High-throughput screening voor kleine-molecule Modulators van Actieve Rectifier kaliumkanalen

Summary

Werkwijzen voor het ontwikkelen en valideren van een kwantitatieve fluorescentie assay voor het meten van de activiteit van de actieve gelijkrichter kalium (Kir) kanalen voor high-throughput screening verbinding gepresenteerd.

Abstract

Specifieke leden van de regeling actieve gelijkrichter kalium (Kir) kanaal familie worden gepostuleerd drug targets voor een verscheidenheid van aandoeningen, waaronder hypertensie, atriumfibrilleren, en pijn ^1,2. Voor het grootste deel, echter, is de vooruitgang in de richting van het begrijpen van hun therapeutisch potentieel of zelfs elementaire fysiologische functies is vertraagd door het gebrek aan goede farmacologische tools. Inderdaad, de moleculaire farmacologie van de actieve gelijkrichter familie ver achter die van de S4 superfamilie van voltage-gated kalium (Kv) kanalen, waarbij een aantal nanomolaire affiniteit en zeer selectieve modulatoren peptide toxine ontdekt ^3. De bijengif toxine tertiapin en derivaten daarvan zijn krachtige remmers van Kir1.1 en Kir3 kanalen ^4,5, maar peptiden een beperkt nut therapeutisch als experimenteel vanwege hun antigene eigenschappen en slechte biologische beschikbaarheid, metabolische stabiliteit en weefsel penetrantie. De ontwikkeling van krachtigeen selectieve kleine moleculen sondes met verbeterde farmacologische eigenschappen zal een sleutel tot het volledig begrijpen van de fysiologie en therapeutisch potentieel van Kir-kanalen zijn.

De Molecular Libraries Probes Production Center Network (MLPCN), ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) Gemeenschappelijk Fonds heeft mogelijkheden gecreëerd voor academische wetenschappers sonde ontdekking campagnes te starten voor moleculaire targets en signaalwegen die behoefte hebben aan een betere farmacologie ^6. De MLPCN biedt onderzoekers toegang tot de industrie-schaal screening centra en medicinale chemie en informatica ondersteuning op laag-moleculaire sondes om de functie van genen en genproducten netwerken toe te lichten te ontwikkelen. De kritische stap in het verkrijgen van toegang tot de MLPCN is de ontwikkeling van een robuuste target-of route-specifieke assay die vatbaar voor high-throughput screening (HTS).

Hier beschrijven we hoe u een fluorescentie gebaseerde thallium (Tl ⁺⁾ flux ASSA ontwikkeleny van Kir kanaalfunctie voor high-throughput screening verbinding ^7,8,9,10. De assay is gebaseerd op de permeabiliteit van de K ⁺ kanaalporie de K ⁺ Tl ⁺ congener. Een commercieel verkrijgbare fluorescerende Tl ⁺ reporter kleurstof wordt gebruikt flux van Tl ⁺ detecteren door de porie. Er zijn minstens drie beschikbare kleurstoffen die geschikt zijn voor Tl ⁺ flux assays: BTC, FluoZin-2 en FluxOR ^7,8. Dit protocol beschrijft assay-ontwikkeling met behulp FluoZin-2. Hoewel oorspronkelijk ontwikkeld en verkocht als een zink indicator, FluoZin-2 vertoont een robuuste en dosisafhankelijke toename in fluorescentie-emissie bij Tl ⁺ binding. We begonnen te werken met FluoZin-2 voor FluxOR beschikbaar was ^7,8 en zijn doorgegaan met dat ^9,10 doen. De stappen in assay ontwikkeling zijn in wezen identiek voor alle drie kleurstoffen en gebruikers moeten bepalen welke kleurstof meest geschikt is voor de specifieke needs. We bespreken ook de test de prestaties van benchmarks die moeten worden bereikt om in aanmerking komen voor de toegang tot het MLPCN. Sinds Tl ⁺ gemakkelijk doordringt de meeste K ⁺ kanalen, moet de test kunnen worden aangepast aan de meeste K ⁺ kanaal doelstellingen.

Protocol

1. Genereren van stabiele cellijnen Polyclonal

1. De oprichting van een hoge kwaliteit stabiele cellijn die de Kir kanaal van belang is een belangrijke eerste stap in de richting van het ontwikkelen van een robuuste high-throughput screening test. Constitutieve K ⁺ kanaal overexpressie kan leiden tot activering van celdood pathways, stabiele cellijn degeneratie en verlies van de bepaling. Om deze eventuele problemen te vermijden en een geschikte interne controle voor assay ontwikkeling (zie hieronder) is een tetracycline-induceerbaar expressiesysteem aanbevolen ^8.
2. Cultuur de ouderlijke T-rex-HEK293 cellen onder toepassing van standaardtechnieken in B-medium (DMEM groeimedium bevattende 10% FBS, 50 U / ml penicilline, 50 ug / ml streptomycine en 5 ug / ml Blasticidine S). Gebruik vroege passage cellen (3-4 passages sinds ontdooien uit vloeibare stikstof opslag) voor transfectie en stabiele kloonselectie.
3. Plate 4 miljoen T-rex-HEK293 cellen in een75 ^cm2 fles zodat de kolf ongeveer 80% confluent de volgende dag. Cultuur overnacht in een _5% CO2 incubator bij 37 ° C.
4. Transfecteren de cellen met behulp van 10 tot 15 ug pcDNA5/TO-Kir DNA en Lipofectamine LTX / Plus reagens volgens fabrikant protocol. Na 5 uur transfectie medium vervangen met B-medium.
5. 24 uur na de transfectie vervangen B-medium met B-medium dat 250 ug / ml hygromycine (BH-medium) stabiele kloonselectie beginnen. Voer de cellen om de 2-3 dagen met vers BH-medium.
6. Meer dan 90% van de cellen sterft de volgende 7 dagen achtergelaten kleine kolonies van stabiel getransfecteerde cellen. Laat de kolonies om voor een extra 10-14 dagen te groeien voor het splitsen van een 175 cm ² fles voor uitbreiding.
7. Voor cryopreservatie, bevriezen 3 x 10 ⁶ cellen / ml in medium bevattende 45% geconditioneerd BH-medium, 45% antibiotica vrij serumbevattend DMEM en 10% DMSO. Bevriezende cellen een nacht bij -80 ° C in een cel container bevriezen en vervolgens naar vloeibare stikstof voor langdurige opslag. Ontdooien cellen van vloeibare stikstof met aanbevolen protocol Invitrogen. Merk op dat de levensvatbaarheid van de cellen lager als ze bevroren van een fles die groter is dan 75% confluent bij de verwerking.

