안쪽 정류기의 칼륨 채널의 소형 분자 변조기에 대한 높은 처리량 검사

Summary

안쪽 정류기의 칼륨 (Kir) 높은 처리량 화합물 심사에 대한 채널의 활동을 측정하기위한 양적 형광 분석을 개발하고 검증하기위한 방법이 제공됩니다.

Abstract

안쪽 정류기의 칼륨 (Kir) 채널 가족의 특정 구성원은 고혈압, 심방 세동과 통증 ^1,2 등의 질환의 다양한에 대한 약물 목표를 postulated 있습니다. 대부분의 경우, 그러나, 자신의 치료 가능성이나 기본적인 생리 기능을 이해하는 방향으로 진행 좋은 약리 도구의 부족에 의해 느려졌습니다. 사실, 안쪽 정류기 제품군의 분자 약리학 훨씬 nanomolar 화성과 매우 선택적 펩타이드 독소의 변조기의 번호가 ³ 발견되었습니다 된 전압 개폐 칼륨 (KV) 채널의 S4 superfamily의 뒤에 느껴지있다. 벌 독이 독소의 tertiapin 및 파생 ^4,5 Kir1.1와 Kir3 채널의 강력한 억제제하지만, 펩티드는 실험적으로 therapeutically뿐만 아니라 제한된 용도의 antigenic 속성과 가난한 생체 이용률, 신진 대사 안정성과 조직 penetrance로 인해 수 있습니다. 강력한 개발향상된 약리 특성을 가진 선택적 작은 분자 프로브는 완전히 생리학과 Kir 채널 치료 가능성을 이해하는 열쇠가 될 것이다.

학술 과학자들은 더 나은 약리학 ⁶ 필요로하는 분자 표적 및 신호 전달 경로에 대한 프로브 발견 캠페인을 시작하기 위해 국립 보건원에서 지원하는 분자 도서관 프로브 제작 센터 네트워크 (MLPCN (주) NIH) 공통 기금은 기회를 만들었습니다. MLPCN는 연구자에게 산업 규모 검진 센터, 의약 화학, 정보학은 유전자와 유전자 네트워크의 기능을 명료하게하다하는 작은 분자 프로브를 개발 지원에 대한 액세스를 제공합니다. MLPCN에 항목을 얻을의 중요한 단계는 높은 처리량 검사 (HTS)에 대한 의무입니다 강력한 대상 또는 경로 별 분석의 개발입니다.

여기, 우리는 형광 기반의 탈륨 (TL ⁺⁾ 자속 assa을 개발하는 방법에 대해 설명합니다높은 처리량 화합물 심사 ^7,8,9,10에 대한 Kir 채널 기능의 y는. 분석은 K의 투자율 ⁺ K ⁺ congener TL ^+에 채널 기공을 기반으로합니다. 상업적으로 이용 가능한 형광 TL ⁺ 기자 염료가 모공을 통해 TL의 transmembrane 유량을 ⁺ 감지하는 데 사용됩니다. BTC, FluoZin-2 및 FluxOR ^7,8 : TL ⁺ 자속 assays에 적합 적어도 세 상업적으로 이용 가능한 염료가 있습니다. 이 프로토콜은 FluoZin-2를 사용하여 분석 개발에 대해 설명합니다. 원래 개발 및 아연 표시로 판매했지만, FluoZin-2 전시 TL시 형광 방출 ⁺ 바인딩에 강력하고 복용 종속적 인 증가합니다. 우리는 FluxOR는 ^7,8 사용할 수 등 ^9,10 할 계속하기 전에 FluoZin-2와 협력하기 시작했습니다. 그러나, 분석 개발 단계는 세 염료에 본질적으로 동일하며, 사용자는 자신의 특정 N에 가장 적합한 어떤 염료 확인해야합니다eeds. 우리는 또한 MLPCN에 항목으로 간주 할 수에 도달해야합니다 검정의 성능 벤치 마크에 대해 설명합니다. TL ^+는 쉽게 대부분의 K ⁺ 채널을 permeates 때문에, 분석은 대부분의 K ⁺ 채널 대상에 적용해야합니다.

Protocol

1. 안정적인 Polyclonal 세포 라인의 생성

1. 관심 Kir 채널을 표현하는 고품질의 안정적인 세포 라인의 설립은 강력한 높은 처리량 검사 분석을 개발 대한 중요한 첫 걸음입니다. 제정 K ⁺ 채널 overexpression은 셀 사망 경로, 안정적인 세포 라인 변성 및 분석 성능의 손실의 활성화로 이어질 수 있습니다. 이러한 잠재적 인 문제를 방지하고 분석 개발을위한 편리한 내부 통제 (아래 참조)를 제공하기 위해 테트라 사이클린-inducible 표현 시스템은 ^8을 권장합니다.
2. 문화 부모의 T-렉스 - HEK293 B-중간 (DMEM 성장 매체 10 % FBS, 50 U / ML 페니실린, 50 μg / ML 스트렙토 마이신, 5 μg / ML Blasticidin S를 포함)에 표준 기술을 사용하여 셀. transfection하고 안정적인 클론 선택에 대한 초기 통로 세포를 (액체 질소 저장에서 해동부터 예 3-4 통로)를 사용하십시오.
3. 의 플레이트 4000000 T-렉스 - HEK293 세포75cm ² 플라스크 그래서 술병은 약 80 % 합류 다음 날입니다. 37 번 5 % CO ₂ 인큐베이터에서 밤 문화 ° C.
4. 제조업체의 프로토콜에 따라 10-15 pcDNA5/TO-Kir DNA의 μg 및 Lipofectamine LTX / 플러스 시약을 사용하여 셀을 Transfect. 5시간 후, B-중간으로 transfection 매체를 교체하십시오.
5. 24 시간 transfection 후, B-매체가 안정적인 클론 선택을 시작하기 250 μg / ML Hygromycin (BH-미디어)를 포​​함과 B-매체를 교체하십시오. 신선한 BH-매체마다 2-3일 세포를 먹이.
6. 세포의보다 큰 90 %는 안정적으로 transfected 세포의 작은 식민지 남겨두고, 다음 7 일 동안 죽을 것입니다. 식민지 확장에 대한 175cm ^두 플라스크에 분할하기 전에 추가 10~14일에 대한 성장 할 수 있습니다.
7. cryopreservation를 들어, 3을 동결 × 10 45 % 포함 미디어 ⁶ 셀 / ML BH-매체 45% 항생제 무료, 혈청 함유 DMEM와 10 %의 DMSO를 완비. 얼음이 얼다-80에서 잠을 자면 세포가 ° 셀 냉동 컨테이너의 C하고 장기 저장을 위해 액체 질소로 이동합니다. Invitrogen의 권장 프로토콜을 사용하여 액체 질소에서 세포를 해동. 그들이 처리시 75 % 합류보다 큰 술병에서 냉동하는 경우 세포의 생존 능력이 낮은됩니다.

