High-throughput screening för små molekyler Modulatorer för aktiv kanaler Likriktare Kalium

Summary

Metoder för att utveckla och validera en kvantitativ fluorescens analys för att mäta aktiviteten av inre likriktare kalium (KIR) kanaler för high-throughput förening screening presenteras.

Abstract

Specifika medlemmar av inre likriktare kalium (KIR) kanal familj postulerade läkemedelsmål för olika sjukdomar, inklusive högt blodtryck, förmaksflimmer, och smärta ^1,2. För det mesta har dock framsteg mot att förstå deras terapeutiska potential eller ens grundläggande fysiologiska funktioner har bromsats av bristen på goda farmakologiska verktyg. I själva verket har den molekylära farmakologi för aktiv likriktare familjen släpat långt efter S4 superfamiljen av spänningskänsliga kalium (kV) kanaler, där ett antal nanomolar affinitet och mycket selektiva peptid modulatorer toxin har upptäckts ^3. Den bigift toxin tertiapin och dess derivat är potenta hämmare av Kir1.1 och Kir3 kanaler ^4,5, men peptiderna är av begränsad användning terapeutiskt liksom experimentellt på grund av deras antigena egenskaper och dålig biotillgänglighet, metaboliska stabilitet och vävnad penetrans. Utvecklingen av potentaoch selektiva små molekyler sonder med förbättrade farmakologiska egenskaper kommer att vara en nyckel till fullo förstå fysiologi och terapeutiska potentialen hos Kir-kanaler.

Den molekylära bibliotek Sonder Production Center Network (MLPCN) som stöds av National Institutes of Health (NIH) gemensamma fonden har skapat möjligheter för akademiska forskare att inleda sond upptäckt kampanjer för molekylära mål och signalvägar i behov av bättre farmakologi ^6. Den MLPCN ger forskare tillgång till industri-screening centra och läkemedelskemi och informatik stöd för att utveckla små molekyler sonder att belysa funktionen hos gener och nätverk gen. Det kritiska steget i att få inträde till MLPCN är utvecklingen av en robust mål-eller vägen-specifik analys som är mottaglig för high-throughput screening (HTS).

Här beskriver vi hur man kan utveckla en fluorescens-baserad tallium (Tl ⁺⁾ flux assay Kir kanalens funktion för high-throughput screening förening ^7,8,9,10. Analysen är baserad på permeabiliteten hos K ⁺ kanalen por till K ⁺ kongenen Tl ^+. En kommersiellt tillgänglig fluorescerande Tl ⁺ reporterfärgämnet används för att detektera transmembranflödet av Tl ⁺ genom poren. Det finns åtminstone tre kommersiellt tillgängliga färgämnen som är lämpliga för TL ⁺ flux analyser: BTC, FluoZin-2 och FluxOR ^7,8. Detta protokoll beskriver analys utveckling med FluoZin-2. Även ursprungligen utvecklades och marknadsförs som en zink indikator, FluoZin-2 uppvisar en robust och dosberoende ökning av fluorescensemission på Tl ⁺ bindning. Vi började arbeta med FluoZin-2 innan FluxOR fanns ^7,8 och har fortsatt att göra det ^9,10. Men stegen i analysen utveckling är i huvudsak identiska för alla tre färger, och användarna bör avgöra vilken färg som är mest lämplig för deras specifika NEEDS. Vi diskuterar också analysens prestandatester som måste nås för att komma i fråga för tillträde till MLPCN. Eftersom Tl ⁺ lätt genomsyrar de flesta K ^+-kanaler, bör analysen kunna anpassas till de flesta K ⁺ kanaler mål.

Protocol

1. Generering av stabila Polyklonala cellinjer

1. Inrättandet av en hög kvalitet stabil cellinje som uttrycker Kir-kanalen av intresse är ett viktigt första steg mot att utveckla en robust high-throughput screening-analysen. Konstitutiv K ⁺ kanalen överuttryck kan leda till aktivering av vägar med celldöd, stabil cellinje degeneration och förlust av analysens prestanda. För att undvika dessa potentiella problem och ger en bekväm intern kontroll för analys utveckling (se nedan), är en tetracyklin-inducerbart expressionssystem rekommenderas ^8.
2. Kultur det parentala T-REx-HEK293-celler med användning av standardtekniker i B-medium (DMEM tillväxtmedium innehållande 10% FBS, 50 U / ml penicillin, 50 pg / ml streptomycin och 5 | ig / ml blasticidin S). Använd tidig passage celler (t.ex. 3-4 stycken sedan upptining av flytande kväve lagring) för transfektion och stabil klon urval.
3. Plate 4 miljoner T-rex-HEK293-celler i en75 cm ^2-kolv så att kolven är ungefär 80% sammanflytande följande dag. Kultur över natten i en 5% _{CO-2-inkubator} vid 37 ° C.
4. Transfektera cellerna med användning av 10-15 ^ g pcDNA5/TO-Kir DNA och Lipofectamine LTX / Plus reagens enligt tillverkarens protokoll. Efter 5 timmar, byt transfektion mediet med B-medium.
5. 24 timmar efter transfektion, byt B-mediet med B-medium innehållande 250 pg / ml Hygromycin (BH-medium) för att börja en stabil klon val. Mata cellerna var 2-3 dagar med färskt BH-medium.
6. Större än 90% av cellerna skulle dö under de närmaste dagarna 7 och lämnar bakom små kolonier av stabilt transfekterade celler. Låt kolonierna att växa i ytterligare 10-14 dagar innan uppdelning till en 175 cm ^2-kolv för expansion.
7. För kryokonservering, frysa 3 x 10 ⁶ celler / ml i media innehållande 45% konditionerat BH-medium, 45% antibiotika-fri, seruminnehållande DMEM och 10% DMSO. Fryscellerna över natten vid -80 ° C i en cell fryser behållare och sedan flytta till flytande kväve för långtidsförvaring. Tina celler från flytande kväve med Invitrogen rekommenderade protokoll. Observera att viabiliteten hos cellerna blir lägre om de frysta från en kolv som är större än 75% sammanflytande vid tiden för behandlingen.