2. Genereren van stabiele cellijnen Monoclonal

1. Was een sub-confluente ⁷⁵ cm2 kolf van stabiele polyklonale cellen met tweewaardig-vrije HBSS. Voeg 1 ml trypsine en incubeer gedurende 3-5 minuten in een _5% CO2 incubator bij 37 ° C. Voeg 5 ml van BH-medium om de kolf met trypsine-activiteit remmen en herhaaldelijk vermalen (bijv. 5 keer) volledig distantiëren van de cellen. Inspecteer zorgvuldig de cellen onder een microscoop om te zorgen voor de ophanging bestaat bijna volledig uit enkele cellen. Dit verhoogt de kans op het verkrijgen van monoklonale cellijnen.
2. Bepaal de celdichtheid en verdunde suspensie tot een concentratie van 0,7 cellen per 20 pi. Een multi-channel pipet, pipet 20 ul van de celsuspensie in elk putje van BD PureCoat amine beklede (of equivalent poly-D-lysine gecoate) 384 putjes. In principe 70% van een cel putjes ontvangt deze galvaniseer omstandigheden. Daarom zou een 384-wells plaat bevatten meer dan 200 klonen te analyseren. Verder kweken van de cellen in een _5% CO2 incubator bij 37 ° C.
3. Na een week, inspecteren de platen onder een microscoop voor putjes die afzonderlijke kolonies. Opmerking hun positie op de deksel met een permanent marker voor toekomstig gebruik. Zorg ervoor dat u er ook rekening mee en putten met meerdere kolonies uit te sluiten. Deze zijn meest gemakkelijk te herkennen door het verschijnen van kolonies groeien van meerdere zijden van de put. Wees ervan bewust dat verdamping de neiging om sneller te komen uit putten aan de rand van de plaat. Voeg BH-medium om putten waar belangrijke verdamping heeft plaatsgevonden. Anders behoeft to voeden de cellen.
4. Bewaken van de putten vaker tijdens de volgende 7-10 dagen. De cellen klaar te splitsen wanneer de putjes plaats tenminste 50% confluent.
5. Splits de cellen tot 384-wells-platen dupliceren, een plaat voor het testen met Tl ⁺ flux en de andere voor de voortzetting van de monoklonale lijnen in cultuur. Zuig het medium van de putjes die de cellijnen van belang. Spoel de cellen met tweewaardig-vrije HBSS, 20 ul trypsine en aan elke overdracht en de plaat op een 37 ° C incubator gedurende 15-20 min. Het verplaatsen van de plaat naar de celkweek kap, voeg 20 ul BH-medium aan elk putje en vermalen meerdere malen om de cellen te scheiden. Controleer de putjes onder een microscoop te zorgen voor de cellen volledig gedissocieerd. Deze kunnen meerdere ronden van pipetteren, de cellen zullen sterk gebonden. Zodra de cellen gedissocieerd Breng 10 pl van elke celsuspensie aan putjes van een nieuwe BD PureCoat amine beklede 38 dupliceren4-well plaat. Zorg ervoor dat u de relatie tussen de bron en de bestemming let wel putten, zodat de klonen vertonen robuuste Kir activiteit op het kanaal (zie hieronder) is terug te voeren naar de oorspronkelijke goed te dupliceren. Voeg 20 pl BH-medium naar de bron en de resterende cellen voeden en blijven ze in cultuur in _5% CO2 incubator bij 37 ° C.
6. Laat de cellen in de bestemming plaat te hechten en tot een week te groeien. Zodra de meeste klonen bereiken minste 50% confluentie, kunnen ze worden beoordeeld Kir kanaal activiteit met de Tl ⁺ flux hieronder beschreven test.
7. De dag voor de test, het kweekmedium zuigen en vervangen BH medium dat 10% gedialyseerd FBS. Dit voorkomt onbedoelde kanaal expressie die zou kunnen voortvloeien uit tetracycline verontreinigd serum. Kir kanaal expressie induceren in slechts een van duplo voor elke kloon door met 1 ug / ml tetracycline. De dubbele put niet geïnduceerd zal dienen als een"Background" controle. Voer de Tl ⁺ flux testen zoals hieronder beschreven.

