Высокопроизводительного скрининга для малых молекул модуляторы калиевых каналов входящего Rectifier

Summary

Методы разработку и утверждение количественного анализа флуоресценции для измерения активности калия внутрь выпрямителя (Кир) каналы высокой пропускной скрининга соединений представлены.

Protocol

1. Генерация Стабильный Поликлональные клеточных линий

1. Создание высокого качества стабильной клеточной линии, выражающие Кир канала интересов является важным первым шагом на пути создания надежной высокопроизводительного скрининга анализа. Учредительный K ⁺ канала гиперэкспрессия может привести к активации клеточной гибели пути, стабильной клеточной линии вырождения и потери качества анализа. Чтобы избежать этих потенциальных проблем и обеспечивают удобный внутреннего контроля для анализа развития (см. ниже), тетрациклин-индуцируемой экспрессии системы рекомендуется ^8.
2. Культура родительских T-REX-НЕК293 с использованием стандартных методов в B-среде (DMEM роста среде, содержащей 10% FBS, 50 ед / мл пенициллина, 50 мкг / мл стрептомицина и 5 мкг / мл бластицидин S). Используйте ранних клеток прохода (например, 3-4 проходов, так как оттаивание от хранения в жидком азоте) для трансфекции и стабильный выбор клон.
3. Плита 4 миллиона T-REX-НЕК293 в75 см ² колбы так, чтобы колбы составляет около 80% вырожденная на следующий день. Культура ночь в 5% CO _{2-инкубаторе} при температуре 37 ° C.
4. Трансфекции клеток с использованием 10-15 мкг pcDNA5/TO-Kir ДНК и Lipofectamine LTX / Plus реагент в соответствии с протоколом производителя. После 5 часов, заменить трансфекции среду с B-среде.
5. Через 24 часа после трансфекции, заменить B-среде с B-среде, содержащей 250 мкг / мл гигромицину (BH-среда), чтобы начать стабильную выбор клон. Поток клетки каждые 2-3 дней со свежим BH-среде.
6. Более 90% клеток должны умереть в течение следующих 7 дней, оставляя позади небольшие колонии стабильно трансфицированных клеток. Разрешить колонии расти в течение дополнительных 10-14 дней до расщепления на 175 см ² колбы для расширения.
7. Для криоконсервации, заморозить 3 х 10 ⁶ клеток / мл в среде, содержащей 45% обусловлен BH-средний, 45% антибиотиков, сыворотки, содержащей DMEM и 10% ДМСО. Замерзатьклеток в течение ночи при -80 ° C в контейнере замораживании клетки, а затем перейти на жидкий азот для длительного хранения. Оттепель клеток из жидкого азота с использованием рекомендуемого протокола Invitrogen автора. Обратите внимание, что жизнеспособность клеток будет ниже, если они заморожены из фляжки, что составляет более 75% вырожденная во время обработки.