2. 안정적인 단클론 세포 라인의 생성

1. 이가의 무료 HBSS와 안정 polyclonal 세포의 하위 합류 75cm ² 플라스크를 씻으십시오. 37 5 % CO ₂ 인큐베이터에서 3-5 분 동안 트립신과 배양 1 ML을 추가 ° C. 트립신의 활동을 억제하고 완전히 세포를 떼어 놓다하기 위해 (예를 들어, 5 회) 반복적으로 씹다하는 플라스크에 BH-미디어의 5 ML을 추가합니다. 조심스럽게 정지 거의 완전히 하나의 세포로 구성하기 위해 현미경으로 세포를 검사한다. 이 단클론 세포 라인을 얻을 가능성이 높아집니다.
2. 셀 밀도를 결정하고 희석20 μl 당 0.7 세포의 농도에 정지. BD PureCoat 아민 - 코팅 (또는 이에 상응하는 폴리-D-라이신 코팅) 384 잘 접시의 각도에 멀티 채널 pipettor, 세포 현탁액의 피펫 20 μl을 사용합니다. 원칙적으로, 우물의 70 %이 도금 조건으로 한 셀을 받아야합니다. 따라서, 384도 플레이트는 분석 200 개 이상의 클론을 포함해야합니다. 37 번 5 % CO ₂ 배양기에서 배양 세포를 ° C. 계속
3. 일주일 후, 하나의 식민지를 포함하는 우물에 대한 현미경으로 접시를 검사한다. 나중에 참조 할 수 있도록 영구 마커와 뚜껑에서 자신의 위치를​​ 확인합니다. 또한 참고 여러 식민지를 포함하는 우물을 제외해야합니다. 이러한 가장 쉽게 잘 여러 방면에서 성장 식민지의 모습으로 인정 받고 있습니다. 증발는 판의 가장자리 근처 우물에서 더 빨리 발생하는 경향이 있음에 유의해야합니다. 중요한 증발가 발생했습니다 우물에 BH-미디어를 추가 할 수 있습니다. 그렇지 않으면, 불필요한 t이다세포를 먹이 O.
4. 다음 7~10일 동안 더 자주 우물을 모니터링 할 수 있습니다. 셀 관심 우물이 50 % 이상 합류 할 때 분할 할 준비가 될 것입니다.
5. 384 잘 접시를 복사 할 셀을 분할, 문화의 단클론 선를 계속 TL ⁺ 자속과 다른과 시금 한 판. 관심 세포 라인을 포함하고있는 우물에서 매체를 대기음. 이가의 무료 HBSS로 세포를 씻어 잘 각 트립신의 20 μl를 추가하고 15-20 분 동안 37 ° C 배양기에 플레이트를 전송합니다. 세포 배양 후드로 다시 판을 이동 한 후, 각도에 BH-중간의 20 μl를 추가하고 세포를 떼어 놓다을 여러 번 씹다. 전지가 완전히 dissociated을 보장 할 수있는 현미경 아래에 우물을 검사합니다. 세포가 단단히 자기편 될 것 같은이, pipetting 여러 순찰을 요구할 수 있습니다. 세포 dissociated되면, 새로운 BD PureCoat 아민 - 코팅 (38)의 우물을 복제하기 위해 각각의 세포 현탁액의 10 μl를 전송번호판 4 - 잘. 물론 소스 사이의 관계를 유의하고 강력한 Kir 채널 활동을 (아래 참조) 전시 클론 원래 잘로 되돌릴 수 있도록 대상 우물을 복제해야합니다. 37 5 % CO ₂ 인큐베이터에서 남은 전지를 공급와 문화에서 그들을 계속 잘 원본 ° C.에 BH-중간의 20 μl를 추가합니다
6. 대상 플레​​이트의 세포가 준수 및 최대 주에 대한 성장 할 수 있습니다. 클론의 대부분은 적어도 50 % 합류에 도달하면, 그들은 TL을 사용하여 Kir 채널 활동에 대해 평가 할 수 있습니다 ⁺ 자속 분석은 아래에 설명했다.
7. 검정 전날은 문화 매체를 대기음 10 % dialyzed FBS를 포함하는 BH 미디어로 교체. 이 테트라 사이클린 오염 된 혈청에서 발생 할 수 부주의 채널 표현을 방지 할 수 있습니다. 1 μg / ML의 테트라 사이클린을 포함하여 각 복제에 대한 중복 우물 중 하나에 Kir 채널 식을 유도. 잘 uninduced 중복이 될 것입니다"배경"제어 할 수 있습니다. 다음 설명에 따라 TL ⁺ 플럭스 assays을 수행합니다.