2. Generering av stabila monoklonala cellinjer

1. Tvätta en sub-sammanflytande 75 cm ² kolv av stabila polyklonala celler med tvåvärda-fria HBSS. Tillsätt 1 ml trypsin och inkubera under 3-5 minuter i en 5% _{CO-2-inkubator} vid 37 ° C. Tillsätt 5 ml av BH-medium till kolven för att inhibera trypsinaktivitet och triturera upprepat (t.ex. 5 gånger) för att till fullo dissociera cellerna. Försiktigt inspektera cellerna i mikroskop för att garantera uppskjutandet består nästan helt av enskilda celler. Detta kommer att öka sannolikheten att erhålla monoklonala cellinjer.
2. Bestäm celldensiteten och spädsuspensionen till en koncentration av 0,7 celler per 20 pl. Med hjälp av en flerkanals pipett, pipett 20 ul av cellsuspensionen i varje brunn i BD PureCoat amin-belagd (eller motsvarande poly-D-lysin belagda) 384-brunnsplattor. I princip bör 70% av brunnarna får en cell med dessa plätering villkor. Därför bör en 384-brunnar innehålla mer än 200 kloner att analysera. Fortsätta odla cellerna i en 5% _{CO-2-inkubator} vid 37 ° C.
3. Efter en vecka, inspektera plattorna under ett mikroskop för brunnar innehållande ensamma kolonier. Notera sin position på locket med en permanent markör för framtida referens. Var noga med att också notera och omfattar brunnar innehåller flera kolonier. Dessa är lättast igen genom uppträdandet av kolonier som växer från flera sidor av brunnen. Var medveten om att avdunstning tenderar att inträffa snabbare från brunnar nära kanten av plattan. Lägg BH-medium till brunnarna där betydande avdunstning har inträffat. Annars är det inte nödvändigt to mata cellerna.
4. Övervaka brunnarna oftare under de kommande 7-10 dagar. Cellerna kommer att vara redo att dela när brunnarna av intresse är minst 50% sammanflytande.
5. Dela upp cellerna att duplicera 384-brunnsplattor, en platta för analys med Tl ^+-flöde och den andra för att fortsätta de monoklonala linjer i odling. Aspirera mediet från brunnarna innehållande cellinjerna av intresse. Tvätta cellerna med tvåvärd-fritt HBSS, tillsätt 20 pl trypsin till varje brunn och överföra plattan till en 37 ° C inkubator i 15-20 min. Efter att ha flyttat plattan tillbaka till cellkulturen huven, tillsätt 20 pl av BH-medium till varje brunn och triturera flera gånger för att dissociera cellerna. Inspektera brunnarna under ett mikroskop för att säkerställa att cellerna är fullt dissocierade. Detta kan kräva flera omgångar av pipettering, eftersom cellerna kommer att vara tätt vidhäftande. När cellerna dissocieras, överför 10 | il av varje cellsuspension till dubbla brunnar i en ny BD PureCoat amin-belagd 384-brunnsplatta. Var noga med att notera sambandet mellan källan väl och duplicera destination brunnar så att de kloner som uppvisar stark Kir-kanal aktivitet (se nedan) kan spåras tillbaka till den ursprungliga brunn. Tillsätt 20 | il av BH-medium till den ursprungliga källan väl att mata de återstående cellerna och fortsätta dem i odling i 5% CO ₂ inkubator vid 37 ° C.
6. Låt cellerna i destinationen plattan att vidhäfta och växa upp till en vecka. När de flesta av klonerna når minst 50% konfluens, kan de utvärderas för Kir kanalaktivitet med Tl ^+-flöde analys som beskrivs nedan.
7. Dagen före analysen, aspirera odlingsmediet och ersätta den med BH-medium innehållande 10% dialyserad FBS. Detta förhindrar oavsiktlig kanal uttryck som skulle kunna uppstå tetracyklin förorenat serum. Inducera Kir kanal uttryck i endast en av de dubbla brunnar för varje klon genom att inkludera 1 pg / ml tetracyklin. Ett duplikat oinducerat väl kommer att fungera som en"Bakgrund" kontroll. Utför Tl ⁺ analyser flux som beskrivs härnäst.