2. Генерация Стабильный моноклональных клеточных линий

1. Вымойте суб-вырожденная 75 см ² колбы стабильной поликлональных клеток с двухвалентной без HBSS. Добавить 1 мл трипсина и инкубировать в течение 3-5 мин в 5% CO _{2-инкубаторе} при температуре 37 ° C. Добавить 5 мл BH-среды в колбе для ингибирования трипсина деятельности и растирают неоднократно (например, 5 раз), чтобы полностью отделить клетки. Внимательно осмотрите клетки под микроскопом, чтобы обеспечить подвеска почти полностью состоит из одной клетки. Это позволит увеличить вероятность получения моноклональных клеточных линий.
2. Определить плотность клеток и разбавитьПодвеска в концентрации от 0,7 клеток на 20 мкл. Использование многоканальных дозаторов, пипетки 20 мкл клеточной суспензии в каждую лунку BD PureCoat амина покрытием (или эквивалент поли-D-лизин покрытием) 384-луночных планшетах. В принципе, 70% скважин должны получать одну ячейку с этим покрытием условиях. Таким образом, 384-а пластина должна содержать более 200 клонов для анализа. Продолжить культивирования клеток в 5% CO _{2-инкубаторе} при температуре 37 ° C.
3. Через неделю, осмотрите пластины под микроскопом для скважин, содержащих отдельные колонии. Обратите внимание, их положение на крышке с постоянным маркером для дальнейшего использования. Не забудьте также отметить и исключить скважин, содержащих несколько колоний. Это наиболее легко узнать по появлению колоний, выросших из разных сторонах хорошо. Следует помнить, что испарение имеет тенденцию происходить быстрее из колодцев вблизи края пластины. Добавить BH-средних скважин, где значительное испарение произошло. В противном случае, это ненужное тO кормить клеток.
4. Мониторинг скважин чаще в течение следующих 7-10 дней. Клетки будут готовы делить, когда скважины интерес, по крайней мере, 50% вырожденная.
5. Разделить клетки, чтобы дублировать 384-луночные планшеты, одна пластина для опробования с Tl ⁺ поток, а другой для продолжения моноклональных линий в культуре. Аспирируйте среды из лунок, содержащих клеточных линий, представляющих интерес. Вымойте клеток с двухвалентной без HBSS, добавить 20 мкл трипсина в каждую лунку и передать пластины на 37 ° C инкубаторе в течение 15-20 мин. После перемещения пластины обратно в капот культуре клеток, добавить 20 мкл BH-среда в каждую лунку и растирают несколько раз, чтобы отделить клетки. Осмотрите скважин под микроскопом, чтобы обеспечить клетки полностью диссоциированы. Для этого может потребоваться несколько раундов пипетирования, так как клетки будут плотно приверженца. Как только клетки разобщены, передавать 10 мкл каждой клеточной суспензии, чтобы дублировать скважин новый BD PureCoat амина покрытием 384-луночный планшет. Будьте уверены, чтобы отметить связь между источником хорошо, и дублировать назначения скважины, так что клоны выставке надежный канал Кир деятельности (см. ниже) может быть прослежено к первоначальному хорошо. Добавить 20 мкл BH-среде на первоисточник хорошо кормить оставшихся клеток и продолжать их в культуру в 5% CO _{2-инкубаторе} при температуре 37 ° C.
6. Разрешить клетки в конечном пластины придерживаться и расти до недели. Как только большинство клонов составит не менее 50% слияния, они могут быть оценены на Кир канал активности с использованием Tl ⁺ поток анализа, описанного ниже.
7. За день до теста, аспирации культуральной среде и заменить его BH среде, содержащей 10% FBS диализу. Это предотвращает случайное выражение канала, которые могут возникнуть тетрациклин загрязненной сыворотки. Вызвать Кир канал выражение только в одной из дублирующих скважин для каждого клона в том числе 1 мкг / мл тетрациклина. Дублировать неиндуцированные также будет служить«Фон» управления. Выполните Tl ⁺ поток анализов как описано далее.