3. 일반 TL ⁺ 플럭스 분석 절차

1. TL 전날 ⁺ 자속 실험은 세포를 해리와 섹션 2.1 및 2.2에 설명 된대로 세포 현탁액의 밀도를 quantitate. 판 20,000 단클론 전지는 안정적으로 열 Multidrop 콤비 또는 멀티 채널 pipettor을 사용하여 BD PureCoat 아민 - 코팅 384 잘 접시의 각 잘에 관심이 Kir 채널 유전자와 transfected. 도금 10 % dialyzed FBS를 포함하는 BH 매체를 사용하십시오. 일부 세포가 Kir 채널 식을 유도하는 데 1 μg / ML의 테트라 사이클린과 함께 밤새 배양 되오니, 이용에 참고하여, 다른 안 반면. 유도와 uninduced 셀의 위치는 실험의 각 유형에 차이가되며, 그림 1에 표시됩니다.
2. 다음 날, 세포가 자기편 있는지 확인하기 위해 현미경으로 접시를 검사하고 균일하게 바닥에 걸쳐 분산우물의. 우물은 80-90%의 합류해야합니다.
3. 20 μl 당 잘 20 밀리미터 HEPES를 포함하는 HBSS 분석 완충액으로 세포 배양 매체를 교체하고 NaOH로 pH를 7.3로 버퍼에 ELx405 Microplate 와셔를 사용하십시오. 또한, 사람은 한 접시가 반전과 폐기물 용기에 매체를 꺼낼 수 급격히 내려 부러하고 나머지 미디어를 제거하는 적층 종이 수건에 수색 했더니되고, "영화와 슬램"방법을 사용할 수 있습니다. 즉시 desiccating에서 세포를 방지하기 위해 판에 HBSS 검정 버퍼를 다시 추가 할 수 있습니다.
4. FluoZin-2를 준비, 염색로드 솔루션입니다. 간단히 튜브를 centrifuging 후, 무수 DMSO 100 μl에 FluoZin-2 분말의 50 μg을 분해. 이 시점에서 1000 X 주식 솔루션의 aliquots는 나중에 사용하기 위해 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. 때 사용할 준비가 완만 한 pipetting과 염료와 혼합에 볼륨 Pluronic F-127/DMSO 솔루션 당 20 %의 무게의 50 μl를 추가합니다. Pluronic F-127이 추가 된 후 같은 염료를 고정하지 마십시오낮은 온도는 계면 활성제가 용액에서 침전 될 수 있습니다. FluoZin-2의 150 μl 볼륨, HBSS 검정 버퍼의 AM/Pluronic-F127 100 ML를 추가하고 염색 로딩 버퍼를 만들기 위해 부드럽게 섞는다. Multidrop 콤비 또는 다중 채널 pipettor을 사용하여 HBSS 검정 버퍼의 각도 이미 포함 된 20 μl로 염색로드 버퍼의 20 μl를 추가합니다. 약 1 시간 (이것은 필요하다고 직접적인 증거가 없지만 일반적으로 부화가 어둠 속에서 수행 된)을 상온에서 세포를 배양.
5. 세포가 색소를로드하는 동안 TL ⁺ 자극 판을 준비합니다. 갓 1 ㎜의 황산 마그네슘 1.8 밀리미터 황산 칼슘, 5 MM 포도당, 10 밀리미터 HEPES, 12 MM TL ⁺ 황산을 포함하는 5 배 TL ⁺ 자극 버퍼의 50 ML에 나트륨 중탄산염의 0.5 g을 용해. 예를 들어, 솔루션 산도는 이산화탄소의 매우 좁은 범위와 손실 내에 보관해야합니다, 경우 또는 나트륨 중탄산염은 나트륨 글루 콘산로 대체 할 수 있습니다관심사입니다. 이산화탄소의 탈출을 제한하고 나트륨 중탄산염이 솔루션으로 될 때까지 여러 번 반전에 단단히 관 뚜껑. 멀티 채널 pipettor 사용하여 폴리 프로필렌 384도 플레이트 (표 1)의 각 우물 솔루션 50 μl를 추가합니다.
6. 세포 FluoZin-2와 함께로드 된 후, AM, ELx405 Microplate 세탁기와 접시를 씻거나 위의 섹션 3.3에 설명한 바와 같이, "영화와 슬램"방법을 사용합니다. TL의 종류 ⁺ 수행 할 자속 실험에 따라 다시 20 μl 또는 각도에 HBSS 검정 버퍼 40 μl를 추가합니다. 번호판은 이제 실험에 대한 준비가되어 있습니다.
7. 하마 마츠 기능 약물 검사 시스템 (FDSS) 또는 통합 액체 분배 기능을 갖춘 동급 운동 이미징 플레이트 리더로 전지 및 TL이 ⁺ 접시. 같은 Fluo-4와 같은 fluorescein / fluorescein 기반의 염료에 적합한 필터를 사용합니다.
8. 단일 추가 프로토콜을 설정 10 μl 5 배 TL 그 때문에 ⁺시리즈는 HBSS 검정 버퍼 40 μl를 포함하는 셀 플레이트의 해당 우물에 추가됩니다. 적어도 10 초에 1 Hz에서 샘플링 주파수에서 기록 기준 형광. 최적의 셀 도금, 세척, 염료 하중 조건을 설정하고 나면 잘 - 투 - 잘 형광은 한 접시에 걸쳐 균일하고 안정적​​이어야합니다. 통합 384 채널 pipettor 동시에 각도에 TL ⁺ 자극 버퍼를 추가하는 데 사용됩니다.
9. TL 형광의 ⁺ 유발 증가의 속도와 정상은 오프라인 분석을 위해 캡처 될 수 있도록 적어도 2 분에 대한 기록.

4. 최적 TL의 + 농도의 결정

1. TL ^+는 쉽게 가장 안쪽 정류기 K ⁺ 채널을 permeates. TL ⁺ 농도는 TL의 동적 범위를 초과하지 않도록하기 위해 ⁺ 기자 염료 FluoZin-2, 하나는 경험적으로 높은 t에 사용되는 최적의 TL ⁺ 농도를 확인해야합니다hroughput 화면. 우리는 채널이 maximally 활성화 조건에서 최대 형광 반응 (EC _80)의 80 %를 세상의 시작과 끝, TL의 ^{+ 농도를} 사용하는 것이 좋습니다.
2. 판, 염색 부하와 각도에 HBSS 검정 버퍼 40 μl를두고, 섹션 3에 설명 된대로 BD PureCoat 아민 - 코팅 또는 이에 상응하는 폴리-D-라이신 - 코팅 384 잘 접시에 세포를 씻어. 그림 1A, 열 1, A1-A23는 테트라 사이클린과 유도되지 않은, 따라서 관심의 Kir 채널을 표현하지 않는 셀을 포함해야합니다 행의 판지도에 표시된. uninduced 우물에서 FluoZin-2 형광 신호 등의 구명과 같은 내생 경로를 통해 TL ⁺ 자속의 수준을 결정하는 데 사용됩니다 ⁺ - 정상적으로 표현됩니다 K ^+-ATPase 펌프 및 전압 개폐 K ⁺ 채널, HEK- 293 세포.
3. 을 준비하는 pipetting 애질런트 브라보 자동 액체 처리 플랫폼 또는 수동을 사용HBSS 분석 버퍼에 11 점 TL ⁺ 농도 희석 시리즈. 일반적으로, 100 %에서 0.002 % TL ^+에 이르기까지 3 배 시리얼 희석 시리즈는 검정에서 평가됩니다. TL ^{+ 솔루션은} 최종 분석에 1시 5분을 희석되기 때문에 시리즈는 5 배 농도에서 구성해야합니다. 5 배 TL 1 ㎜의 황산 마그네슘 1.8 밀리미터 황산 칼슘, 5 MM 포도당과 10 밀리미터 HEPES를 포함하는 ⁺ 무료 버퍼와 제 3 항에 설명 된 표준 5 배 TL ⁺ 버퍼를 diluting하여 희석 시리즈를 준비합니다. 다시 말하지만, 신선한 그림 2A에 표시된 플레이트지도에 따라 384도 플레이트 폴리 프로필렌에 도금 직전 최종 TL ⁺ 버퍼의 50 ML에 나트륨 중탄산염의 0.5 g을 용해.
4. FDSS로 전지 및 TL ⁺ 자극 판을로드합니다. 10 μl 5 배 TL ⁺ 시리즈는 HBS의 40 μl를 포함하는 셀 플레이트의 해당 우물에 추가됩니다 있도록 단일 추가 프로토콜을 설정S 분석 버퍼. TL을 추가 ⁺ 판에 전에 10 초에 대한 기록 기준 FluoZin-2 형광. 결과의 재현성을 확립하기 위해 세 별도의 일에 실험을 반복합니다.