3. Algemene Tl ⁺ Flux Assayprocedure

1. De dag voor een Tl ⁺ flux experiment, dissociëren de cellen en kwantificeren van de dichtheid van de celsuspensie zoals beschreven in paragraaf 2.1 en 2.2. Plaat 20000 monoklonale cellen stabiel getransfecteerd met een Kir kanaal gen van belang in elk putje van een BD PureCoat amine beklede 384-wells plaat met een Thermo Multidrop Combi of meerdere kanalen pipet. Gebruik BH medium dat 10% gedialyseerd FBS voor plating. Merk op dat sommige cellen zullen 's nachts worden gekweekt met 1 ug / ml tetracycline naar Kir kanaal expressie te induceren, terwijl anderen niet. De locatie van geïnduceerde en niet-geïnduceerde cellen verschilt voor elk type experiment zijn weergegeven in figuur 1.
2. De volgende dag controleren de platen onder een microscoop dat de hechtende cellen zijn en gelijkmatig over de bodemvan de putjes. De putjes 80-90% confluent zijn.
3. Gebruik een ELx405 Microplate Washer de celcultuur medium vervangen door 20 ui per putje van HBSS assay buffer die 20 mM HEPES en gebufferd op pH 7,3 met NaOH. Als alternatief kan men gebruik maken van een "flick en slam"-methode, waarbij de plaat wordt omgekeerd en sloeg neer scherp naar het medium uit te werpen in een afvalbak, en dan klopte op gestapeld papieren zakdoekjes om het resterende papier te verwijderen. Voeg onmiddellijk terug HBSS assay buffer om de plaat op de cellen voorkomen uitdrogen.
4. Bereid de FluoZin-2, AM kleurstof laden oplossing. Na kort centrifugeren van de buis los 50 ug FluoZin-2 poeder in 100 pl watervrije DMSO. Op dit punt kan aliquots van de 1000 x voorraadoplossing worden opgeslagen bij -20 ° C voor later gebruik. Wanneer klaar voor gebruik, voeg 50 ul van een 20% gewicht per volume Pluronic F-127/DMSO oplossing van de kleurstof en meng met zachte pipetteren. Niet in de vriezer de kleurstof een keer Pluronic F-127 is toegevoegd, zoalslage temperatuur kan de oppervlakteactieve stof neer uit de oplossing. Voeg 150 ul volume van FluoZin-2, AM/Pluronic-F127 tot 100 ml HBSS testbuffer en meng de kleurstof laadbuffer maken. Met een Multidrop Combi of meerkanaals pipet, voeg 20 ul loading buffer kleurstof in elk putje reeds bevattende 20 pi HBSS assay buffer. Incubeer de cellen bij kamertemperatuur gedurende ongeveer 1 uur (typisch incubatie gedaan in het donker, hoewel er geen direct bewijs dat het noodzakelijk is).
5. Terwijl de cellen worden geladen met kleurstof, bereiden een Tl ⁺ stimulus plaat. Vers los 0,5 g natriumwaterstofcarbonaat in 50 ml 5x Tl ⁺ stimulus buffer met 1 mM magnesiumsulfaat, 1,8 mM calciumsulfaat, 5 mM glucose, 10 mM HEPES en 12 mM Tl ⁺ sulfaat. Als alternatief kan natriumbicarbonaat worden vervangen door natriumgluconaat als bijvoorbeeld de pH moet worden gehandhaafd op een zeer smalle bandbreedte en verlies van kooldioxideis een punt van zorg. Stevig dop op de tube om het ontsnappen van koolstofdioxide te beperken en enkele malen omgekeerd totdat het natriumbicarbonaat in oplossing gaat. Een multi-channel pipet, voeg 50 ul van de oplossing aan elk putje van een polypropyleen 384-wells plaat (Tabel 1).
6. Nadat de cellen zijn geladen met FluoZin-2, AM, was de platen met een Microplate ELx405 Washer of de "film en slam" methode, zoals hierboven beschreven in paragraaf 3.3. Afhankelijk van het type Tl ⁺ flux experiment uit te voeren, opnieuw voeg 20 ul of 40 pi HBSS assaybuffer aan elk putje. De platen zijn nu klaar voor experimenten.
7. De cel-en Tl ⁺ platen in een Hamamatsu Functionele Drug Screening System (FDSS) of gelijkwaardige kinetische imaging plaat lezer met geïntegreerde vloeibare doseren mogelijkheden. Gebruik geschikte filters voor fluoresceïne / fluoresceïne gebaseerde kleurstoffen zoals Fluo-4.
8. Het opzetten van een single-add-protocol, zodat 10 ul van de 5x Tl ⁺reeks wordt aan de overeenkomstige putjes van de cel plaat met 40 pi HBSS assay buffer. Record basislijn fluorescentie bij 1 Hz bemonsteringsfrequentie ten minste 10 sec. De well-to-well fluorescentie moeten uniform en stabiel te zijn over de plaat een keer een optimale cel plating, wassen en kleurstof laden voorwaarden worden vastgesteld. Een geïntegreerde 384-kanaal pipet wordt gebruikt om de Tl ⁺ stimulus tegelijkertijd buffer aan elk putje.
9. Neem gedurende minimaal 2 minuten zodat de snelheid en de piek van de Tl ⁺ geïnduceerde toename in fluorescentie wordt gevangen voor off-line analyse.

4. Bepaling van optimale Tl + Concentratie

1. Tl ⁺ doordringt gemakkelijk meest innerlijke gelijkrichter K ⁺ kanalen. Opdat Tl ⁺ concentraties niet het dynamische bereik van de Tl dan ⁺ reporter kleurstof FluoZin-2 moet men empirisch de optimale Tl ⁺ concentratie worden gebruikt in een high-throughput scherm. Wij raden een Tl ⁺ concentratie die 80% van de maximale fluorescentie respons (EG ₈₀₎ onder omstandigheden waarbij het ​​kanaal maximaal geactiveerd oproept.
2. Plate, kleurstof belasting en was de cellen in BD PureCoat amine beklede of vergelijkbare poly-D-lysine beklede 384-putjes zoals hierboven beschreven in sectie 3, waarbij 40 ui HBSS assay buffer in elk putje. Zoals getoond in de plaat op de in figuur 1A, kolom 1 en rijen A1-A23 moeten de cellen die niet geïnduceerd met tetracycline en derhalve niet drukken de Kir kanaal van belang bevatten. De FluoZin-2 fluorescentie signalen van de geïnduceerde putten gebruikt om het niveau van Tl ⁺ flux bepalen via endogene wegen, zoals Na ⁺ - K ^+-ATPase pomp en voltage gated K ⁺ kanalen, die gewoonlijk uitgedrukt in HEK- 293 cellen.
3. Gebruik een Agilent Bravo Automated Liquid Handling Platform of handmatig pipetteren om een ​​voor te bereidenelf-punt Tl ⁺ concentratie verdunningsreeksen in HBSS assay buffer. Typisch wordt een 3-voudige seriële verdunningsreeks van 100% tot 0,002% Tl ⁺ geëvalueerd in de assay. De serie bestaat een 5x concentratie omdat de Tl ⁺ oplossingen worden verdund 1:5 in de uiteindelijke assay. Bereid de verdunningsreeks door verdunnen 5x Tl ⁺ buffer in hoofdstuk 3 met een 5x Tl ^+-vrije buffer bevattende 1 mM magnesiumsulfaat, 1,8 mM calciumsulfaat, 5 mM glucose en 10 mM HEPES. Nogmaals, vers 0,5 g natriumbicarbonaat onmiddellijk oplossen in 50 ml van de uiteindelijke Tl ⁺ buffer voor het uitplaten in een polypropyleen 384-wells plaat volgens de plaat kaart getoond in figuur 2A.
4. Laad de cel en Tl ⁺ stimulans platen in de FDSS. Heeft een enkel-add protocol zodat 10 pl 5x de Tl ⁺ reeks wordt aan de overeenkomstige putjes van de cel plaat met 40 ul HBSS assay buffer. Record basislijn FluoZin-2 fluorescentie gedurende 10 seconden voor het toevoegen Tl ⁺ aan de plaat. Herhaal het experiment op 3 verschillende dagen om de reproduceerbaarheid van de resultaten daarvan.

