma automatizzata Bravo di gestione dei liquidi o di pipettaggio manuale per preparare un undici punti serie di diluizioni concentrazione di modulatori noti in tampone di saggio HBSS. Tipicamente, un 3-fold serie di diluizione da 100 micron a 2 nM viene valutata per l'attività nel saggio. La serie dovrebbe essere composto ad una concentrazione 2x, perché la soluzione di DMSO viene diluito mezzo nel saggio finale. La serie di diluizione deve essere placcato in triplicato in polipropilene piastra a 384 pozzetti, secondo la mappa piastra mostrata in Figura 4A. Assicurarsi che le diluizioni sono fatti in modo tale che le concentrazioni finali di DMSO sono gli stessi tra i trattamenti farmacologici e meno tha n o uguale alla concentrazione massima ammissibile DMSO definito nella sezione 5.
4. Preparare un 5x Tl ⁺ piastra stimolo in base alla concentrazione ottimale Tl ⁺ determinato al punto 4.
5. Caricare il cellulare, composto e Tl ⁺ piastre di stimolo nel FDSS. Impostare due add protocollo in modo che il 20 microlitri 2x serie composto concentrazione viene aggiunto ai pozzetti della piastra di cella contenente 20 microlitri di tampone HBSS. Aggiungere i composti alla piastra cella e incubare fino a 20 min. Si noti che il tempo di incubazione ottimale per i composti di rilevare il miglior rapporto tra segnale e fondo possono essere determinati eseguendo una serie di esperimenti in cui vengono scelti paio diversi tempi di incubazione. Record basale FluoZin-2 fluorescenza per almeno 10 secondi prima di aggiungere 10 ml di 5x Tl ⁺ tampone a ciascun pozzetto della piastra di cella. Ripetere l'esperimento su 3 giorni separati per stabilire la riproducibilità dei risultati.

_title "> 7. Scacchiera Analisi

1. Nella serie successiva di esperimenti, l'uniformità e la riproducibilità del dosaggio sarà valutato utilizzando un'analisi "a scacchiera". Tipicamente, un inibitore di controllo è placcato in ogni altro ben di ciascuna colonna e di riga di una piastra a 384 pozzetti, come mostrato in figura 5A. Per valutare rigorosamente il rumore nel saggio, un ₈₀ concentrazione di inibitore CE deve essere utilizzato. DMSO viene aggiunta ai pozzetti altri come un controllo del veicolo. Tl ⁺ flux in DMSO-farmaco e cellule trattate viene utilizzata per calcolare un valore per Z prime, una misura statistica di pozzo alla ben variabilità tra le due popolazioni di pozzi. Z primaria è calcolato usando la formula:
   Z primo = 1 - _(p + 3SD 3SD _n) / | _p + media aritmetica _n |
   dove SD è la deviazione standard, p è il flusso disinibita e n è completamente inibito valori di flusso. Un'analisi con valori maggiori o uguali a 0,5 Z 'su 3 giorni separati è considerato sdatto per high-throughput screening.
2. Piatto, carico colorante e lavare le cellule in piastre BD PureCoat ammina rivestite da 384 pozzetti, come descritto nella precedente sezione 3, con 20 pl di tampone HBSS in ciascun pozzetto. Notare che l'intera piastra deve essere indotta con tetraciclina.
3. Fare un composto / DMSO piastra pipettando in una piastra a 384 pozzetti in polipropilene con un pipettatore multicanale, 80 pl / pozzetto di un noto inibitore del canale target Kir alla concentrazione determinata sezione 6,5, e 0,1% v / v di DMSO veicolo, come mostrato nella figura 5A. Aggiungere il noto inibitore a partire dal pozzetto A1 con il multi-canale pipetta e si alternano a ben B2 e così via fino a ben B24. Ripetere questa procedura con DMSO a partire dal pozzetto B1 e così via fino a ben A24. Il layout finale del piatto deve corrispondere a quello di una scacchiera.
4. Preparare un 5x Tl stimolo ⁺ piastra in base alla ottimale Tl ⁺ determinato al punto 4.
5. Caricare la cella, composto e Tl ⁺ stimolo piastre in FDSS. Impostare due add protocollo in modo che il 20 microlitri 2x serie composto concentrazione viene aggiunto ai pozzetti della piastra di cella contenente 20 microlitri di tampone HBSS. Aggiungere i composti alla piastra cella e incubare fino a 20 min a temperatura ambiente. Record basale FluoZin-2 fluorescenza per almeno 10 secondi prima di aggiungere 10 ml di 5x Tl ⁺ tampone a ciascun pozzetto della piastra di cella. Ripetere l'esperimento su 3 giorni separati per stabilire la riproducibilità dei risultati.