3. Allmänt Tl ⁺ Flux Analysprocedur

1. Dagen före en Tl ^+-flöde experiment dissociera cellerna och kvantifiera densiteten av cellsuspensionen som beskrivs i avsnitt 2,1 och 2,2. Plate 20.000 monoklonala celler stabilt transfekterade med en Kir kanal gen av intresse i varje brunn av en BD PureCoat amin-belagd 384-brunnars platta med användning av en Thermo Multidrop Combi eller en flerkanalig pipett. Använd BH medium innehållande 10% dialyserat FBS för plätering. Observera att vissa celler kommer att odlas över natt med 1 ^ g / ml tetracyklin för att inducera Kir kanal uttryck, medan andra inte. Placeringen av inducerade och icke-inducerade celler kommer att skilja för varje typ av experiment och visas i figur 1.
2. Nästa dag, inspektera plattorna under ett mikroskop för att säkerställa att cellerna är vidhäftande och jämnt fördelade över bottnenav brunnarna. Brunnarna skall vara 80-90% sammanflytande.
3. Använd en ELx405 Mikrotiterplatta Bricka att ersätta cellodlingsmedium med 20 fil per brunn av HBSS analysbuffert innehållande 20 mM HEPES och buffrad till pH 7,3 med NaOH. Alternativt kan man använda en "knäpp och slam"-metoden, där plattan är inverterad och knäppte ner kraftigt för att mata ut mediet i en avfallsbehållare, och sedan klappade på staplade pappershanddukar för att ta bort kvarvarande material. Omedelbart lägga tillbaka HBSS analysbuffert till plattan för att förhindra cellerna från uttorkande.
4. Förbered FluoZin-2, AM färg lastning lösning. Efter en kort centrifugering av röret, lös 50 ig FluoZin-2 pulver i 100 pl vattenfri DMSO. Vid denna punkt, kan alikvoter av 1.000 x stamlösning förvaras vid -20 ° C för senare användning. När du är redo att använda, tillsätt 50 ul av en 20% vikt per volym Pluronic F-127/DMSO lösning till färgämnet och blanda med försiktig pipettering. Frys inte färgen när Pluronic F-127 har lagts till, somlåg temperatur kan orsaka ytaktiva att fällas ut ur lösningen. Tillsätt 150 | il volym av FluoZin-2, AM/Pluronic-F127 till 100 ml HBSS analysbuffert och blanda försiktigt för att göra färgämnet laddningsbuffert. Med hjälp av en Multidrop Combi eller flerkanaligt Tillsätt 20 ul färg laddningsbuffert till varje brunn som redan innehåller 20 ul HBSS analysbuffert. Inkubera cellerna vid rumstemperatur under ca 1 h (typiskt inkubation har gjorts i mörkret, men det finns inga direkta bevis för att det är nödvändigt).
5. Medan cellerna lastning med färg, förbereda en Tl ⁺ stimulans plattan. Nyligen lös 0,5 g natriumbikarbonat i 50 ml 5x Tl ⁺ stimulus buffert innehållande 1 sulfat mM magnesiumklorid, 1,8 mM kalciumsulfat, 5 mM glukos, 10 mM HEPES och 12 mM Tl ⁺ sulfat. Alternativt kan natriumbikarbonat ersättas med natriumglukonat om, till exempel, måste lösningens pH hållas inom ett mycket snävt intervall och förlust av koldioxidär ett bekymmer. Förslut röret tätt begränsa läckage av koldioxid och invertera flera gånger tills natriumbikarbonat går i lösning. Med hjälp av en flerkanals pipett, tillsätt 50 pl av lösningen till varje brunn av en polypropen 384-brunnars platta (tabell 1).
6. Efter att cellerna har laddats med FluoZin-2, AM, tvätta plattorna med ett ELx405 Mikrotiterplatta Bricka eller använda "flick och slam"-metoden, som beskrivs ovan i avsnitt 3,3. Beroende på vilken typ av Tl ^+-flöde försök som skall utföras, lägger tillbaka 20 pl eller 40 pl HBSS analysbuffert till varje brunn. Plattorna är nu redo för experiment.
7. Cellen och Tl ⁺ plattor i en Hamamatsu Funktionell Drug Screening System (FDSS) eller motsvarande kinetisk avbildning plattläsare med integrerad vätska utlämning kapacitet. Använd lämpliga filter för fluorescein / fluorescein-baserade färgämnen som Fluo-4.
8. Inrätta en enda tillägg protokoll så att 10 ^ 5x Tl ⁺serien läggs till de motsvarande brunnarna i cellplattan innehållande 40 pl av HBSS analysbuffert. Registrering baslinjen fluorescens vid en 1 Hz samplingsfrekvens för minst 10 sekunder. Den väl till väl fluorescens bör vara enhetliga och stabila över plattan när optimal cell plätering, tvättning och färg lastförhållanden är etablerade. En integrerad 384-kanals pipett används för att samtidigt lägga till Tl ⁺ stimulans buffert till varje brunn.
9. Registret under åtminstone 2 minuter, så att hastigheten och toppen av Tl ^+-inducerad ökning i fluorescens fångas för off-line analys.

4. Fastställande av Optimal Tl + Koncentration

1. Tl ⁺ genomsyrar lätt mest inåt likriktare K ^+-kanaler. För att säkerställa att Tl ^{^-koncentrationer} inte överskrider det dynamiska området för Tl ⁺ reporter dye FluoZin-2, bör man bestämma empiriskt den optimala Tl ^{+-koncentration} som skall användas i en hög-Throughput skärm. Vi rekommenderar en Tl ^{+-koncentration} som framkallar 80% av den maximala responsen fluorescens (EG ₈₀₎ under betingelser där kanalen är maximalt aktiverade.
2. Tavla, färg belastning och tvätta cellerna i BD PureCoat amin-belagda eller motsvarande poly-D-lysin-belagda 384-brunnar som beskrivs ovan i avsnitt 3, vilket 40 il HBSS analysbuffert i varje brunn. Såsom visas i plattan kartan i figur 1A, kolumn 1 och raderna A1-A23 bör innehålla celler som inte har inducerats med tetracyklin och därför inte uttrycker Kir intressanta kanalen. De FluoZin-2 fluorescenssignaler från de oinducerade brunnarna kommer att användas för att bestämma nivån av Tl ^+-flöde genom endogena vägar, såsom Na ⁺ - K ^+-ATPas pump och spänning gated K ^+-kanaler, som normalt uttrycks i HEK- 293-celler.
3. Använd en Agilent Bravo automatiserad plattform Vätskehantering eller manuell pipettering att förbereda enelva punkter Tl ^{+-koncentration} spädningsserier i HBSS testbuffert. Typiskt är en 3-faldig serieutspädning serie som sträcker sig från 100% till 0,002% Tl ⁺ utvärderades i analysen. Serien ska bestå i en 5x koncentration eftersom TL ⁺ lösningar spädas 1:5 i den slutliga analysen. Förbered spädningsserie genom utspädning av standardlösningen 5x Tl ⁺ buffert beskrivs i avsnitt 3 med en 5x Tl ^+-fri buffert innehållande 1 sulfat mM magnesium, 1,8 mM kalciumsulfat, 5 mM glukos och 10 mM HEPES. Återigen, nyligen lösa 0,5 g natriumbikarbonat i 50 ml av den slutliga Tl ⁺ buffert omedelbart före plätering i en polypropen 384-brunnars platta enligt plattan kartan som visas i figur 2A.
4. Fyll cellen och TL ⁺ plattor stimulanspaket i FDSS. Inrätta en enda tillägg protokoll så att 10 ^ 5x Tl ⁺ serien läggs till motsvarande brunnar i cellen plattan innehållande 40 pl HBSS-analysbuffert. Rekord baslinje FluoZin-2 fluorescens i 10 sekunder innan du lägger Tl ⁺ till plattan. Upprepa försöket på 3 separata dagar för att fastställa resultatens reproducerbarhet.