3. Генеральный Tl ⁺ поток Процедура анализа

1. За день до Tl ⁺ поток эксперимент, отделить клетки и количественного определения плотности клеточной суспензии, как описано в разделах 2.1 и 2.2. Пластина 20000 моноклональных клеток, стабильно трансфицированных геном Kir канал интерес в каждую лунку BD PureCoat амина покрытием 384-а диск с помощью Thermo Multidrop Combi или многоканального дозатора. Используйте BH среде, содержащей 10% FBS диализа для покрытия. Заметим, что некоторые клетки будут культивировали в течение ночи с 1 мкг / мл тетрациклина, чтобы побудить Кир канала выражении, в то время как другие не будут. Расположение индуцированных клеток и неиндуцированных будет отличаться для каждого типа эксперимента и показано на рисунке 1.
2. На следующий день, осмотрите пластины под микроскопом, чтобы убедиться, что клетки являются приверженцем и равномерно распределяется по днускважин. Скважин должна быть 80-90% вырожденная.
3. Используйте ELx405 Промыватель микропланшетов, чтобы заменить среду клеточной культуры с 20 мкл на лунку HBSS буфера для анализа, содержащем 20 мМ HEPES и буфером до рН 7,3 с помощью NaOH. Кроме того, можно использовать "Флик и шлема" метод, при котором пластина переворачивается и щелкнул резко вниз, чтобы извлечь среду в мусорный контейнер, а затем похлопал сложены на бумажные полотенца, чтобы удалить оставшиеся средства массовой информации. Сразу добавить обратно HBSS буфера для анализа к плите, чтобы предотвратить клетки от осушающий.
4. Подготовка FluoZin-2, AM раствор красителя нагрузки. После кратковременного центрифугирования труб, растворить 50 мкг FluoZin-2 порошка в 100 мкл безводного ДМСО. На данный момент, аликвоты раствора 1000 х можно хранить при температуре -20 ° C для дальнейшего использования. Когда все будет готово к использованию, добавить 50 мкл 20% веса в объеме раствора Pluronic F-127/DMSO на краску и смешайте с осторожным пипетированием. Не замораживать красителя раз Pluronic F-127 был добавлен, какнизкая температура может привести к поверхностно-активным веществом, чтобы осадить из раствора. Добавить 150 мкл объема FluoZin-2, AM/Pluronic-F127 до 100 мл HBSS буфера для анализа и аккуратно перемешать, чтобы краситель буфера загрузки. Использование Multidrop Combi или многоканального дозатора, добавить 20 мкл красителя буфера загрузки в каждую лунку, уже содержащей 20 мкл HBSS буфера для анализа. Инкубируйте клетки при комнатной температуре в течение примерно 1 часа (как правило, инкубационный было сделано в темноте, хотя нет прямых доказательств того, что это необходимо).
5. В то время как клетки загрузки с красителем, подготовить стимул Tl ⁺ пластины. Свежий растворить 0,5 г бикарбоната натрия в 50 мл 5 раз Tl ⁺ стимул буфера, содержащего 1 мМ сульфата магния, 1,8 мМ сульфата кальция, 5 мМ глюкозы, 10 HEPES мм и 12 мм Tl ⁺ сульфат. Кроме того, бикарбонат натрия может быть заменен глюконат натрия, если, например, рН раствора должна быть в пределах очень узкого диапазона и потери углекислого газавызывает беспокойство. Закройте пробирку крышкой плотно, чтобы ограничить утечку углекислого газа и перевернуть несколько раз, пока бикарбонат натрия переходит в раствор. Использование многоканальных дозаторов, добавить 50 мкл раствора в каждую лунку полипропилена 384-луночный планшет (табл. 1).
6. После того, как клетки были загружены FluoZin-2, М., мыть тарелки с ELx405 Промыватель микропланшетов или с помощью "Флик и шлема" методом, как описано выше в разделе 3.3. В зависимости от типа Tl ⁺ поток эксперимента должны быть выполнены, добавить туда 20 мкл или 40 мкл HBSS аналитического буфера в каждую лунку. Пластины готовы к экспериментам.
7. Клетки и Tl ⁺ плит в Hamamatsu функциональной системы скрининга лекарственных средств (FDSS) или эквивалент кинетической ридере изображений с интегрированным выдачи жидких возможности. Используйте соответствующие фильтры для флуоресцеина / флуоресцеина на основе красителей, таких как Fluo-4.
8. Установка одного дополнения протокола, так что 10 мкл 5x Tl ⁺Серия будет добавлена ​​в соответствующие лунки ячейки пластины, содержащей 40 мкл HBSS буфера для анализа. Запись базовой флуоресценции при частоте 1 Гц отбор проб в течение 10 сек. А-к-а флуоресценция должна быть равномерной и стабильной по всей пластине раз условия оптимального покрытия ячейки, мойки и красителей нагрузки устанавливаются. Интегрированный 384-канала дозатора используется для одновременного добавить стимул Tl ⁺ буфера в каждую лунку.
9. Запись по крайней мере 2 мин, так что скорость и пик Tl ^{+-индуцированное} увеличение флуоресценции захватил для обработки и анализа.