5. DMSO에 검정 감도의 결정

1. 높은 처리량 화면에서 심문을 작은 분자는 자체 분석의 성능에 영향을 미칠 수있는 유기 용매 디메틸 sulfoxide (DMSO)에 용해되어 있습니다. 따라서, DMSO에 분석의 감도가 처음 화면에서 허용 최고 DMSO 농도를 확립하기 위해 검사해야합니다.
2. 판, 염색 부하와 각도에 HBSS 검정 버퍼 20 μl를두고, 섹션 3에 설명 된대로 BD PureCoat 아민 - 코팅 384 잘 접시에 세포를 씻어. 전체 플레이트는 테트라 사이클린 (그림 3A)로 유도 된 세포를 포함해야합니다.
3. 11 점 D를 준비 pipetting 브라보 자동 액체 처리 플랫폼 또는 수동을 사용HBSS 검정 버퍼에 MSO 농도 희석 시리즈. 일반적으로 10 %에서 0.01 % V / V DMSO에 이르기까지 2 배 희석 시리즈는 검정의 활동 평가됩니다. DMSO 솔루션은 최종 분석에서 반으로 희석되기 때문에 시리즈는 2 배 농도에서 구성해야합니다. 희석 시리즈는도 3a에 도시 된 플레이트지도에 따라 384도 플레이트 폴리 프로필렌으로 도금해야합니다.
4. EC ₈₀ 또는 최적의 TL 섹션 4에서 결정 ⁺ 농도에 따라 5 배 TL ⁺ 자극 판을 준비합니다.
5. FDSS에 셀, DMSO와 TL ⁺ 자극 판을로드합니다. 배 농도 DMSO 시리즈의 20 μl은 HBSS 분석 버퍼 20 μl를 포함하는 셀 플레이트의 해당 우물에 추가됩니다 있도록 두 추가 프로토콜을 설정합니다. 셀이 화면 중에 작은 분자 차량에 노출 될 시간을 같은 양의 세포에 DMSO를 남겨주세요. 에 대한 기록 기준 FluoZin-2 형광적어도 10 초 셀 플레이트의 각도에 5 배 TL ⁺ 버퍼 10 μl를 추가하기 전에. 결과의 재현성을 확립하기 위해 세 별도의 일에 실험을 반복합니다.
6. 분석은 화합물은 10 μm의 농도에서 시험되는 전형적인 높은 처리량 화면에 최소 0.1 % V / V의 농도를 DMSO에 관대해야합니다.

6. 알려진 약리 변조기에 대한 분석 감도의 결정

1. 검정의 최적의 TL ⁺ 농도와 DMSO 허용 오차를 결정 후,이 효과는 검토해야 Kir 채널 매개 TL ⁺ 자속에 pharmacologically 활성 에이전트 알려져 있습니다. 실험의이 시리즈는 효능 자신의 모드 (예 : 활성, 억제)을 기반으로 화합물을 분류하고, 나중에 사용하도록 잘 행동 제어 화합물을 식별 할 수들이 힘, 능력에 따라 순위가 주문 화합물에 대한 분석의 감도, 능력을 평가할 수있을 것입니다 검정 Development와 화면.
2. 판, 염색 부하와 각도에 HBSS 검정 버퍼 20 μl를두고, 섹션 3에 설명 된대로 BD PureCoat 아민 - 코팅 384 잘 접시에 세포를 씻어. 열 1 행 A1-A23는 테트라 사이클린 (그림 4A)로 유도되지 않은 세포를 포함해야합니다.
3. HBSS 검정 버퍼의 알려진 변조기의 11 점 농도 희석 시리즈를 준비 pipetting 브라보 자동 액체 처리 플랫폼 또는 수동을 사용합니다. 일반적으로, 100 μM에서 2 NM에 이르기까지 3 배 희석 시리즈는 검정의 활동 평가됩니다. DMSO 솔루션은 최종 분석에서 반으로 희석되기 때문에 시리즈는 2 배 농도에서 구성해야합니다. 희석 시리즈는 그림 4A에 도시 된 플레이트지도에 따라 384도 플레이트 폴리 프로필렌에 세중의에 도금해야합니다. dilutions가 최종 DMSO 농도는 약물 치료와 덜 THA 사이에 동일 것과 같은 변경되어 있는지 확인하십시오 n 또는 제 5 항에 정의 된 최대 허용 DMSO 농도와 동일.
4. 섹션 4에서 결정 최적의 TL ⁺ 농도에 따라 5 배 TL ⁺ 자극 판을 준비합니다.
5. FDSS에 전지, 화합물 및 TL ⁺ 자극 판을로드합니다. 20 μl 2 배 농도 화합물 시리즈는 HBSS 분석 버퍼 20 μl를 포함하는 셀 플레이트의 해당 우물에 추가됩니다 있도록 두 추가 프로토콜을 설정합니다. 셀 플레이트에 화합물을 추가하고 최대 20 분까지에 품다. 배경 비율에 가장 좋은 신호를 감지 할 수있는 화합물에 대한 최적의 부화 시간이 몇 다른 배양 시간이 선택됩니다 일련의 실험을 실행하여 결정 할 수 있습니다. 셀 플레이트의 각도에 5 배 TL ⁺ 버퍼 10 μl를 추가하기 전에 적어도 10 초 동안 기록 기준 FluoZin-2 형광. 결과의 재현성을 확립하기 위해 세 별도의 일에 실험을 반복합니다.