5. Bestämning av analyskänslighet till DMSO

1. De små molekyler som förhördes i en hög genomströmning skärm löses i det organiska lösningsmedlet dimetylsulfoxid (DMSO), som i sig kan påverka prestanda för analysen. Därför måste analysen känslighet för DMSO först undersökas för att fastställa den högsta DMSO-koncentrationen tillåtna på skärmen.
2. Tavla, färg belastning och tvätta cellerna i BD PureCoat amin-belagd 384-brunnar som beskrivs ovan i avsnitt 3, vilket 20 il HBSS analysbuffert i varje brunn. Hela plattan bör innehålla celler som har inducerats med tetracyklin (figur 3A).
3. Använd en Bravo automatiserad plattform Vätskehantering eller manuell pipettering att förbereda en elva-punkt DMSO koncentration spädningsserier i HBSS analysbuffert. Typiskt är en 2-faldig spädningsserie som varierar från 10% till 0,01% volym / volym DMSO utvärderades för aktivitet i analysen. Serien bör bestå i en 2x koncentration eftersom DMSO-lösningar kommer att spädas med hälften i den slutliga analysen. Spädningsserien bör pläteras i en polypropen 384-brunnars platta, enligt plattan kartan som visas i Figur 3A.
4. Förbered en 5x Tl ⁺ stimulans platta baserad på EG ₈₀ eller optimala Tl ^{+-koncentration} som fastställs i avsnitt 4.
5. Fyll i cellen, DMSO och TI ⁺ stimulans plattor i FDSS. Inrätta ett två-add protokoll så att 20 pl av 2x koncentrationen DMSO-serien sätts till motsvarande brunnar i cellen plattan innehållande 20 pl av HBSS analysbuffert. Lämna DMSO på cellerna för samma tid cellerna kommer att utsättas för liten molekyl fordon under en skärm. Rekord baslinje FluoZin-2 fluorescens underminst 10 sekunder före tillsats 10 pl 5x Tl ⁺ buffert till varje brunn i cellplattan. Upprepa försöket på 3 separata dagar för att fastställa resultatens reproducerbarhet.
6. Analysen bör vara tolerant mot DMSO koncentrationer av minst 0,1% vol / vol för en typisk hög genomströmning skärm i vilka föreningar testas vid en koncentration av 10 pM.

6. Bestämning av analyskänslighet till Kända Farmakologiska modulatorer

1. Efter bestämning av optimala Tl ^{+-koncentrationen} och DMSO tolerans analysen effekterna av kända farmakologiskt aktiva ämnen på Kir-kanal-medierad Tl ⁺ flöde bör undersökas. Denna serie experiment kommer att bedöma analysens känslighet, förmåga att rang-ordningen föreningar baserade på deras styrka, förmåga att kategorisera föreningar baserade på deras sätt att effekt (t.ex. aktivator, hämmare), och identifiera skötsamma kontroll föreningar som skall användas senare i analysen dUTVECKLING och skärm.
2. Tavla, färg belastning och tvätta cellerna i BD PureCoat amin-belagd 384-brunnar som beskrivs ovan i avsnitt 3, vilket 20 il HBSS analysbuffert i varje brunn. Kolumn 1 och raderna A1-A23 bör innehålla celler som inte har inducerats med tetracyklin (figur 4A).
3. Använd en Bravo automatiserad plattform Vätskehantering eller manuell pipettering att förbereda en elva punkter serie koncentration utspädning av kända modulatorer i HBSS analysbuffert. Typiskt är en 3-faldig spädningsserie som varierar från 100 pM till 2 nM utvärderades med avseende på aktivitet i analysen. Serien bör bestå i en 2x koncentration eftersom DMSO-lösningar kommer att spädas med hälften i den slutliga analysen. Spädningsserien bör pläteras i triplikat i en polypropen 384-brunnars platta, enligt plattan kartan som visas i figur 4A. Vara säker på att spädningar görs så att den slutliga DMSO koncentrationerna är desamma mellan läkemedelsbehandling och mindre tha n eller lika med den högsta tillåtna DMSO-koncentrationen definieras i avsnitt 5.
4. Förbered en 5x Tl ⁺ stimulans platta baserad på den optimala Tl ⁺ koncentration som fastställs i avsnitt 4.
5. Fyll i cellen, förening och TL ⁺ plattor stimulanspaket i FDSS. Inrätta ett två-add protokoll så att 20 pl den 2x koncentrationen föreningen serien sättes till motsvarande brunnar i cellen plattan innehållande 20 pl av HBSS analysbuffert. Lägg föreningarna till cellplattan och inkubera i upp till 20 minuter. Notera att den optimala inkubationstiden för föreningarna att detektera den bästa signalen till bakgrundsförhållande kan bestämmas genom att köra en serie experiment där par olika inkubationstider väljs. Registrering baslinje FluoZin-2 fluorescens under minst 10 sekunder före tillsats 10 pl 5x Tl ⁺ buffert till varje brunn i cellplattan. Upprepa försöket på 3 separata dagar för att fastställa resultatens reproducerbarhet.