8. Pilot schermo

1. Nella fase finale di sviluppo di saggi, eseguire una schermata pilota di poche migliaia di composti per valutare le prestazioni del test sotto condizioni che saranno utilizzati eventualmente in grande scala high-throughput schermo.
2. Piastra, carico colorante e lavare le cellule in BD PureCoat piastre a 384 pozzetti rivestite ammina come descritto sopra nella sezione 3), lasciando 20 microlitri di tampone HBSS in ciascun pozzetto.Si noti che l'intera piastra devono essere coltivati ​​durante la notte con tetraciclina per indurre l'espressione dei canali Kir.
3. Selezionare circa 2.000 a 3.000 composti strutturalmente diversi da testare. Spesso è opportuno e conveniente usare le collezioni di composti con attività potenzialmente noti arricchite per modulatori dei canali ionici. Collezioni comprendono la Collezione Spectrum (Microsource) e la raccolta Lopac (Sigma). Inoltre, è opportuno includere modulatori noti del Kir di interesse nella schermata pilota. Idealmente questi composti verranno aggiunti ai pozzetti in modo cieco, al fine di consentire un controllo imparziale dei metodi di prelievo il colpo descritte più avanti. Preparare i composti in piastre a 384 pozzetti (piastre di polipropilene destinazione) utilizzando un Labcyte Liquid Handler Echo o strumento pin adatto per trasferire un volume adeguato di composti scelti in DMSO dalla collezione MLPCN (piastre sorgente) alle piastre destinazione noti che i composti di prova sono solo in colonne 3-22;In ogni ben altra colonne 1, 2, 23, 24 aggiungere un inibitore noto ad una concentrazione che inibisce completamente la Kir come determinato nella sezione 7. Nei restanti pozzetti delle colonne 1, 2, 23, e 24 aggiungere il giusto volume di DMSO per la produzione di DMSO concentrazione-matched controlli del veicolo. Diluire tutti i pozzetti con tampone del saggio con il Combi Multidrop. In genere composti di prova sarà di 20 mM, 2 volte superiore rispetto concentrazione target di screening.
4. Fai Tl ⁺ piastre di stimolo in base alla ottimale Tl ⁺ concentrazione determinato al punto 4.
5. Eseguire lo schermo pilota. Fare attenzione a scaglionare fasi di esecuzione del protocollo di mantenere coerenza tra le piastre tempi nella corsa di screening pilota.
6. Una volta che lo schermo pilota è completato, analizzare i pozzetti scacchiera da colonne 1, 2, 23 e 24 utilizzando la Z-prime equazione. Ispezionare piastre che mostrano Z-prime valori inferiori a 0,5 per determinare la fonte di scarsa separazione delle popolazioni di controllo. Hits può be selezionato usando un certo numero di metodi. Per schermi pilota è comune per calcolare la media e la deviazione standard della popolazione di controllo del veicolo e pick Giocato basato su pozzi produttori valori> / = 3 deviazioni standard dalla media dei controlli del veicolo.
7. A seguito di raccolta hit, ricontrollare risultati selezionati in duplicato in 2 set di piatti. Un set di piastre contiene la cella Kir stabile in assenza di tetraciclina e l'altra contiene la linea cellulare stabile Kir in presenza di tetraciclina. Giocato che retest positiva in almeno una delle due piastre e retest non mostrano significativa attività nelle piastre uninduced può essere considerato verificato colpi. Esaminare la lista dei risultati verificati per determinare il numero dei "nascosti" campioni di controllo sono stati rilevati. Il mancato di rilevare i comandi nella schermata pilota indica la necessità di ulteriore ottimizzazione dei parametri di indagine o di hit-picking.