_title "> 7. 바둑판 분석

1. 실험의 다음 시리즈에서 분석의 균일 성과 재현성은 "바둑판"분석을 사용하여 평가됩니다. 그림 5A와 같이 일반적으로, 제어 억제제는 384 잘 접시의 각 열 및 행의 다른 모든 우물에 도금되어 있습니다. 엄격한 검정의 소음을 평가하기 위해 억제제 EC ₈₀ 농도를 사용해야합니다. DMSO는 차량 제어와 같은 다른 우물에 추가됩니다. 의 TL ⁺ 자속 DMSO 및 약물 처리 전지는 Z 프라임, 우물의 두 인구 중 잘 - 투 - 잘 다양성의 통계 측정에 대한 값을 계산하는 데 사용됩니다. Z 총리는 공식을 사용하여 계산된다 :
   Z 프라임 = 1 - (3SD _P + 3SD _N) / | 의미 _P + _N을 의미 |
   SD는 표준 편차이고, P는 자유로운 유량이며, N은 완벽하게 자속 값을 저해하고 있습니다. 3 별도의 일에보다 크거나 0.5 동일한 Z '값 분석은 S 간주됩니다높은 처리량 검사에 대한 uitable.
2. 판, 염색 부하와 각도에 HBSS 검정 버퍼 20 μl를두고, 섹션 3에 설명 된대로 BD PureCoat 아민 - 코팅 384 잘 접시에 세포를 씻어. 전체 판은 테트라 사이클린과 유도해야합니다.
3. 멀티 채널 pipettor를 사용하여 384도 폴리 프로필렌 판에 pipetting하여 화합물 / DMSO 판을 μl / 잘 대상 Kir 섹션 6.5에서 결정된 농도의 채널, 0.1 % V / V DMSO의 알려진 억제제의 80 차량은 그림 5A에 표시. 최대 잘 B24에 멀티 채널 pipettor 잘 B2 등으로 대체를 사용하여 잘 A1부터 알려진 억제제를 추가합니다. DMSO 잘 A24에에 그렇게까지 ​​잘 B1에서 시작하여과이 절차를 반복합니다. 판의 최종 레이아웃은 바둑판의 일치해야합니다.
4. 최적의 TL을 기반으로 5 배 TL ⁺ 자극 판 ⁺ 섹션 4에서 결정을 준비합니다.
5. 전지, 화합물 및 T로드리터 ⁺ FDSS에 자극 접시합니다. 20 μl 2 배 농도 화합물 시리즈는 HBSS 분석 버퍼 20 μl를 포함하는 셀 플레이트의 해당 우물에 추가됩니다 있도록 두 추가 프로토콜을 설정합니다. 셀 플레이트에 화합물을 추가하고 최대 실온에서 20 분에 품다. 셀 플레이트의 각도에 5 배 TL ⁺ 버퍼 10 μl를 추가하기 전에 적어도 10 초 동안 기록 기준 FluoZin-2 형광. 결과의 재현성을 확립하기 위해 세 별도의 일에 실험을 반복합니다.

8. 파일럿 화면

1. 분석 개발의 마지막 단계에서 대규모 높은 처리량 화면에 결국 사용됩니다 조건 하에서 분석의 성능을 평가하기 위해 몇 천 화합물의 시험 화면을 수행합니다.
2. 각 우물에 HBSS 검정 버퍼 20 μl를 떠나지 플레이트, 염색 부하 및 제 3 항에 설명 된대로 BD PureCoat 아민 - 코팅 384 잘 접시에 세포를 씻어).전체 플레이트가 Kir 채널 식을 유도하기 위해 테트라 사이클린과 함께 밤새 배양해야합니다.
3. 테스트 할 약 2,000에서 3,000 구조적으로 다양한 화합물을 선택합니다. 그것은 종종 적절하고 잠재적으로 이온 채널 변조기에 대한 풍부한 알려진 활동과 화합물 컬렉션을 사용하기 편리합니다. 이러한 컬렉션은 스펙트럼 컬렉션 (MicroSource)와 LOPAC 컬렉션 (시그마)가 포함되어 있습니다. 또한, 파일럿 화면에서 관심 Kir 알려진 변조기를 포함 신중한 것입니다. 이상적으로이 화합물은 나중에 설명 히트 따기 방법의 편견 테스트를 수 있도록 눈을 멀게 패션에 우물에 추가됩니다. 대상 플레​​이트에 MLPCN 수집 (소스 판)에서 DMSO의 선택 화합물의 적절한 볼륨을 전송하는 Labcyte 에코 액체 처리기 또는 적절한 핀 도구를 사용하여 384도 폴리 프로필렌 판 (대상 플레​​이트)에 화합물을 준비하는 시험 화합물이 있습니다 열만 3-22에서,열 1, 2, 23의 모든 다른뿐만에서는 24 제 7 항에서 결정 완전히 Kir을 억제하는 것으로 알려진 농도에 알려진 억제제를 추가 할 수 있습니다. 열 1, 2, 23, 24의 나머지 우물에서 DMSO 농도가 검색 차량 컨트롤을 생성하기 위해 DMSO의 적절한 볼륨을 추가 할 수 있습니다. Multidrop 콤비를 사용하여 분석 완충액으로 모든 우물을 희석. 일반적으로 시험 화합물은 2 배의 대상 심사 농도 위 20 μM이 될 것입니다.
4. 섹션 4에서 결정 최적의 TL ⁺ 농도에 따라 TL ⁺ 자극 판을 만듭니다.
5. 파일럿 화면을 실행합니다. 파일럿 심사 실행에 플레이트들 사이 일관된 타이밍을 유지하기 위해 프로토콜의 실행 단계를 비틀하는데주의를 기울여야.
6. 파일럿 화면이 완료되면 Z-프라임 방정식을 사용하여 열을 1, 2, 23, 및 24에서 바둑판 우물를 분석합니다. 제어 인구의 가난한 분리의 원인을 결정하기 위해 이하 0.5의 Z-주요 값을 표시 번호판을 검사합니다. 조회수는 B 수e는 방법 번호를 사용하여 선택했습니다. 파일럿 화면의 경우는 차량 제어 인구의 평균과 표준 편차를 계산하고> / = 3 표준 편차 차량 컨트롤의 평균에서 값을 생산 우물에 따라 조회를 선택하는 것이 일반적입니다.
7. 히트 따기 후,의 재시험 선택한 조회수 플레이트 2 세트에서 중복. 접시 중 하나 세트는 테트라 사이클린과 다른 하나는 테트라 사이클린의 존재에 안정적으로 Kir 셀 라인을 포함의 부재에서 안정적인 Kir 세포가 포함되어 있습니다. 두 재시험 플레이트의 적어도 하나의 긍정적 인 재시험 및 uninduced 접시에 중요한 활동을 보여 실패로 간주 될 수 있다는 조회수가 안타를 확인했습니다. 검색된 얼마나 많은 '숨겨진'컨트롤 샘플 확인하기 위해 검증 된 히트 목록을 검사합니다. 파일럿 화면에 컨트롤을 감지하지 않으면 심사 또는 히트 따기 매개 변수의 추가 최적화에 대한 필요성을 나타냅니다.