_title "> 7. Checkerboard Analys

1. I nästa serie av experiment, kommer enhetligheten och reproducerbarheten av analysen utvärderas med hjälp av en "schackbräde"-analys. Typiskt är en kontroll-inhibitor pläteras i varannan brunn av varje kolumn och rad i en 384-brunnars platta, såsom visas i fig 5A. Strikt bedöma bullret i analysen, bör en EG ₈₀ inhibitorkoncentration användas. DMSO sättes till de andra brunnarna som en vehikelkontroll. Tl ⁺ flöde i DMSO-och läkemedels-behandlade celler används för att beräkna ett värde för Z Prime, ett statistiskt mått på well-to-väl variationsrikedomen bland de två populationer av brunnar. Z Prime beräknas enligt följande formel:
   Z Prime = 1 - (3SD _p + 3SD _n) / | betyda _p + betyder _n |
   där SD är standardavvikelse, p ohämmad flöde och n är helt inhiberad flux värden. En analys med Z-värden större än eller lika med 0,5 på 3 olika dagar kan anses suitable för high-throughput screening.
2. Tavla, färg belastning och tvätta cellerna i BD PureCoat amin-belagd 384-brunnar som beskrivs ovan i avsnitt 3, vilket 20 il HBSS analysbuffert i varje brunn. Notera att hela plattan bör induceras med tetracyklin.
3. Gör en förening / DMSO platta genom pipettering in i ett 384-väl polypropen platta med användning av en flerkanalig pipett, 80 pl / brunn av en känd inhibitor av målet Kir kanalen vid den koncentration som bestämts i avsnitt 6,5, och 0,1% volym / volym DMSO fordon såsom visas i figur 5A. Lägg den kända hämmaren start i brunn A1 med flera kanaler pipett och suppleanter väl B2 och så vidare upp till väl B24. Upprepa denna procedur med DMSO start i väl B1 och så vidare upp till väl A24. Den slutliga utformningen av plattan ska matcha som en schackrutiga.
4. Förbered en 5x Tl ⁺ stimulans platta baserad på den optimala Tl ⁺ bestämts enligt punkt 4.
5. Ladda cellen, föreningen och Tl ⁺ stimulans plattor i FDSS. Inrätta ett två-add protokoll så att 20 pl den 2x koncentrationen föreningen serien sättes till motsvarande brunnar i cellen plattan innehållande 20 pl av HBSS analysbuffert. Lägg föreningarna till cellplattan och inkubera i upp till 20 minuter vid rumstemperatur. Registrering baslinje FluoZin-2 fluorescens under minst 10 sekunder före tillsats 10 pl 5x Tl ⁺ buffert till varje brunn i cellplattan. Upprepa försöket på 3 separata dagar för att fastställa resultatens reproducerbarhet.

8. Pilot Skärm

1. I slutskedet av analysutveckling, utför en pilot skärm av några tusen föreningar för att utvärdera analysens prestanda under förhållanden som kommer att användas så småningom i den storskaliga hög genomströmning skärm.
2. Tallrik, färgämne belastning och tvätta cellerna i BD PureCoat amin-belagda 384-brunnsplattor såsom beskrivits ovan i avsnitt 3), vilket 20 pl HBSS analysbuffert i varje brunn.Observera att hela plattan ska odlas över natten med tetracyklin för att inducera Kir-kanal uttryck.
3. Välj cirka 2.000 till 3.000 strukturellt olika föreningar som skall testas. Det är ofta lämpligt och bekvämt att använda föreningar samlingar med kända aktiviteter potentiellt berikade för jonkanal modulatorer. Sådana samlingar inkluderar Spectrum Collection (MicroSource) och LOPAC samlingen (Sigma). Dessutom är det klokt att ta med kända modulatorer av Kir av intresse i pilot-skärmen. Helst dessa föreningar kommer att läggas till brunnar i en blint sätt för att möjliggöra en objektiv provning av metoder drabbade plockning beskrivs senare. Förbered föreningar i 384-brunnars polypropylen plattor (destination plattor) med en Labcyte Handler Echo Vätska eller lämpligt stift verktyg för att överföra en lämplig volym av utvalda föreningar i DMSO från MLPCN samlingen (källa plattor) till destinationen plattorna Observera att testföreningama är endast i kolumnerna 3-22;I alla andra väl kolumner 1, 2, 23, 24 lägga till en känd inhibitor vid en känd koncentration till fullo hämma Kir bestämd enligt punkt 7. I övriga brunnar i kolumnerna 1, 2, 23 och 24 lägga till lämplig volym DMSO för att producera DMSO koncentration matchade vehikelkontroller. Späd alla brunnar med analysbuffert med Multidrop Combi. Vanligtvis testföreningar blir 20 M, 2-faldigt över sitt mål screening koncentration.
4. Gör Tl ⁺ stimulans plattor baserade på den optimala Tl ⁺ koncentration som fastställs i avsnitt 4.
5. Kör piloten skärmen. Var noga med att sprida steg i protokollet avrättning för att upprätthålla konsekvent timing mellan plattorna i pilotgranskningsprojekt sikt.
6. När piloten skärmen klar analysera checkerboard brunnarna från kolumnerna 1, 2, 23 och 24 med användning av Z-prime ekvation. Kontrollera plattor som visar Z-prime värden mindre än 0,5 för att bestämma orsaken till dålig separation av kontroll populationer. Hits Be väljs med ett antal metoder. För pilot skärmar är det vanligt att beräkna medelvärdet och standardavvikelsen för bärarkontroll populationen och plocka träffar baserade på brunnar som producerar värden> / = 3 standardavvikelser från medelvärdet av fordonets reglage.
7. Efter träffen plockning, retest utvalda träffar i två exemplar på 2 uppsättningar av plattor. En uppsättning plattor innehåller den stabila Kir cellen i frånvaro av tetracyklin och den andra innehåller den stabila linjen Kir cell i närvaro av tetracyklin. Träffar som retest positiva i åtminstone en av de två plattorna retest och misslyckas med att visa signifikant aktivitet i de oinducerade plattorna kan anses verifieras träffar. Undersök kontrollerade träfflistan för att avgöra hur många av de "dolda" kontrollprover upptäcktes. Underlåtenhet att upptäcka kontrollerna i pilot skärmen visar behovet av ytterligare optimering av screening eller träff-picking parametrar.