5. Bepaling van gevoeligheid voor DMSO Assay

1. De kleine moleculen ondervraagd in een high-throughput screen opgelost in het organische oplosmiddel dimethylsulfoxide (DMSO), die zelf de werking van de test beïnvloeden. Daarom moet de assay gevoeligheid van DMSO eerst onderzocht om de hoogste toelaatbare concentratie DMSO in het scherm vast.
2. Plate, kleurstof belasting en was de cellen in BD PureCoat amine-coated 384-wells-platen, zoals hierboven beschreven in hoofdstuk 3, het verlaten van 20 ul van HBSS assay buffer in elk putje. De gehele plaat te bevatten cellen die zijn geïnduceerd met tetracycline (Figuur 3A).
3. Gebruik een Bravo geautomatiseerde Liquid Handling Platform of handmatig pipetteren om een ​​elf-punt D voor te bereidenMSO concentratie verdunningsreeksen in HBSS assay buffer. Gewoonlijk wordt een 2-voudige verdunningsreeks variërend van 10% tot 0,01% v / v DMSO geëvalueerd op activiteit in de assay. De serie bestaat in een 2x concentratie omdat de DMSO oplossing wordt verdund met de helft in de uiteindelijke assay. De verdunningsreeks moet worden uitgeplaat in een polypropyleen 384-wells plaat volgens de plaat kaart getoond in figuur 3A.
4. Bereid een 5x Tl ⁺ stimulus plaat op basis van de _EG-80 of optimale Tl ⁺ concentratie bepaald in punt 4.
5. Laad de cel, DMSO en Tl ⁺ stimulans platen in de FDSS. Zet twee add protocol zodat 20 pl van de DMSO concentratie 2x reeks wordt aan de overeenkomstige putjes van de celplaat met 20 pi HBSS assay buffer. Laat de DMSO op de cellen voor dezelfde hoeveelheid tijd de cellen om kleine molecule voertuig worden blootgesteld gedurende een scherm. Record basislijn FluoZin-2 fluorescentie gedurendeminste 10 seconden voordat het toevoegen van 10 pi 5x Tl ⁺ buffer aan elk putje van de celplaat. Herhaal het experiment op 3 verschillende dagen om de reproduceerbaarheid van de resultaten daarvan.
6. De test dient tolerant concentraties van tenminste 0,1% v / v DMSO voor een typische high-throughput screen in welke verbindingen getest bij een concentratie van 10 uM.

6. Bepaling van testgevoeligheid de bekende farmacologische Modulators

1. Na bepaling van de optimale concentratie en Tl ⁺ DMSO tolerantie van de assay, de effecten van bekende farmacologisch werkzame middelen op Kir kanaal gemedieerde Tl ⁺ flux worden onderzocht. Deze reeks experimenten zal de assay gevoeligheid, vermogen rangorde verbindingen op basis van hun vermogen, vermogen om verbindingen op basis van hun wijze van werking (bijvoorbeeld activator, inhibitor) categoriseren en identificeren gedroeg zich control verbindingen later in gebruik de assay dNTWIKKELING en scherm.
2. Plate, kleurstof belasting en was de cellen in BD PureCoat amine-coated 384-wells-platen, zoals hierboven beschreven in hoofdstuk 3, het verlaten van 20 ul van HBSS assay buffer in elk putje. Kolom 1 en rijen A1-A23 moet bevatten cellen die niet werd geïnduceerd met tetracycline (figuur 4A).
3. Gebruik een Bravo geautomatiseerde Liquid Handling Platform of handmatig pipetteren om een ​​elf-punts concentratie verdunningsreeks van bekende modulatoren in HBSS assaybuffer te bereiden. Typisch wordt een 3-voudige verdunningsreeks van 100 uM tot 2 nM geëvalueerd op activiteit in de assay. De serie bestaat in een 2x concentratie omdat de DMSO oplossing wordt verdund met de helft in de uiteindelijke assay. De verdunningsreeks moet worden uitgeplaat in drievoud in een polypropyleen 384-wells plaat volgens de plaat kaart getoond in figuur 4A. Zorg ervoor dat de verdunningen gemaakt zodat de uiteindelijke DMSO concentratie hetzelfde tussen behandelingen met medicijnen en minder tha n of gelijk is aan de maximaal toelaatbare DMSO concentratie in de zin van hoofdstuk 5.
4. Bereid een 5x Tl ⁺ stimulus plaat op basis van de optimale Tl ⁺ concentratie bepaald in punt 4.
5. Laad de cel, verbinding en Tl ⁺ stimulans platen in de FDSS. Zet twee add protocol zodat 20 pi 2x de concentratie verbinding reeks wordt aan de overeenkomstige putjes van de celplaat met 20 pi HBSS assay buffer. Voeg de verbindingen aan de celplaat en incubeer gedurende 20 minuten. Merk op dat de optimale incubatietijd voor de verbindingen met het beste signaal detecteren achtergrond verhouding kan worden bepaald door het uitvoeren van een aantal experimenten waarbij paar verschillende incubatietijden worden gekozen. Record basislijn FluoZin-2 fluorescentie ten minste 10 seconden voordat het toevoegen van 10 pi 5x Tl ⁺ buffer aan elk putje van de celplaat. Herhaal het experiment op 3 verschillende dagen om de reproduceerbaarheid van de resultaten daarvan.