Representative Results

L'uso di una tetraciclina inducibile sistema di espressione fornisce un comodo controllo interno per distinguere Tl ⁺ flusso attraverso percorsi endogeni e il canale Kir di interesse. Figura 1 mostra alcuni esempi di mappe di placcatura cellulari utilizzate in diversi tipi di esperimenti. Le posizioni dei pozzetti contenenti cellule uninduced o tetraciclina indotta sono indicati con colori diversi. Figura 2A mostra la mappa piastra sorgente utilizzato per determinare la concentrazione ottimale Tl ⁺ per lo sviluppo e test di screening composti. La sfumatura di colore rappresenta il 3 volte una serie di diluizioni che vanno dal 100% al 0.002% Tl ^+. Una mappa rappresentante intensità di fluorescenza è mostrato in figura 2B, con cool-a-caldo colori che indicano basso-alto Tl ⁺ valori di flusso, rispettivamente. La mappa placcatura cellulare mostrato in Figura 1C è stato utilizzato per questo esperimento. Una misura di un 4-parametro di funzione logistica per tegli Tl ⁺ CRC (Figura 2C) è utilizzato per determinare un valore di ₈₀ CE del 15% Tl ^+. Figura 3A mostra la mappa piastra sorgente utilizzata per determinare la tolleranza DMSO di un saggio. Le colonne 1 e 24 contengono solo tampone di saggio, mentre la sfumatura di colore indica il 2-fold serie di diluizione variabile dal 10% al 0,01% DMSO. Una mappa rappresentante intensità di fluorescenza è mostrato in figura 3B, con bassi valori di flusso TL ⁺ indicati con blu scuro. La mappa placcatura cellulare mostrato in figura 1B è stato utilizzato in questo esperimento. Le medie TL ⁺ valori di flusso registrate da pozzetti contenenti le concentrazioni indicate di DMSO sono riassunti in Figura 3C. I dati sono riportati in grafico la percentuale di Tl ⁺ flusso registrata in assenza di DMSO. Per questo particolare canale Kir, DMSO concentrazioni fino a 2,5% non ha avuto effetto sulla Tl ⁺ flusso e può quindi essere utilizzato in esperimenti. Figure 4A mostra la mappa piastra sorgente utilizzato per stabilire curve concentrazione-risposta per gli inibitori noti di un canale Kir. Ciascun composto è indicato con un colore diverso ed è tipicamente piastrate come 3-fold serie di diluizione. Una mappa rappresentante intensità di fluorescenza è illustrato nella Figura 4B. La mappa placcatura cellulare mostrato in Figura 1C è stato utilizzato per questo esperimento. Un esperimento rappresentativo che mostra l'inibizione dose-dipendente di Tl ⁺ flusso da un inibitore viene mostrato nella figura 4C. La robustezza di un saggio è determinato in cosiddetti "a scacchiera" saggi, riassunti in Figura 5. Nella piastra sorgente mappa mostrata nella figura 5A, una concentrazione massimamente efficace di un inibitore o 0,1% DMSO come controllo veicolo sono piastrate in pozzetti alternata. Figura 5B mostra una mappa rappresentativa intensità di fluorescenza. Un grafico a dispersione del flusso del picco Tl ⁺ registrato da indivial pozzi è riportata in Figura 5C. I valori medi di fluorescenza sono indicati con linea continua, mentre 3 deviazioni standard sono indicate con una linea tratteggiata. Il primo valore Z, una misura statistica di come ben separati i due popolazioni cellulari sono separati, calcolato per questa piastra è 0,75, che è ben al di sopra della soglia di 0,5 necessaria per screening ad alto rendimento.