Representative Results

Användningen av en tetracyklin-inducerbart uttryckssystem ger en bekväm intern kontroll för att skilja Tl ⁺ flödet genom endogena vägar och Kir kanalen av intresse. Figur 1 visar några exempel på kartor cell plätering används i olika typer av experiment. Positionerna för brunnar innehållande oinducerade eller tetracyklin-inducerade celler indikeras med olika färger. Figur 2A visar kartan källplattan som används för att bestämma den optimala Tl ^{+-koncentration} för analys utveckling och screening av förening. Färggradienten representerar 3-faldig spädningsserie som varierar från 100% till 0,002% Tl ^+. Ett representativt fluorescensintensitet kartan visas i figur 2B, med kallt till varma färger indikerar lägsta till högsta Tl ⁺ flux värdena. Cellen bordläggningen karta som visas i figur 1C användes för detta experiment. En passning av en 4-parameters logistisk funktion till than Tl ⁺ CRC (figur 2C) används för att bestämma ett EG ₈₀ värde på 15% TI ^+. Figur 3A visar en karta källplattan används för att bestämma DMSO-tolerans av en analys. Kolumnerna 1 och 24 innehåller analysbuffert endast, medan färgen gradienten indikerar 2-faldig spädningsserie som varierar från 10% till 0,01% DMSO. En representativ fluorescensintensitet karta visas i figur 3B, med låga Tl ⁺ flux värden som anges med mörkare blå. Cellen bordläggningen karta som visas i figur 1B användes i detta experiment. De genomsnittliga Tl ⁺ flux värden som registrerats från brunnar innehållande de angivna koncentrationerna av DMSO sammanfattas i figur 3C. Uppgifterna plottas som procent Tl ^+-flöde registreras i frånvaro av DMSO. För detta Kir-kanal hade DMSO koncentrationer upp till 2,5% ingen effekt på Tl ⁺ flöde och kan därför användas i försök. Fig.ure 4A visar kartan källplattan används för att etablera koncentration-responskurvor för kända inhibitorer av en Kir kanal. Varje förening anges med en annan färg och är typiskt pläteras som en 3-faldig spädningsserie. En representativ fluorescensintensitet karta visas i figur 4B. Cellen bordläggningen karta som visas i figur 1C användes för detta experiment. Ett representativt experiment som visar dosberoende hämning av Tl ^+-flöde genom en inhibitor visas i figur 4C. Robustheten i en analys bestäms i så kallade "checkerboard"-analyser, som sammanfattas i figur 5. I källplattan kartan som visas i figur 5A, en maximalt effektiv koncentration av en inhibitor eller 0,1% DMSO som en vehikelkontroll stryks i alternerande brunnar. Figur 5B visar ett representativt fluorescensintensitet karta. En spridningsdiagram av toppen Tl ⁺ flöde in från individuelltal brunnar plottas i figur 5C. De genomsnittliga fluorescensvärden indikeras med heldragen linje, medan 3 standardavvikelser indikeras med en prickad linje. Z Prime värde, en statistiskt mått på hur väl separerade de två cellpopulationerna separeras, beräknade för denna platta är 0,75, vilket är väl över 0,5 tröskel som krävs för high-throughput screening.

Figur 1. Cell plätering kartor som används för TL ⁺ flux-analys utveckling. (A) Cell bordläggningen kartan använder för att bestämma den optimala analysen Tl ^{+-koncentration.} Brunnarna i kolumn 1, raderna A1-23, K1-12, F13-23 och P13-23 innehåller oinducerade celler (-Tet). De återstående brunnarna innehåller celler som behandlades med tetracyklin (+ Tet) att inducera Kir kanal uttryck. (B) Cell PLAte map använder för att bestämma toleransen analysen DMSO och utföra schackrutiga analys. Observera att alla brunnarna behandlas med tetracyklin (+ Tet). (C) cellplattan karta används för att bestämma analysens känslighet för kända farmakologiska modulatorer. Brunnarna i kolumn 1 och rad A1-23 innehåller oinducerade celler (-Tet). De återstående brunnarna innehåller celler som behandlades med tetracyklin (+ Tet). Klicka här för att se större bild .

Figur 2. Bestämning av optimala assay Tl ^{+-koncentration.} (A) Källa platta karta används för att bestämma Tl ⁺ koncentrationen som framkallar approximativt 80% av den maximala FluoZin-2 fluorescens ökning (EG _80). Rad A och kolonnns 1 och 24 (gul) innehåller en 5x koncentration av 12 mm TL ₂ SO _4. De återstående raderna innehåller en 3-faldig utspädningsserie som sträcker sig från 12 mM (100%) till 0,024 mm (0,002%) Tl ₂ SO _4. Serien upprepas i kolumnerna 2-12 och 13-23. (B) Fluorescensintensitet karta visar Tl ^+-flöde för varje brunn ungefär 1 min efter Tl ⁺ tillsats. Pseudo-färgfältet till höger visar omfattningen av Tl ⁺ flöde, med svalare och varmare färger representerar låga och höga flux värdena. Observera att de svalare färger i kolumn 1, raderna A1-23, K1-12, F13-23 och P13-23 beror på låga Tl ⁺ flöde i oinducerade celler. De återstående brunnarna, inklusive de i kolumn 24, innehåller celler som behandlades med tetracyklin för att inducera Kir-kanal uttryck (se karta celler plätering i figur 1A). (C) Medelvärde ± SEM CRC för Tl ^+-beroende förändringar i fluorescens (n = 3). Montering av fyra-parameter logistisk funktionning till de uppgifter som framkommit ett IC ₈₀ värde av 15% Tl ^+. Klicka här för att se större bild .