_title "> 7. Checkerboard Analyse

1. In de volgende reeks experimenten zal de uniformiteit en reproduceerbaarheid van de test te worden door een "schaakbord" analyse. Typisch wordt een controle inhibitor uitgeplaat in elke andere bron van elke kolom en rij van een 384-well plaat, zie figuur 5A. Strikt beoordelen ruis in de assay moet een EC ₈₀ concentratie van de remmer worden gebruikt. DMSO wordt toegevoegd aan de andere putjes als vehikel controle. Tl ⁺ flux in DMSO en drugs behandelde cellen wordt gebruikt om een waarde voor Z prime, een statistische maat well-to-well variabiliteit tussen de twee populaties van putten berekenen. Z prime wordt berekend met de formule:
   Z prime = 1 - (3SD _p + 3SD _n) / | betekenen _p + betekenen _n |
   wanneer SD is de standaardafwijking, p ongeremd flux en n is volledig geremd flux waarden. Een assay met Z-waarden groter dan of gelijk aan 0,5 op 3 verschillende dagen wordt geacht seschikt voor high-throughput screening.
2. Plate, kleurstof belasting en was de cellen in BD PureCoat amine-coated 384-wells-platen, zoals hierboven beschreven in hoofdstuk 3, het verlaten van 20 ul van HBSS assay buffer in elk putje. Merk op dat de hele plaat moet worden opgewekt met tetracycline.
3. Een verbinding / DMSO plaat door pipetteren in een 384-well polypropyleen plaat met een multi-kanaal pipet, 80 ul / putje van een bekende remmer van het doel Kir kanaal de concentratie bepaald in paragraaf 6.5, en 0,1% v / v DMSO voertuig zoals getoond in figuur 5A. Voeg de bekende remmer te beginnen in zowel A1 met behulp van de multi-channel pipet en alternatieve goed B2 en zo verder tot en B24. Herhaal deze procedure met DMSO beginnen in goed B1 en zo verder tot en A24. De uiteindelijke lay-out van de plaat moet overeenkomen met die van een dambord.
4. Bereid een 5x Tl ⁺ stimulus plaat op basis van de optimale Tl ⁺ bepaald in punt 4.
5. Plaats de cel verbinding en Tl ⁺ stimulus platen in de FDSS. Zet twee add protocol zodat 20 pi 2x de concentratie verbinding reeks wordt aan de overeenkomstige putjes van de celplaat met 20 pi HBSS assay buffer. Voeg de verbindingen aan de celplaat en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Record basislijn FluoZin-2 fluorescentie ten minste 10 seconden voordat het toevoegen van 10 pi 5x Tl ⁺ buffer aan elk putje van de celplaat. Herhaal het experiment op 3 verschillende dagen om de reproduceerbaarheid van de resultaten daarvan.

8. Pilot Screen

1. In de laatste fase van ontwikkeling assay, voert een pilot scherm van enkele duizenden verbindingen om de assay's te evalueren onder omstandigheden die uiteindelijk worden gebruikt in de grootschalige high-throughput screen.
2. Plate, kleurstof belasting en was de cellen in BD PureCoat amine beklede 384-putjes zoals hierboven beschreven in sectie 3), waarbij 20 pl HBSS assay buffer in elk putje.Merk op dat de hele plaat moet 's nachts worden gekweekt met tetracycline naar Kir kanaal expressie te induceren.
3. Selecteer ongeveer 2.000 tot 3.000 structureel diverse verbindingen te testen. Het is vaak geschikt en gemakkelijk te gebruiken verbindingen collecties bekende activiteiten mogelijk verrijkt ion kanaal modulatoren. Dergelijke collecties zoals het Spectrum Collection (MicroSource) en de Lopac collectie (Sigma). Daarnaast is het verstandig om zijn bekende modulatoren van de Kir van belang in de pilot-scherm. Idealiter deze verbindingen worden toegevoegd aan putjes in een blinde manier om een ​​objectieve test van de hit picking methoden later beschreven mogelijk. Bereid de verbindingen in 384-well polypropyleenplaten (bestemming platen) met een Labcyte Echo Liquid Handler of geschikte pin tool om een ​​geschikt volume van geselecteerde verbindingen in DMSO brengen van de MLPCN inzameling (bron platen) naar de bestemming platen NB testverbindingen Alleen in de kolommen 3-22;In alle andere en kolommen 1, 2, 23, 24 wel een bekende remmer met een bekende concentratie volledig remmen de Kir zoals bepaald in punt 7. In de resterende putjes van de kolommen 1, 2, 23 en 24 voeg de juiste hoeveelheid DMSO DMSO concentratie-matched besturingsorganen produceren. Verdun alle putjes met Assay Buffer met behulp van de Multidrop Combi. Typisch testverbindingen worden 20 uM 2-voudig boven de beoogde concentratie screening.
4. Maak Tl ⁺ stimulus platen op basis van de optimale Tl ⁺ concentratie bepaald in punt 4.
5. Voer de piloot scherm. Zorg ervoor dat de stappen van de uitvoering van het protocol wankel naar consistente timing tussen de platen in de pilot screening run te houden.
6. Als de waakvlam scherm is voltooid, analyseert de checkerboard putjes van de kolommen 1, 2, 23 en 24 met de Z-prime vergelijking. Controleer platen die Z-prime waarden van minder dan 0,5 laten de bron van slechte scheiding van controle te bepalen. Klappen kan be geselecteerd met een aantal methoden. Voor proef schermen is het gebruikelijk om het gemiddelde en standaardafwijking van het voertuig controlepopulatie berekenen en resultaten gebaseerd op wells produceren waarden> / = 3 standaardafwijkingen van het gemiddelde van het voertuig te bedienen kiezen.
7. Na hit plukken, hertest geselecteerde hits in tweevoud in 2 sets van platen. Een stel platen bevat de stabiele Kir cel in afwezigheid van tetracycline en de andere met de stabiele cellijn Kir in aanwezigheid van tetracycline. Hertest positieve hits die in ten minste een van de twee platen en hertest niet significant activiteit vertonen in de niet-geïnduceerde plaatjes worden geverifieerd beschouwd hits. Onderzoek de geverifieerde hit lijst om te bepalen hoeveel van de "verborgen" controlemonsters werden gedetecteerd. Als de controles op te sporen in de pilot scherm geeft aan de noodzaak van verdere optimalisatie van screening of hit-picking parameters.