Figura 1. Mappe placcatura cellule usate per Tl ⁺ saggio di sviluppo del flusso. (A) placcatura mappa cella utilizzata per determinare il dosaggio ottimale di Tl ⁺ concentrazione. I pozzi in colonna 1, righe A1-23, K1-12, F13-23 e P13-23 contengono cellule uninduced (-Tet). I pozzetti rimanenti contengono cellule che sono stati trattati con tetraciclina (Tet +) per indurre l'espressione dei canali Kir. (B) Cell plate mappa utilizzare per determinare la tolleranza DMSO dosaggio e ad effettuare analisi a scacchiera. Si noti che tutti i pozzetti vengono trattati con tetraciclina (Tet +). (C) piastra mappa Cell utilizzato per determinare la sensibilità del saggio di modulatori farmacologici noti. I pozzi in colonna 1 e riga A1-23 contengono cellule uninduced (-Tet). I pozzetti rimanenti contengono cellule che sono stati trattati con tetraciclina (Tet +). Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 2. Determinazione del dosaggio ottimale Tl ⁺ concentrazione. (A) piastra mappa sorgente utilizzato per determinare la concentrazione ⁺ Tl che evoca circa l'80% della massima FluoZin-2 fluorescenza aumento (EC _80). Riga A e Columns 1 e 24 (giallo) contiene una concentrazione di 12 mM 5x Tl ₂ SO _4. Le righe rimanenti contengono un 3-fold serie di diluizione che varia da 12 mM (100%) a 0,024 mm (0,002%) Tl ₂ SO _4. La serie si ripete nelle colonne 2-12 e 13-23. (B) mappa intensità della fluorescenza raffigurante Tl ⁺ flusso per ciascun pozzetto circa 1 minuto dopo l'aggiunta Tl ^+. La pseudo-colore della barra sulla destra indica le dimensioni di Tl ⁺ flusso, con i colori più freddi e più caldo che rappresentano valori di flusso alto e basso, rispettivamente. Si noti che i colori più freddi in colonna 1, righe A1-23, K1-12, F13-23 e P13-23, sono dovuti al più basso Tl ⁺ flusso in cellule uninduced. I pozzetti rimanenti, compresi quelli in colonna 24, contengono cellule che sono stati trattati con tetraciclina per indurre l'espressione dei canali Kir (vedi mappa placcatura cella in Figura 1A). (C) media ± SEM CRC per TL ^+-dipendenti variazioni nella fluorescenza (n = 3). Montaggio di un quattro parametri funzione logisticazione dei dati ha prodotto un IC ₈₀ valore del 15% Tl ^+. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 3. Tolleranza al saggio DMSO. (A) piastra mappa sorgente utilizzato per determinare la tolleranza al saggio DMSO. Le colonne 1 e 24 contengono test tampone HBSS. Le righe contengono una concentrazione di 2x 2-fold serie di diluizione DMSO variabile dal 10% al 0,01% v / v (B) Rappresentante mappa intensità di fluorescenza raffigurante Tl ⁺ flusso in ciascun pozzetto registrato circa 1 minuto dopo l'aggiunta Tl ^+. La pseudo-colore della barra sulla destra indica le dimensioni di Tl ⁺ flusso, con i colori più freddi e più caldo che rappresentano valori di flusso alto e basso, rispettivamente. (C) Media ±, SEM (n = 9) ⁺ Tl flusso normalizzato a quello registrato in presenza di tampone HBSS solo. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 4. Test di sensibilità noti composti farmacologicamente attivi. (A) piastra mappa sorgente utilizzato per valutare l'attività di composti farmacologicamente attivi noti nel Tl ⁺ dosaggio flusso. Riga A e colonne 1 e 24 contengono 0,1% v / v di DMSO. Il layout della piastra consente la sperimentazione di 10 composti in triplicato in colonne 2-23. Le righe contengono una concentrazione 2x di un 3-fold serie di diluizioni seriali dei composti da 100 micron a 2 nM (B) mappa intensità della fluorescenza raffigurante Tl ⁺ flusso per ciascun pozzetto ufficio intornoy 1 min dopo Tl ⁺ addizione. La pseudo-colore della barra sulla destra indica le dimensioni di Tl ⁺ flusso, con i colori più freddi e più caldo che rappresentano valori di flusso alto e basso, rispettivamente. Si noti che i pozzi in colonna 1 e riga A1-23 contengono cellule uninduced. I pozzetti rimanenti contengono tetraciclina indotte cellule che esprimono il canale Kir di interesse (Vedi targhetta mappa cella in Figura 1C). (C) Rappresentante Tl ⁺ cambiamenti indotti in FluoZin-2 fluorescenza nei pozzetti pre-trattati con la concentrazione indicata di un inibitore dei canali Kir. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 5. Determinazione di idoneità saggio per HTS. (A) piastra di Fontemappa utilizzato per valutare il pozzo alla ben variabilità tra pozzetti contenenti 0,1% DMSO (veicolo) o una concentrazione massimamente efficace di un inibitore noto. (B) mappa intensità della fluorescenza raffigurante Tl ⁺ flusso in ciascun pozzetto di circa 1 minuto dopo l'aggiunta Tl ^+. Si noti che tutti i pozzetti contengono tetraciclina indotte cellule che esprimono il canale Kir di interesse (Vedi piastra mappa cella in Figura 1B). (C) dispersione trama Rappresentante di steady-state valori di fluorescenza ottenuti da pozzi veicoli-inibitore o trattato. L'ampiezza media di fluorescenza di ciascun campione di popolazione è indicata con una linea continua, 3 deviazioni standard dalla media è mostrata con una linea tratteggiata, e campioni alternati per veicoli (VHL) e inibitori (INH), sono rappresentati graficamente come punti singoli. Clicca qui per ingrandisci figura .