Figur 3. Assay tolerans mot DMSO. (A) Källa platta karta används för att bestämma test tolerans för DMSO. Kolumnerna 1 och 24 innehåller buffert HBSS analys. Raderna innehåller en 2x koncentration av en 2-faldig DMSO spädningsserie som varierar från 10% till 0,01% v / v (B) representant fluorescensintensitet karta som visar Tl ⁺ flöde i varje brunn registreras ca 1 min efter Tl ⁺ tillägg. Pseudo-färgfältet till höger visar omfattningen av Tl ⁺ flöde, med svalare och varmare färger representerar låga och höga flux värdena. (C) Medelvärde ±, SEM (n = 9) Tl ⁺ flöde normaliserad som registreras i närvaro av HBSS analysbuffert ensam. Klicka här för att se större bild .

Figur 4. Analyskänsligheten kända farmakologiskt aktiva föreningar. (A) Källa platta karta används för att bedöma aktiviteten hos kända farmakologiskt aktiva föreningar i Tl ^+-flöde analys. Rad A och kolumn 1 och 24 innehåller 0,1% volym / volym DMSO. Plattan layouten möjliggör testning av 10 föreningar i tre exemplar i kolumner 2-23. Raderna innehåller en 2x koncentration av en 3-faldig serieutspädning serie av föreningar från 100 pM till 2 nM (B) Fluorescensintensitet karta visar Tl ^+-flöde för varje brunn approximately 1 min efter Tl ⁺ tillägg. Pseudo-färgfältet till höger visar omfattningen av Tl ⁺ flöde, med svalare och varmare färger representerar låga och höga flux värdena. Observera att brunnar i kolumn 1 och rad A1-23 innehåller oinducerade celler. De återstående brunnarna innehåller tetracyklin-inducerade celler som uttrycker Kir intressanta kanalen (se karta cellplattan i figur 1C). (C) Representativa Tl ^+-inducerade förändringar i FluoZin-2 fluorescens i brunnar som förbehandlats med den angivna koncentrationen av en Kir-kanal-hämmare. Klicka här för att se större bild .

Figur 5. Bestämning av analys lämplighet för HTS. (A) Källa plattakarta används för att utvärdera den väl till-brunn variabilitet bland brunnar innehållande 0,1% DMSO (vehikel) eller ett maximalt effektiv koncentration av en känd inhibitor. (B) Fluorescensintensitet karta som visar Tl ⁺ flöde i varje brunn ca 1 min efter Tl ⁺ tillägg. Observera att alla brunnar innehåller tetracyklin-inducerade celler som uttrycker Kir intressanta kanalen (Se karta celler plattan i figur 1B). (C) Representativa punktdiagram av steady-state fluorescensvärden erhållna från fordonet-eller inhibitor-behandlade brunnar. Den genomsnittliga fluorescens amplituden för varje provpopulation indikeras med en heldragen linje, är 3 standardavvikelser från medelvärdet visas med en streckad linje, och alternerande prover för fordon (VHL) och inhibitor (INH) plottas som enskilda punkter. Klicka här för att visa större bild .

Discussion

Data behandling: När data samlas in, innebär en gemensam steg i analysen normalisera varje brunn är fluorescens svar, F, till sitt ursprungliga värde vid början av experimentet, F _0. Detta brukar kallas "statiska förhållandet" och symboliserade "F / F ^_0". I de fall där F ₀ domineras av indikatorfärgämnet den statiska förhållandet operationen väsentligt kommer att korrigera för många faktorer som disuniformities i belysning, signaler insamling, och cellantal. I fall där färgämnet signalen är svag eller bakgrundsfluorescens eller reflektioner i systemet är hög, kommer den statiska förhållandet inte vara effektiv om inte bakgrunden kan hanteras på lämpligt sätt före beräkningen av statiska förhållandet. Efter uppgifter normalisering, är det typiskt att reducera fluorescens vågformen till ett enda värde som kommer att användas för att kvantifiera aktiviteten och plocka träffar. Vanligast kommer detta att ske genom anpassning av datapunkter i 10 sekunder efter tillsats av Tl ⁺ för att erhålla en initial lutning av den framkallade fluorescensen ökar. För hit plockning, är en populär metod att anta att den stora majoriteten av föreningar i testet befolkningen är inaktiva (nollhypotesen är i kraft). En medelvärde och standardavvikelse beräknas för testpopulationen och träffar väljs som är tre standardavvikelser från medelvärdet.

Dela upp protokollet för långa sammansatta inkubationer: För att upptäcka Kir kanal-hämmare, särskilt de som verkar på intracellulära bindningsställen kan det vara värdefullt att inkubera cellerna med testföreningarna under en längre tid (t.ex. 20 minuter) före tillsats av TI ^+. Om föreningar tillsätts "offline" innan analysen införes till plattläsaren, kan de optiska egenskaperna hos testföreningar (t.ex. fluorescens) inte lätt igen och kan påverka vanligen användsuppgifter normalisering tillvägagångssätt, t.ex. "statiska förhållandet" F / F ₀ beskriven ovan resulterar i falska positiva och / eller falska negativa. För att undvika detta problem samtidigt undvika att behöva hålla ett testplatta i en läsare för en lång inkubation är en lösning för att använda en "två läsning" protokoll. Den första läsning är en kort (t.ex. 30 sek) experiment där föreningen tillsätts efter 10 sekunder för att låta fånga av pre-föreningen tillägg F ₀ och bedöma de föreningar "optiska effekter på systemet. Plattan avlägsnas därefter från läsaren och inkuberas under önskad tid och returneras till läsaren för tallium tillsats. Efter båda läsningar är klara den första läs F ₀ kan användas för att normalisera data från den andra läsa därmed undvika många problem i samband med att lägga föreningar "offline" samtidigt som möjligheten att hålla läsaren upptagen samla in uppgifter och därmed förbättra screening genomströmning. De två lästa strategi är lättast implemented vid användning av en automatiserad screening-system. Det är viktigt att notera att de två läs strategi inte kommer att eliminera problem som orsakas av fluorescerande föreningar som mätta detektorn och / eller orsaka utlästa artefakter i CCD-kameran.