Representative Results

테트라 사이클린-inducible 표현 시스템의 사용은 내생 경로와 관심 Kir 채널을 통해 TL ⁺ 자속을 구별하기에 편리한 내부 통제를 제공합니다. 그림 1 쇼 실험의 다른 유형에 사용되는 셀 도금지도의 예. uninduced 또는 테트라 사이클린 - 유도 세포를 포함하는 우물의 위치는 서로 다른 색상으로 표시됩니다. 그림 2A는 분석 개발과 화합물 심사에 대한 최적의 TL ⁺ 농도를 결정하는 데 사용되는 소스 판지도를 보여줍니다. 색상 그라디언트는 100 %에서 0.002 % TL에 이르기까지 3 배 희석 시리즈를 나타냅니다 ^+. 대표 형광 강도의지도는 ⁺ 플럭스 값은 각각 낮은 - 투 - 높은 TL을 나타내는 멋진 - 투 - 따뜻한 색상으로, 그림 2B에 표시됩니다. 그림 1C에 표시된 셀 도금 맵이 실험에 사용되었다. t에 4 매개 변수 물류 기능의 적합그는 TL ⁺ CRC (그림 2C)은 TL ^+. 그림 3A는 분석의 DMSO 허용 오차를 결정하는 데 사용되는 소스 판지도를 보여 15 %의 EC ₈₀ 값을 결정하는 데 사용됩니다. 색상 그라디언트는 10 %에서 0.01 % DMSO에 이르기까지 2 배 희석 계열을 나타냅니다 반면 열 1과 24 만 검정 버퍼가 포함되어 있습니다. 대표 형광 강도의지도는 어두운 파란색으로 표시 낮은 TL ⁺ 플럭스 값으로, 그림 3B에 표시됩니다. 그림 1B에 표시되는 셀 도금 맵이 실험에서 사용되었습니다. DMSO의 지정된 농도를 포함하는 우물에서 녹화 평균 TL ⁺ 자속 값은 그림 3C에 요약되어 있습니다. 데이터는 DMSO의 부재에 기록 TL ⁺ 자속의 비율로 꾸몄다됩니다. 특정 Kir 채널의 경우, 2.5 %로 DMSO는 농도가 좀 TL ⁺ 자속에 아무런 영향을 미치지 않았다, 따라서 실험에 사용할 수 있습니다. 그림우레 4A는 Kir 채널의 알려진 억제제에 대한 농도 - 반응 곡선을 구축하는 데 사용되는 소스 판지도를 보여줍니다. 각 화합물은 다른 색상으로 표시되며 일반적으로 3 배 희석 시리즈로 도금되어 있습니다. 대표 형광 강도 맵은 그림 4B에 표시됩니다. 그림 1C에 표시된 셀 도금 맵이 실험에 사용되었다. 억제제에 의한 TL ⁺ 자속의 복용에 의존 억제를 보여주는 대표적인 실험은 그림 4C에 표시됩니다. 분석의 견고성은 그림 5에 요약되어 소위 "바둑판"assays에서 결정된다. 그림 5A, 억제제의 maximally 효과적인 농도 또는 차량 제어로 0.1 % DMSO에 표시된 소스 판지도에서 우물을 번갈아에 도금되어 있습니다. 그림 5B는 대표 형광 강도 맵을 보여줍니다. 정상 TL ⁺ 자속의 분산 줄거리는 individu에서 녹화알 우물은 그림 5C에 도시된다. 3 표준 편차가 점선으로 표시됩니다 반면 평균 형광 값은 실선으로 표시됩니다. Z 프라임 값이 판에 대해 계산 두 셀 인구가 구분 얼마나 잘 분리의 통계 측정은 잘 높은 처리량 검사에 필요한 0.5 임계 값 초과 0.75입니다.

1 그림. TL에 사용되는 셀 도금지도 ⁺ 플럭스 분석 개발. (A) 셀 도금지도 최적의 분석 TL ⁺ 농도를 결정하기 위해 사용합니다. 열 1 우물은 행 A1-23, K1-12, F13-23, 및 P13-23은 uninduced 세포를 (-Tet)이 포함되어 있습니다. 나머지 우물은 Kir 채널 식을 유도하기 위해 테트라 사이클린 (+ Tet)로 처리 된 세포가 포함되어 있습니다. (B) 셀 찮아테지도가 검정 DMSO 허용을 결정하기 위해 사용 체커 분석을 수행합니다. 모든 우물은 테트라 사이클린 (+ Tet)로 처리되어 있습니다. (C) 셀 플레이트지도 알려진 약리 변조기에 검정 감도를 결정하는 데 사용. 열 1 행 A1-23의 우물은 uninduced 세포를 (-Tet)이 포함되어 있습니다. 나머지 우물은 테트라 사이클린 (+ Tet)로 처리 된 세포가 포함되어 있습니다. 더 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 2. 최적의 분석의 결정 TL ⁺ 농도. (A) 최대 FluoZin-2 형광의 증가 (EC _80)의 약 80 %를 세상의 시작과 끝, TL의 ^{+ 농도를} 결정하는 데 사용되는 소스 판지도. 행과 칼럼NS 1 24 일 (노란색) 12 MM TL ₂ SO _4의 5 배 농도가 포함되어 있습니다. 나머지 행은 ₄ SO 12 MM (100 %)에서 0.024 밀리미터 (0.002 %) TL _2까지 3 배 희석 시리즈가 포함되어 있습니다. 시리즈는 열 2-12과 13-23으로 반복됩니다. (B) 형광 강도의지도 TL ⁺ 추가 한 후 각도 약 1 분 동안 TL ⁺ 자속을 묘사. 오른쪽에있는 의사 컬러 바는 각각 낮은 및 높은 자속 값을 나타내는 쿨러와 섹시한 색상으로, TL ⁺ 자속의 범위를 나타냅니다. 열 1의 쿨러 색상, 행 A1-23, K1-12, F13-23, 및 P13-23 uninduced 셀의 낮은 TL ⁺ 자속에 의한 뜻합니다. 열 24에 포함 나머지 우물은, (그림 1A의 셀 도금지도 참조) Kir 채널 식을 유도하기 위해 테트라 사이클린로 치료 된 세포가 포함되어 있습니다. (C) 형광의 TL ^+에 의존 변경 (N = 3) ± SEM CRC를 의미합니다. 네 파라미터 물류의 func에 맞는데이터에 기는 15 % TL ^+의 IC ₈₀ 값을 굴복. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 3. DMSO에 검정 허용. (A) 소스 판지도 DMSO에 검정 허용을 결정하는 데 사용됩니다. 열 1과 24 HBSS 분석 버퍼가 포함되어 있습니다. 행 10 %에서 0.01 % V / 대에 이르기까지 2 배 DMSO 희석 시리즈의 2 배 농도를 포함 (B) 대표 형광 강도의지도 TL ⁺ 추가 한 후 각도 기록 약 1 분에 TL ⁺ 자속을 묘사. 오른쪽에있는 의사 컬러 바는 각각 낮은 및 높은 자속 값을 나타내는 쿨러와 섹시한 색상으로, TL ⁺ 자속의 범위를 나타냅니다. (C) 평균 ±, SEM (N = 9) TL 혼자 HBSS 검정 버퍼의 존재에 기록 된 것과 표준화 ⁺ 자속. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