Discussion

Trattamento: Una volta che i dati sono raccolti, un passo comune consiste nell'analisi normalizzare risposta di fluorescenza di ciascun pozzetto, F, al suo valore iniziale all'inizio dell'esperimento, F _0. Questo è comunemente indicato come "rapporto statico" e simboleggiato "F / F ^_0". Nei casi in cui è dominato F ₀ dal colorante indicatore dell'operazione rapporto statico sarà sostanzialmente per correggere molti fattori quali la disuniformità di illuminazione, raccolta del segnale, e il numero di cellule. Nei casi in cui il segnale è debole o colorante fluorescenza di fondo o riflessi nel sistema sono elevati, il rapporto statico non sarà efficace se il fondo può essere adeguatamente trattati prima di calcolare il rapporto statico. Dopo la normalizzazione dei dati, è tipico di ridurre la forma d'onda di fluorescenza di un singolo valore che verrà utilizzato per quantificare l'attività e raccogliere colpi. Più comunemente questo sarà fatto inserendo i datipunti in 10 secondi successivi aggiunta di Tl ⁺ per ottenere una pendenza iniziale della fluorescenza aumento evocata. Per il prelievo hit, un approccio popolare è di assumere che la maggior parte dei composti nella popolazione di test sono inattivi (l'ipotesi nulla è in vigore). Una media e deviazione standard viene calcolata per la popolazione prova e risultati sono selezionati che sono tre deviazioni standard dalla media.

Dividere il protocollo per incubazioni composti lunghi: Per rilevare inibitori del canale Kir, in particolare quelle che agiscono a intracellulari siti di legame, può essere utile per incubare le cellule con composti di prova per un lungo periodo di tempo (ad esempio 20 minuti) prima dell'aggiunta di Tl ^+. Se i composti vengono aggiunti "linea" prima del dosaggio è introdotto nel lettore di piastre, le proprietà ottiche dei composti di prova (ad es fluorescenza) non può essere facilmente riconosciuto e può influenzare negativamente comunemente utilizzatinormalizzazione dei dati approcci come il "rapporto statico" F / F ₀ descritto sopra causando falsi positivi e / o falsi negativi. Per evitare questo problema evitando contemporaneamente dover tenere una piastra di saggio in un lettore per un lungo periodo di incubazione, una soluzione è quella di utilizzare un "due read" protocollo. La prima lettura è un breve (ad esempio 30 secondi) esperimento in cui viene aggiunto il composto dopo 10 secondi per consentire la cattura del pre-compound aggiunta F ₀ e per valutare gli effetti ottici dei composti 'sul sistema. La lastra viene poi rimossa dal lettore e incubati per il periodo desiderato e restituito al lettore per aggiunta tallio. Dopo due letture sono completati, la prima lettura F ₀ può essere utilizzato per normalizzare i dati dalla seconda lettura evitando così molti problemi associati con l'aggiunta di composti "linea", consentendo la possibilità di mantenere il lettore occupato raccolta throughput screening dati migliorando così. L'approccio in due è più facile lettura implemented utilizzando un sistema automatico di screening. È importante notare che i due approccio lettura non elimina i problemi causati da composti fluorescenti che saturano il rivelatore e / o causare lettura artefatti nella camera CCD.

Configurazione di un saggio per attivatori: Non tutti i canali Kir sono massimamente attivati ​​in condizioni di riposo, pertanto potrebbe essere possibile progettare un saggio che può rilevare piccole molecole attivatori. In questi casi, la selezione di una concentrazione ₈₀ CE di Tl ⁺ non può fornire sufficiente "headroom" per il saggio a rilevare in modo affidabile attivatori. Così, si può scegliere di utilizzare una minore concentrazione di Tl ⁺ (es. CE ₂₀₎ nei test di attivatore. In alcuni casi, il dosaggio può mostrare bassa variabilità abbastanza da permettere l'uso di una concentrazione di ₅₀ CE Tl ⁺ e fornire ancora risoluzione appropriata sia attivato e inibito popolazioni canale. In questo caso, il dosaggio may essere condotti in doppio attivatore / inibitore modalità. Se disponibile, un noto attivatore può essere utilizzato per determinare la concentrazione appropriata Tl ⁺ di massimizzare le possibilità di scoprire attivatori dei canali.