4. Определение оптимальной концентрации Tl +

1. Tl ⁺ легко проникает в самые внутренние выпрямителя K ⁺ каналы. Для того, чтобы Tl ⁺ концентрация не превышает динамический диапазон Tl ⁺ репортерного красителя FluoZin-2, следует эмпирически определить оптимальные концентрации Tl ^+, которые будут использоваться в высоко-тhroughput экрана. Мы рекомендуем концентрации Tl ^+, которая вызывает 80% от максимальной флуоресценции ответ (EC ₈₀₎ в условиях, когда канал максимально активированы.
2. Plate, краситель нагрузки и промыть клетки BD PureCoat амина покрытием или эквивалент поли-D-лизином 384-луночных планшетах, как описано выше в разделе 3, в результате чего 40 мкл HBSS аналитического буфера в каждую лунку. Как показал в своей тарелке карту на рисунке 1а, столбец 1 и строки А1-А23 должна содержать клетки, которые не были вызваны с тетрациклином и, следовательно, не выражаем Кир канал интерес. FluoZin-2 сигналов флуоресценции от неиндуцированных скважин будет использоваться для определения уровня Tl ⁺ поток через эндогенные путей, таких как Na ⁺ - K ^{+-АТФазы} насос и напряжение закрытого K ⁺ каналы, которые обычно выражаются в НЕК- Клетки 293.
3. Использование Agilent Bravo автоматизированной обработки жидких платформы или ручной пипетки для подготовкиодиннадцать точки Tl ⁺ концентрация серии разведений в буфер анализ HBSS. Как правило, 3-кратные серийные разведения серии в диапазоне от 100% до 0,002% Tl ⁺ оценивается в анализе. Серия должна быть составлена ​​на 5-кратным концентрацию, потому что Tl ⁺ решения будет разбавляться 1:5 в окончательный анализ. Подготовка серии разведений путем разбавления стандартного 5x Tl ⁺ буфер описано в разделе 3 с 5-кратным Tl ^{+-свободный} буфер, содержащий 1 мМ сульфата магния, 1,8 мМ сульфата кальция, 5 мМ глюкозы и 10 мМ HEPES. Опять же, только растворить 0,5 г бикарбоната натрия в 50 мл конечного буфера Tl ⁺ непосредственно перед покрытием в полипропиленовой 384-луночный планшет в соответствии с пластиной карте показано на рисунке 2А.
4. Загрузите клетки и Tl пластины ⁺ стимул в FDSS. Установка одного дополнения протокола, так что 10 мкл 5x Tl ⁺ серия будет добавлена ​​в соответствующие лунки ячейки пластины, содержащей 40 мкл HBSS буфере. Запись базовой FluoZin-2 флуоресценции в течение 10 секунд, прежде чем добавить Tl ⁺ к плите. Повторите эксперимент на 3 отдельных дней, чтобы установить воспроизводимость результатов.

5. Определение чувствительности анализа в ДМСО

1. Малых молекул допрошен в высокой пропускной способности экрана растворяют в органическом растворителе диметилсульфоксид (ДМСО), который сам по себе может влиять на производительность анализа. Таким образом, чувствительность теста в ДМСО сначала должны быть рассмотрены с целью установить высокие концентрации ДМСО допустимого на экране.
2. Plate, краситель нагрузки и промыть клетки BD PureCoat амина покрытием 384-луночных планшетах, как описано выше в разделе 3, в результате чего 20 мкл HBSS аналитического буфера в каждую лунку. Вся пластинка должна содержать клетки, которые были вызваны с тетрациклином (рис. 3А).
3. Используйте Bravo Автоматизированная платформа обработки жидких или ручной пипетки для подготовки одиннадцать точке DMSO концентрации разведения серии в HBSS буфера для анализа. Как правило, в 2-кратном разведении серии в пределах от 10% до 0,01% об / об ДМСО оценивается на деятельность в анализе. Серия должна быть составлена ​​на 2x концентрация ДМСО, потому что решения будут разбавлять наполовину в окончательном анализе. Разбавления серии должны быть покрыты в полипропиленовой 384-луночный планшет, в соответствии с пластиной карте показано на рисунке 3А.
4. Подготовка 5x Tl ⁺ стимул плиты на основе EC ₈₀ или оптимальное Tl ⁺ определяют концентрацию в разделе 4.
5. Загрузите клетки, ДМСО и Tl ⁺ стимул плит в FDSS. Установить два дополнения протокола, так что 20 мкл 2x концентрация ДМСО серия будет добавлена ​​в соответствующие лунки ячейки пластины, содержащей 20 мкл буфера для анализа HBSS. Оставьте ДМСО на клетки для того же количества времени клетки будут подвергаться небольшой автомобиль молекулы при экраном. Запись базовой FluoZin-2 флуоресценции нане менее 10 секунд, прежде чем добавить 10 мкл 5x Tl ⁺ буфера в каждую лунку клеточной пластинки. Повторите эксперимент на 3 отдельных дней, чтобы установить воспроизводимость результатов.
6. Анализа должны быть терпимы к ДМСО концентрации не менее 0,1% об / об для типичного высокой пропускной способностью экрана, в которой соединения испытывают при концентрации 10 мкМ.

6. Определение чувствительности анализа в известных фармакологических модуляторов