4 그림. 알려진 pharmacologically 활성 물질에 대한 분석 감도. (A) 소스 판지도 TL의 알려진 pharmacologically 활성 화합물의 활동 ⁺ 자속 분석을 평가하기 위해 사용됩니다. 과 열 1 24 0.1 % V / V DMSO를 포함 행. 판 레이아웃이 열 2-23의 세중의 10 화합물의 테스트를 할 수 있습니다. 행은 (B) 형광 강도지도는 각 잘 approximatel에 대한 ⁺ 자속 TL을 묘사 한 100 μM에서 2 NM에 이르기까지 화합물의 3 배 시리얼 희석 시리즈의 2 배 농도를 포함TL 후 Y 1 분 ⁺ 추가. 오른쪽에있는 의사 컬러 바는 각각 낮은 및 높은 자속 값을 나타내는 쿨러와 섹시한 색상으로, TL ⁺ 자속의 범위를 나타냅니다. 열 1 행 A1-23의 우물이 uninduced 세포가 포함되어 있습니다. 나머지 우물 관심 Kir 채널을 (그림 1C의 셀 플레이트지도 참조) 표현 테트라 사이클린 - 유도 세포가 포함되어 있습니다. (C) 우물의 FluoZin-2 형광의 대표 TL ⁺ 유발 변경 Kir 채널 억제제의 지시 농도로 사전 처리가. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 5. HTS에 대한 검정 적합성의 결정. (A) 소스 판지도는 0.1 % DMSO (차량) 또는 알려진 억제제의 maximally 효과적인 농도를 포함하는 우물 사이에서 잘 - 투 - 잘 다양성을 평가하는 데 사용됩니다. (B) 형광 강도의지도 TL ⁺ 추가 한 후 각도 약 1 분에 TL ⁺ 자속을 묘사. 모든 우물 관심의 Kir 채널을 (그림 1B의 셀 플레이트지도 참조) 표현 테트라 사이클린 - 유도 세포가 포함되어 있습니다. (C) 정상 상태 형광 값의 대표 분산 줄거리는 차량 또는 억제 - 처리 우물에서 얻은. 각 샘플 인구의 평균 형광 진폭은 실선으로 표시되어 평균에서 3 표준 편차는 점선으로 표시되며, 교체 차량에 대한 샘플 (VHL)와 억제제는 (INH) 각 지점으로 그래프로 나타납니다. 하려면 여기를 클릭하세요 더 큰 그림을 볼 수 .

Discussion

데이터 치료 : 일단 데이터가 분석에 일반적인 단계는 실험, F ₀ 초에 초기 값으로 각도의 형광 반응, F를 정규화, 포함한다 수집하고 있습니다. 이것은 일반적으로 "정적 비율"로 지칭하고 "F / F ^{_{0"상징합니다.}} F ₀ 표시기 염료에 의해 ​​지배되는 경우에는 정적 비율 작업이 실질적으로 같은 조명, 신호 컬렉션에 disuniformities 등 여러 요인에 대한 해결됩니다 그리고 핸드폰 번호. 배경이 적절하게 고정 비율을 계산 이전에 처리 할 수​​ 있습니다하지 않는 한 염료 신호가 약한 또는 시스템의 배경 형광 또는 반사가 높은 경우, 정적 비율은 적용되지 않습니다. 데이터 정규화 후 활동을 수량화하고 조회를 선택하는 데 사용됩니다 하나의 값으로 형광 파형을 줄이기 위해 일반적입니다. 가장 일반적으로이 문제는 데이터를 맞는하여 수행됩니다TL의 추가 ⁺ evoked 형광 증가의 초기 기울기를 얻을 수에 따라 10 초를 가리 킵니다. 히트 따기를 들어, 인기있는 방법은 테스트 인구 화합물의 대부분은 (널 가설이 힘이다) 운영 중지 된 것으로 간주하는 것입니다. 평균과 표준 편차는 시험 인구에 대해 계산되고 조회수가 평균에서 3 개의 표준 편차 아르 그 선택됩니다.