Representative Results

Het gebruik van een tetracycline-induceerbaar expressiesysteem een handige interne controle voor het onderscheid Tl ⁺ flux via endogene routes en Kir kanaal plaats. Figuur 1 toont voorbeelden van cel plating kaarten in verschillende experimenten. De posities van putjes met geïnduceerde of tetracycline-geïnduceerde cellen worden aangeduid met verschillende kleuren. Figuur 2A toont de bron plaat kaart gebruikt om de optimale concentratie voor Tl ⁺ assay ontwikkeling en screening verbinding bepalen. Het kleurverloop geeft de 3-voudige verdunningsreeks van 100% tot 0,002% Tl ^+. Een representatieve fluorescentie-intensiteit kaart wordt weergegeven in figuur 2B, met koele naar hot kleuren aangeeft laag naar hoog Tl ⁺ flux waarden respectievelijk. De cel plating map weergegeven in figuur 1C werd voor dit experiment. Een geschikte van een 4-parameter logistieke functie thij Tl ⁺ CRC (figuur 2C) wordt gebruikt om een EC _80-waarde van 15% Tl ^+. Figuur 3A toont de bron plaat kaart gebruikt om de DMSO tolerantie van een assay te bepalen bepalen. Kolommen 1 en 24 bevatten assay buffer alleen, terwijl het kleurverloop geeft het 2-voudige verdunningsreeks variërend van 10% tot 0,01% DMSO. Een representatieve fluorescentie-intensiteit kaart wordt weergegeven in figuur 3B, lage Tl ⁺ flux waarden aangegeven met donkerblauw. De cel plating kaart getoond in figuur 1B werd in dit experiment. De gemiddelde Tl ⁺ flux gemeten waarden van putjes die de aangegeven concentraties DMSO zijn in figuur 3C. De gegevens worden uitgezet als het percentage Tl ⁺ flux die in afwezigheid van DMSO. Voor deze specifieke Kir kanaal DMSO concentraties tot 2,5% geen effect op Tl ⁺ flux en kan daarom gebruikt worden in experimenten. Figure 4A toont de bron plaat kaart gebruikt om de concentratie-reactiekrommen vast te stellen voor bekende remmers van Kir kanaal. Elke verbinding wordt aangegeven met een andere kleur en wordt meestal bedekt met een 3-voudige verdunningsreeks. Een representatieve fluorescentie-intensiteit kaart wordt weergegeven in figuur 4B. De cel plating map weergegeven in figuur 1C werd voor dit experiment. Een representatief experiment geeft dosisafhankelijke remming van Tl ⁺ flux door een remmer is weergegeven in Figuur 4C. De robuustheid van een assay bepaald in zogenaamde "schaakbord" assays, zijn samengevat in figuur 5. In de bron plaat kaart getoond in figuur 5A, een maximaal effectieve concentratie van een remmer of 0,1% DMSO als vehikel controle worden uitgeplaat in putjes afwisselend. Figuur 5B toont een representatieve fluorescentie-intensiteit map. Een spreidingsdiagram van de piek Tl ⁺ flux opgenomen van individuenal putjes uitgezet in figuur 5C. De gemiddelde fluorescentie waarden zijn aangegeven met doorgetrokken lijn, terwijl 3 standaardafwijkingen worden aangegeven met een stippellijn. De Z prime waarde, een statistische maat voor hoe goed gescheiden van de twee celpopulaties worden gescheiden, berekend voor deze plaat is 0,75, dat is ruim boven de 0,5 drempel voor high-throughput screening.