Konfigurera en analys för aktivatorer: Inte alla Kir kanaler maximalt aktiveras under vilande betingelser, varför det kan vara möjligt att konstruera en analys som kan detektera små molekyler aktivatorer. I dessa fall väljer en EG ₈₀ koncentration av Tl ⁺ inte kan ge tillräckligt "utrymme" för analysen att tillförlitligt upptäcka aktivatorer. Således kan man välja att använda en lägre koncentration av Tl ⁺ (t.ex. EG ₂₀₎ i aktivator-analyser. I vissa fall, kan analysen visar tillräckligt låg variabilitet för att möjliggöra användningen av en EG ₅₀ koncentration av Tl ⁺ och ändå ge lämplig upplösning av både aktiverade och inhiberade kanal populationer. I detta fall, analysen may utföras i dubbel aktivator / hämmare läge. När de är tillgängliga, kan en känd aktivator användas för att hjälpa bestämma lämplig Tl ⁺ koncentration för att maximera chanserna att upptäcka kanalen aktivatorer.

Begränsningar: Det finns vissa begränsningar som bör beaktas vid utvecklingen och genomförandet av en TI ⁺ flux-baserade hög genomströmning skärm. Till exempel bygger analysen på ett indirekt mått på Kir-kanal aktivitet med hjälp av en fluorescerande prob vars optiska egenskaper kan påverkas direkt av föreningar i en skärm. Därför måste viktiga iakttagelser från Tl ⁺ flux experiment bekräftas med spänning klämma elektrofysiologi, som anses vara den "gyllene standard" metod för jonkanaler farmakologi. Dessutom kan små molekyler har direkta effekter på endogena Tl ⁺ flux vägar uttryckta i HEK-293 celler, vilket leder till identifiering av falska positiva träffar. Den tetracykline-inducerbara systemet är särskilt användbart för att skilja falska positiva träffar från Kir-kanal-riktade modulatorer eftersom träffar kan snabbt screenas i oinducerade celler för effekterna på endogena vägar. Slutligen, den låga lösligheten av Tl ⁺ i klorid-haltiga buffertar begränsa koncentrationen av Tl ⁺ som kan användas i en analys, kräver användning av en icke-fysiologisk Tl ⁺ stimulans buffert som kan förstärka farmakologi av målet ^11. Huruvida olika buffertar med målet av intresse bör noggrant utvärderas under analys utveckling. Detta kan göras genom att CRC för kända modulatorer som använder olika Tl ⁺ stimulans buffertar och välja förhållanden under vilka farmakologi närmast matchar den som observerades med fysiologiska buffertar.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
pcDNA5/TO	Invitrogen	V1033-20	Tetracycline-inducible expression vector
T-REx-HEK293 cells	Invitrogen	R71007	Tetracycline-inducible cell line
Lipofectamine LTX/Plus Reagent	Invitrogen	15338100	Transfection reagent
FBS	ATLANTA Biologicals	S11550	Cell culture media
DMEM	Invitrogen	11965	Cell culture media
Hygromycin B	Invitrogen	10687-010	Cell culture media
Blasticidin S	Invitrogen	R210-01	Cell culture media
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140	Cell culture media
HBSS-divalent free	Mediatech	21022CV	Cell washing
Trypsin-0.25%	Mediatech	25053CI	Cell dissociation
Tetracycline-HCl	Sigma	T9823	Induction reagent
Dialyzed FBS	ATLANTA Biologicals	S12650	Plating media
FluoZin-2	Invitrogen	F24189	Fluorescent dye
Pluronic F-127	Invitrogen	P-3000MP	Dye loading
HBSS	Invitrogen	14175	Assay buffer
HEPES	Invitrogen	15630	Assay buffer
NaHCO3	Sigma	S6297	Tl+ stimulus buffer
MgSO4	Sigma	M2643	Tl+ stimulus buffer
CaSO4∙2H2O	Sigma	C3771	Tl+ stimulus buffer
D-Glucose	Sigma	G7528	Tl+ stimulus buffer
Thallium sulfate	Aldrich	204625	Tl+ stimulus buffer
HEPES	Sigma	H4034	Tl+ stimulus buffer
DMSO	Sigma	D4540	Solvent
Eight-channel electronic pipettor	Biohit	E300	Cell plating in 384-well plates
BD PureCoat amine-coated 384-well plates	BD Biosciences	356719	Assay microplates
Echo qualified 384-Well polypropylene microplate (384PP)	Labcyte	P-05525	Compound source microplates
384-well polypropylene microplates	Greiner Bio-One	781280
Multidrop Combi reagent dispenser	Thermo Scientific	5840300
ELx405 microplate washer	BioTek	ELx405HT	Automated cell washing
Echo liquid handler	Labcyte	Labcyte Echo 550
Bravo automated liquid handling platform	Agilent Technologies	Standard model
Hamamatsu FDSS 6000	Hamamatsu		Kinetic imaging plate reader
Table 1. List of Materials and Reagents.