긴 화합물 incubations에 대한 분할이 프로토콜 : 세포 구속력이 사이트에서 특히 Kir 채널 억제제, 그 연기를 검출하기위한, 그것은 오랜 기간 (예 : 20 분)에 대한 테스트 화합물로 세포를 배양 할 TL의 추가하기 전에 도움이 될 수 있습니다 ^+. 검정은 플레이트 리더에 도입되기 전에 화합물이 "오프라인"을 추가하는 경우, 테스트 화합물 (예 : 형광)의 광학 특성은 쉽게 인식되지 않을 수 있으며 악영향을 일반적으로 사용에 영향을 줄 수 있습니다데이터 정규화는 "정적 비율 '거짓 탐지 및 / 또는 허위 제외의 결과로 위에서 설명한 F / F _0으로 접근한다. 동시에 긴 배양을위한 리더에 검정 판을 유지하지 피하는 동안이 문제를 방지하려면 한 솔루션은 "두 읽기"프로토콜을 활용하는 것입니다. 첫 번째 읽기는 화합물은 사전 화합물뿐만 아니라 F ₀ 캡처 할 수 있도록하고 시스템의 화합물 '광학 효과를 평가하기 위해 10 초 후 추가됩니다 짧은 (예 : 30 초) 실험입니다. 플레이트는 다음 리더에서 제거하고 원하는 기간 동안 incubated 및 탈륨 또한에 독자에게 반환됩니다. 모두 읽기가 완료 후, 첫 번째는 F ₀ 따라서 데이터를 따라서 개선 심사 처리량을 수집 독자가 바쁘게 할 수있는 기회를 허용하면서 화합물 "오프라인"을 추가와 관련된 많은 문제를 피할 수 읽기 두 번째의 데이터를 정상화하는 데 사용할 수 있습니다 참조하십시오. 두 읽기 접근 방식은 가장 쉽게 implem입니다자동화 된 검사 시스템을 사용할 때 ented. 이 두 읽기 접근 방식이 검출기 및 / 포화 또는 CCD 카메라의 유물을 읽을 아웃 원인이 형광 물질로 인한 문제를 제거하지 않습니다하는 것이 중요합니다.

activators에 대한 검정 구성 : 모든 Kir 채널 maximally 휴식 조건 하에서 활성화하면, 결국은 작은 분자 activators를 감지 할 수있는 분석을 설계 할 수도 있습니다. 이러한 경우에는 TL의 EC 농도 _80을 선택하면 ⁺ 안정적 activators을 감지 할 수있는 분석에 충분한 '여유'를 제공하지 않을 수 있습니다. 따라서, 하나는 활성 assays에 TL ⁺ (예 : EC _20)의 하부 농도를 사용하도록 선택할 수 있습니다. TL의 EC ₅₀ 농도 ^+의 사용을 허용하면서 모두 활성화 및 채널 인구 억제의 적절한 해상도를 제공하는 몇몇 경우에는 분석이 낮은만큼 변화가 표시 될 수 있습니다. 이 경우, 검정 m불안은 이중 활성 / 억제 모드로 실시. 가능한 경우 알려진 활성은 채널 activators을 발견 가능성을 극대화 할 수있는 적절한 TL ⁺ 농도를 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다.

제한 사항 : TL의 개발 및 실행 ⁺ 자속 기반의 높은 처리량 화면 중에 고려되어야합니다 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 예를 들어, 분석은 광학 특성 직접 화면에서 화합물의 영향을받을 수있는 형광 프로브를 사용하여 Kir 채널 활동의 간접적 측정에 의존하고 있습니다. 따라서, TL ⁺ 유동적 실험에서 중요한 관찰은 이온 채널 약리학에 대한 "금 표준"방법으로 간주됩니다 전압 클램프 전기 생리학을 사용하여 확인해야합니다. 또한, 작은 분자는 거짓 - 긍정적 인 히트의 식별로 이어지는 HEK-293 세포에 표현 내생 TL ⁺ 자속 경로에 직접 영향을 미칠 수 있습니다. tetracyclin전자 inducible 시스템은 히트 곡이 빠르게 내생 경로에 효과 uninduced 세포에 상영 할 수 있기 때문에 변조기를 채널 이동 Kir의 허위 - 긍정적 안타를 구별에 특히 유용합니다. 마지막으로, TL의 낮은 용해도 ⁺ 염화물 함유 버퍼에서이 TL의 농도를 제한 ⁺ 그 타겟 ^(11)의 약리학를 증가 할 수 있습니다 비 생리적 TL ⁺ 자극 버퍼의 사용을 필요로 검정에서 사용할 수 있습니다. 관심의 대상을 가진 다른 버퍼의 호환성은 신중하게 분석 개발 중에 평가해야합니다. 이것은 다른 TL ⁺ 부양 버퍼를 사용하여 알려진 변조기에 대한 CRCs을 수립하고 약리학 가장 밀접하게 생리 버퍼를 사용하여 관찰이 일치하는 조건을 선택하여 수행 할 수 있습니다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
pcDNA5/TO	Invitrogen	V1033-20	Tetracycline-inducible expression vector
T-REx-HEK293 cells	Invitrogen	R71007	Tetracycline-inducible cell line
Lipofectamine LTX/Plus Reagent	Invitrogen	15338100	Transfection reagent
FBS	ATLANTA Biologicals	S11550	Cell culture media
DMEM	Invitrogen	11965	Cell culture media
Hygromycin B	Invitrogen	10687-010	Cell culture media
Blasticidin S	Invitrogen	R210-01	Cell culture media
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140	Cell culture media
HBSS-divalent free	Mediatech	21022CV	Cell washing
Trypsin-0.25%	Mediatech	25053CI	Cell dissociation
Tetracycline-HCl	Sigma	T9823	Induction reagent
Dialyzed FBS	ATLANTA Biologicals	S12650	Plating media
FluoZin-2	Invitrogen	F24189	Fluorescent dye
Pluronic F-127	Invitrogen	P-3000MP	Dye loading
HBSS	Invitrogen	14175	Assay buffer
HEPES	Invitrogen	15630	Assay buffer
NaHCO3	Sigma	S6297	Tl+ stimulus buffer
MgSO4	Sigma	M2643	Tl+ stimulus buffer
CaSO4∙2H2O	Sigma	C3771	Tl+ stimulus buffer
D-Glucose	Sigma	G7528	Tl+ stimulus buffer
Thallium sulfate	Aldrich	204625	Tl+ stimulus buffer
HEPES	Sigma	H4034	Tl+ stimulus buffer
DMSO	Sigma	D4540	Solvent
Eight-channel electronic pipettor	Biohit	E300	Cell plating in 384-well plates
BD PureCoat amine-coated 384-well plates	BD Biosciences	356719	Assay microplates
Echo qualified 384-Well polypropylene microplate (384PP)	Labcyte	P-05525	Compound source microplates
384-well polypropylene microplates	Greiner Bio-One	781280
Multidrop Combi reagent dispenser	Thermo Scientific	5840300
ELx405 microplate washer	BioTek	ELx405HT	Automated cell washing
Echo liquid handler	Labcyte	Labcyte Echo 550
Bravo automated liquid handling platform	Agilent Technologies	Standard model
Hamamatsu FDSS 6000	Hamamatsu		Kinetic imaging plate reader
Table 1. List of Materials and Reagents.