Figuur 1. Cell plating kaarten gebruikt voor Tl ⁺ flux assay ontwikkeling. (A) Cell plating kaart gebruiken om de optimale test Tl ⁺ concentratie te bepalen. De putjes in kolom 1, rij A1-23, K1-12, F13-23 en P13-23 bevatten niet-geïnduceerde cellen (-Tet). De resterende putjes die cellen die waren behandeld met tetracycline (+ Tet) om Kir kanaal expressie induceren. (B) Mobiele plate kaart gebruiken om de test DMSO tolerantie te bepalen en uit te voeren dambord analyse. Merk op dat alle putjes worden behandeld met tetracycline (+ Tet). (C) celplaat kaart gebruikt om de testgevoeligheid bekende farmacologische modulators bepalen. De putjes in kolom 1 en rij A1-23 bevatten niet-geïnduceerde cellen (-Tet). De resterende putjes bevatten cellen die werden behandeld met tetracycline (+ Tet). Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 2. Bepaling van optimale assay Tl ⁺ concentratie. (A) Bron plaat kaart gebruikt om de Tl ⁺ concentratie die ongeveer 80% van de maximale FluoZin-2 fluorescentie verhoging (EC ₈₀₎ oproept bepalen. Rijen A en columns 1 en 24 (geel) bevat een 5x concentratie van 12 mM Tl ₂ SO _4. De resterende rijen bevatten een 3-voudige verdunningsreeks variërend van 12 mM (100%) tot 0,024 mm (0,002%) Tl ₂ SO _4. De reeks wordt herhaald in de kolommen 2-12 en 13-23. (B) fluorescentie-intensiteit kaart beeltenis van Tl ⁺ flux voor elk putje ongeveer 1 min na Tl ⁺ toevoeging. De pseudo-kleuren balk aan de rechterkant geeft de mate van Tl ⁺ flux, met koelere en hetere kleuren die lage en hoge flux waarden, respectievelijk. Merk op dat de koeler kleuren in kolom 1, rij A1-23, K1-12, F13-23 en P13-23 worden door lage Tl ⁺ flux in geïnduceerde cellen. De resterende putjes, ook in kolom 24, bevatten cellen die werden behandeld met tetracycline te Kir kanaal expressie induceren (zie cel plating kaart in Figuur 1A). (C) Gemiddelde ± SEM CRC Tl ^{+-afhankelijke} veranderingen in fluorescentie (n = 3). Montage van een vier-parameter logistische functie om de gegevens die een IC ₈₀ waarde van 15% Tl ^+. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 3. Assay tolerantie DMSO. (A) Bron plaat kaart assay gebruikt om tolerantie voor DMSO bepalen. Kolommen 1 en 24 bevatten HBSS assay buffer. De rijen bevatten een 2x concentratie van een 2-voudige verdunningsreeks DMSO variërend van 10% tot 0,01% v / v. (B) Vertegenwoordiger fluorescentie-intensiteit kaart beeltenis van Tl ⁺ flux in elk putje opgenomen ongeveer 1 min na Tl ⁺ toevoeging. De pseudo-kleuren balk aan de rechterkant geeft de mate van Tl ⁺ flux, met koelere en hetere kleuren die lage en hoge flux waarden, respectievelijk. (C) Gemiddelde ±; SEM (n = 9) Tl ⁺ flux genormaliseerd aan die welke over de aanwezigheid van HBSS testbuffer alleen. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 4. Testgevoeligheid bekende farmacologisch werkzame verbindingen. (A) Bron plaat kaart gebruikt om de activiteit van bekende farmacologisch werkzame verbindingen in de Tl ⁺ flux assay beoordelen. Een rij en kolommen 1 en 24 bevatten 0,1% v / v DMSO. De plaat lay-out maakt het mogelijk voor het testen van 10 verbindingen in drievoud in kolommen 2-23. De rijen bevatten een 2x concentratie van een 3-voudige seriële verdunningsreeks van verbindingen van 100 uM tot 2 nM (B) fluorescentie-intensiteit op de afbeelding van Tl ⁺ flux voor elke wel approximately 1 min na Tl ⁺ toevoeging. De pseudo-kleuren balk aan de rechterkant geeft de mate van Tl ⁺ flux, met koelere en hetere kleuren die lage en hoge flux waarden, respectievelijk. Merk op dat wells in kolom 1 en rij A1-23 geïnduceerde cellen. De resterende putjes bevatten tetracycline-geïnduceerde cellen die de Kir kanaal van belang (zie celplaat kaart in Figuur 1C). (C) Representative Tl ⁺ geïnduceerde veranderingen in fluorescentie-2 FluoZin in putjes voorbehandeld met de aangegeven concentratie van een Kir channel inhibitor. Klik hier om groter bedrag bekijken .

Figuur 5. Bepaling van de test geschiktheid voor HTS. (A) Bron plaatkaart gebruikt om de well-to-well verscheidenheid van putjes met 0,1% DMSO (voertuig) of een maximaal effectieve concentratie van een bekende remmer evalueren. (B) fluorescentie-intensiteit kaart beeltenis van Tl ⁺ flux in elk putje ongeveer 1 min na Tl ⁺ toevoeging. Merk op dat alle putjes tetracycline-geïnduceerde cellen bevatten de uiting van de Kir kanaal van belang (zie celplaat kaart in Figuur 1B). (C) Vertegenwoordiger spreidingsdiagram van steady-state fluorescentie waarden verkregen uit het voertuig-of remmer behandelde putten. De gemiddelde fluorescentie amplitude van elk monster populatie wordt aangegeven met een doorgetrokken lijn, wordt 3 standaardafwijkingen van het gemiddelde weergegeven met een stippellijn, en afwisselend monsters voor voertuig (VHL) en remmer (INH) in een grafiek weergegeven als afzonderlijke punten. Klik hier om foto voor vergroting figuur .

Discussion

Gegevensverwerking: Nadat de gegevens zijn verzameld, een gebruikelijke stap in de analyse omvat normaliseren elke put fluorescentie respons, F, zijn initiële waarde aan het begin van het experiment F _0. Dit wordt gewoonlijk aangeduid als de "statische ratio" en symbool "F / F ^_0". Wanneer F ₀ wordt gedomineerd door de indicatorkleurstof de statische operatie verhouding aanzienlijk zal corrigeren vele factoren zoals disuniformities in verlichting, signaal verzameltijd, en celaantal. In gevallen waarin de kleurstof signaal zwak of achtergrond fluorescentie of reflecties in het systeem hoog zijn, worden de statische verhouding niet effectief als de achtergrond kan overeenkomstig worden voor het berekenen van de statische ratio. Na normalisatie data, is het gebruikelijk om de fluorescentie golfvorm te reduceren tot een waarde die wordt gebruikt om activiteit te kwantificeren en pick hits. Meestal zal dit worden gedaan door het aanbrengen van de datapunten in de 10 seconden na toevoeging van Tl ⁺ een eerste helling van de opgewekte fluorescentie verhoging verkrijgen. Voor hit plukken, een populaire aanpak is om aan te nemen dat de overgrote meerderheid van de verbindingen in de test bevolking inactief zijn (de nulhypothese van kracht is). Een gemiddelde en standaarddeviatie wordt berekend voor de testpopulatie en hits worden geselecteerd die drie standaarddeviaties van het gemiddelde.

Splitsen van de Protocol lang compound incubaties: Voor het detecteren Kir kanaal remmers, vooral die welke optreden bij intracellulaire bindingsplaatsen kan het waardevol zijn om de cellen incuberen met testverbindingen gedurende langere tijd (bijvoorbeeld 20 minuten) vóór de toevoeging van Tl ^+. Wanneer de verbindingen worden toegevoegd "offline" voor de test wordt ingebracht in de plaat lezer kan de optische eigenschappen van testverbindingen (bijv. fluorescentie) niet herkend en kan een nadelig effect veelgebruiktedata normalisatie benaderingen zoals de "statische ratio" F / F ₀ bovenbeschreven waardoor vals-positieve en / of valse negatieven. Om dit probleem te vermijden en tegelijkertijd vermijden dat een testplaat houden in een lezer voor een lange incubatie een oplossing is het gebruik van een "twee read" protocol. De eerste uitleesmiddelen een korte (bijv. 30 sec) experiment waarbij de verbinding wordt toegevoegd na 10 seconden overnemen van de pre-verbinding F ₀ Bovendien kunnen de verbindingen en "optische effecten op het systeem te beoordelen. De plaat wordt vervolgens uit de lezer en gedurende de gewenste periode en naar de lezer thallium toevoeging. Nadat beide leest zijn voltooid, de eerste uitlezing F ₀ kan worden gebruikt om de gegevens van het tweede normaliseren lezen zodat geen veel problemen geassocieerd met toevoegen van verbindingen "offline" terwijl de mogelijkheid om de lezer bezig gegevensverzameling aldus de doorvoer screening. De twee lees benadering is het gemakkelijkst implemteerde bij gebruik van een geautomatiseerd systeem screening. Het is belangrijk op te merken dat de twee lees benadering niet veroorzaakt door fluorescerende verbindingen die de detector en / of veroorzaken verzadigen uitgelezen artefacten in de CCD camera elimineren.