Limitazioni: Ci sono alcune limitazioni che dovrebbero essere considerati durante lo sviluppo e l'esecuzione di un flusso di Tl ^+-based high-throughput schermo. Per esempio, il saggio si basa su una misura indiretta del canale attività Kir utilizzando una sonda fluorescente cui proprietà ottiche potrebbero essere direttamente interessati da composti in una schermata. Pertanto, le osservazioni importanti da Tl ⁺ esperimenti di flusso deve essere confermata con tensione di clamp elettrofisiologia, che è considerato il metodo "gold standard" per la farmacologia dei canali ionici. Inoltre, piccole molecole possono avere effetti diretti sulla endogeni Tl ⁺ percorsi di flusso espressi in cellule HEK-293, che porta alla identificazione di falsi positivi risultati. La tetraciclinae-inducibile sistema è particolarmente utile per distinguere falsi-positivi risultati da Kir-canale diretto modulatori perché i risultati possono essere rapidamente proiettato in cellule uninduced per effetti su percorsi endogeni. Infine, la bassa solubilità del Tl ⁺ in cloruro contenenti buffer limitare la concentrazione di Tl ⁺ che può essere usato in un saggio, che richiede l'uso di una non fisiologica stimolo Tl ⁺ tampone che può aumentare la farmacologia del bersaglio ^11. La compatibilità di buffer diversi con l'obiettivo di interesse devono essere attentamente valutati durante lo sviluppo dell'analisi. Questo può essere eseguito stabilendo CRC per modulatori noti utilizzano diversi stimoli ⁺ Tl buffer e scegliendo le condizioni in cui la farmacologia più avvicinino quella osservata utilizzando tamponi fisiologici.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
pcDNA5/TO	Invitrogen	V1033-20	Tetracycline-inducible expression vector
T-REx-HEK293 cells	Invitrogen	R71007	Tetracycline-inducible cell line
Lipofectamine LTX/Plus Reagent	Invitrogen	15338100	Transfection reagent
FBS	ATLANTA Biologicals	S11550	Cell culture media
DMEM	Invitrogen	11965	Cell culture media
Hygromycin B	Invitrogen	10687-010	Cell culture media
Blasticidin S	Invitrogen	R210-01	Cell culture media
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140	Cell culture media
HBSS-divalent free	Mediatech	21022CV	Cell washing
Trypsin-0.25%	Mediatech	25053CI	Cell dissociation
Tetracycline-HCl	Sigma	T9823	Induction reagent
Dialyzed FBS	ATLANTA Biologicals	S12650	Plating media
FluoZin-2	Invitrogen	F24189	Fluorescent dye
Pluronic F-127	Invitrogen	P-3000MP	Dye loading
HBSS	Invitrogen	14175	Assay buffer
HEPES	Invitrogen	15630	Assay buffer
NaHCO3	Sigma	S6297	Tl+ stimulus buffer
MgSO4	Sigma	M2643	Tl+ stimulus buffer
CaSO4∙2H2O	Sigma	C3771	Tl+ stimulus buffer
D-Glucose	Sigma	G7528	Tl+ stimulus buffer
Thallium sulfate	Aldrich	204625	Tl+ stimulus buffer
HEPES	Sigma	H4034	Tl+ stimulus buffer
DMSO	Sigma	D4540	Solvent
Eight-channel electronic pipettor	Biohit	E300	Cell plating in 384-well plates
BD PureCoat amine-coated 384-well plates	BD Biosciences	356719	Assay microplates
Echo qualified 384-Well polypropylene microplate (384PP)	Labcyte	P-05525	Compound source microplates
384-well polypropylene microplates	Greiner Bio-One	781280
Multidrop Combi reagent dispenser	Thermo Scientific	5840300
ELx405 microplate washer	BioTek	ELx405HT	Automated cell washing
Echo liquid handler	Labcyte	Labcyte Echo 550
Bravo automated liquid handling platform	Agilent Technologies	Standard model
Hamamatsu FDSS 6000	Hamamatsu		Kinetic imaging plate reader
Table 1. List of Materials and Reagents.