Configureren van een assay voor activators: Niet alle Kir kanalen maximaal geactiveerd onder rusttoestand, dus is het mogelijk om een assay die kan detecteren kleine molecule activators ontwerpen. In deze gevallen selecteren van een EC concentratie van ₈₀ Tl ⁺ kan niet genoeg "headroom" voor de test op betrouwbare wijze vast activators. Zo kan men kiezen om een lagere concentratie van Tl ⁺ (bijv. EC ₂₀₎ passen in activator assays. In sommige gevallen kan de test vertonen laag genoeg variabiliteit van het gebruik van _een EC50 concentratie Tl ⁺ mogelijk en nog steeds geschikt resolutie van beide geactiveerd en geblokkeerd kanaal populaties. In dit geval m assayay uitgevoerd in dual activator / inhibitor mode. Indien beschikbaar kan een bekende activator worden gebruikt om het juiste Tl ⁺ concentratie de kans ontdekken kanaal activators maximaliseren bepalen.

Beperkingen: Er zijn enkele beperkingen die moeten worden overwogen bij de ontwikkeling en uitvoering van een Tl ⁺ flux gebaseerde high-throughput screen. Bijvoorbeeld, de assay berust op een indirecte maat Kir kanaal activiteit met een fluorescerende probe waarvan de optische eigenschappen kan rechtstreeks worden beïnvloed door verbindingen in een scherm. Daarom moeten belangrijke opmerkingen van Tl ⁺ flux experimenten worden bevestigd met behulp van spanningsklem elektrofysiologie, die wordt beschouwd als de "gouden standaard" methode voor het ionkanaal farmacologie. Bovendien kunnen kleine moleculen rechtstreekse effecten hebben op endogene Tl ⁺ flux paden uitgedrukt in HEK-293-cellen, die tot de identificatie van vals-positieve hits. De tetracyclinee-induceerbare systeem is bijzonder nuttig voor het onderscheiden vals-positieve hits uit Kir kanaal gerichte modulators, omdat de resultaten snel kunnen worden gescreend in geïnduceerde cellen effecten op endogene pathways. Tenslotte een lage oplosbaarheid in Tl ⁺ chloride bevattende buffers beperken de concentratie Tl ⁺ die kunnen worden gebruikt in een test, waarbij het ​​gebruik van een niet-fysiologische Tl ⁺ stimulus buffer die de farmacologie van het doel ^{11 mei} vergroten. De verenigbaarheid van verschillende buffers met het doelwit van belang zorgvuldig te worden geëvalueerd tijdens de test ontwikkeling. Dit kan worden gedaan door het instellen CRC voor bekende modulators met verschillende Tl ⁺ stimulus buffers en omstandigheden te kiezen die de farmacologie meest overeenkomt met de waargenomen fysiologische buffers.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
pcDNA5/TO	Invitrogen	V1033-20	Tetracycline-inducible expression vector
T-REx-HEK293 cells	Invitrogen	R71007	Tetracycline-inducible cell line
Lipofectamine LTX/Plus Reagent	Invitrogen	15338100	Transfection reagent
FBS	ATLANTA Biologicals	S11550	Cell culture media
DMEM	Invitrogen	11965	Cell culture media
Hygromycin B	Invitrogen	10687-010	Cell culture media
Blasticidin S	Invitrogen	R210-01	Cell culture media
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140	Cell culture media
HBSS-divalent free	Mediatech	21022CV	Cell washing
Trypsin-0.25%	Mediatech	25053CI	Cell dissociation
Tetracycline-HCl	Sigma	T9823	Induction reagent
Dialyzed FBS	ATLANTA Biologicals	S12650	Plating media
FluoZin-2	Invitrogen	F24189	Fluorescent dye
Pluronic F-127	Invitrogen	P-3000MP	Dye loading
HBSS	Invitrogen	14175	Assay buffer
HEPES	Invitrogen	15630	Assay buffer
NaHCO3	Sigma	S6297	Tl+ stimulus buffer
MgSO4	Sigma	M2643	Tl+ stimulus buffer
CaSO4∙2H2O	Sigma	C3771	Tl+ stimulus buffer
D-Glucose	Sigma	G7528	Tl+ stimulus buffer
Thallium sulfate	Aldrich	204625	Tl+ stimulus buffer
HEPES	Sigma	H4034	Tl+ stimulus buffer
DMSO	Sigma	D4540	Solvent
Eight-channel electronic pipettor	Biohit	E300	Cell plating in 384-well plates
BD PureCoat amine-coated 384-well plates	BD Biosciences	356719	Assay microplates
Echo qualified 384-Well polypropylene microplate (384PP)	Labcyte	P-05525	Compound source microplates
384-well polypropylene microplates	Greiner Bio-One	781280
Multidrop Combi reagent dispenser	Thermo Scientific	5840300
ELx405 microplate washer	BioTek	ELx405HT	Automated cell washing
Echo liquid handler	Labcyte	Labcyte Echo 550
Bravo automated liquid handling platform	Agilent Technologies	Standard model
Hamamatsu FDSS 6000	Hamamatsu		Kinetic imaging plate reader
Table 1. List of Materials and Reagents.