1. После определения оптимальной концентрации Tl ⁺ и ДМСО толерантности анализа, последствия известны фармакологически активных веществ на канале Кир-опосредованной Tl ⁺ потока должны быть изучены. Эта серия опытов будет проведена оценка чувствительности анализа, умение ранга порядка соединений на основе их активность, способность классифицировать соединений на основе их образ эффективности (например, активаторов, ингибиторов), и определение хорошо себя соединения управления, которые будут использоваться позже в Анализ DАЗВИТИЕ и экрана.
2. Plate, краситель нагрузки и промыть клетки BD PureCoat амина покрытием 384-луночных планшетах, как описано выше в разделе 3, в результате чего 20 мкл HBSS аналитического буфера в каждую лунку. Колонка 1 и строки А1-А23 должна содержать клетки, которые не были вызваны с тетрациклином (рис. 4а).
3. Используйте Bravo Автоматизированная платформа обработки жидких или ручной пипетки для подготовки одиннадцать точки концентрации разведения ряд известных модуляторов в HBSS буфера для анализа. Как правило, в 3-кратном разведении серии в диапазоне от 100 мкм до 2 нм оценивается по активности в тесте. Серия должна быть составлена ​​на 2x концентрация ДМСО, потому что решения будут разбавлять наполовину в окончательном анализе. Разбавления серии должны быть покрыты в трех экземплярах, полипропилен 384-луночный планшет, в соответствии с пластиной карте показано на рисунке 4а. Будьте уверены, что разведение сделаны таким образом, чтобы конечная концентрация ДМСО такие же, между лекарства и меньше тха N или равна предельно допустимой концентрации ДМСО, определенных в разделе 5.
4. Подготовка 5x Tl ⁺ стимул плиты на основе оптимального Tl ⁺ определяют концентрацию в разделе 4.
5. Загрузите клетки, соединения и Tl пластины ⁺ стимул в FDSS. Установить два дополнения протокола, так что 20 мкл 2x серии концентрации соединения добавляют в соответствующие лунки ячейки пластины, содержащей 20 мкл буфера для анализа HBSS. Добавить соединений в клетке пластины и инкубировать в течение 20 мин. Обратите внимание, что оптимальное время инкубации для соединений для выявления лучшего сигнала к фону можно определить, запустив серию экспериментов, в которых пара разное время инкубации избранных. Запись базовой FluoZin-2 флуоресценции по крайней мере 10 секунд перед добавлением 10 мкл 5x Tl ⁺ буфера в каждую лунку клеточной пластинки. Повторите эксперимент на 3 отдельных дней, чтобы установить воспроизводимость результатов.

_title "> 7. Шахматная анализ

1. В следующей серии экспериментов, равномерность и воспроизводимость анализа будут оцениваться с использованием "шахматной доски" анализ. Как правило, контроль ингибитора помещают в любой другой хороший каждого столбца и строки 384-луночный планшет, как показано на рисунке 5А. Для строго оценивать шум в анализе, EC ₈₀ концентрации ингибитора должна быть использована. ДМСО добавляют в другие скважины в качестве средства контроля. Tl ⁺ поток в ДМСО и наркотиков обработанных клеток используется для расчета значения Z премьер, статистическая мера а-к-а изменчивость между двумя популяциями скважин. Премьер-Z рассчитывается по формуле:
   Премьер-Z = 1 - _(р + 3SD 3SD _п) / | означает, _р + означает _п |
   где SD стандартное отклонение, р раскованно потока и п полностью тормозится поток ценностей. Анализ со значениями Z 'больше или равно 0,5 на 3 отдельные дни считаются сUITable для высокопроизводительного скрининга.
2. Plate, краситель нагрузки и промыть клетки BD PureCoat амина покрытием 384-луночных планшетах, как описано выше в разделе 3, в результате чего 20 мкл HBSS аналитического буфера в каждую лунку. Обратите внимание, что вся пластинка должна быть вызваны с тетрациклином.
3. Сделайте соединение / ДМСО пластины с помощью пипетки в 384-луночные полипропиленовые пластины с использованием многоканальных дозаторов, 80 мкл / лунку известный ингибитор канала целевой Кир при концентрации определены в разделе 6.5, и 0,1% об / об ДМСО автомобиля, как показано на рисунке 5а. Добавить известный ингибитор, начиная с A1 и использовании многоканальных дозаторов и заместителя хорошо B2 и так далее до и B24. Повторите эту процедуру с ДМСО, начиная с хорошо B1 и так далее до и A24. Окончательный вариант пластинки должно совпадать с шахматной доски.
4. Подготовка 5x Tl ⁺ стимул плиты на основе оптимального Tl ⁺ определены в разделе 4.
5. Загрузите клетки, соединение и Tл ⁺ стимул плит в FDSS. Установить два дополнения протокола, так что 20 мкл 2x серии концентрации соединения добавляют в соответствующие лунки ячейки пластины, содержащей 20 мкл буфера для анализа HBSS. Добавить соединений в клетке пластины и инкубировать в течение 20 мин при комнатной температуре. Запись базовой FluoZin-2 флуоресценции по крайней мере 10 секунд перед добавлением 10 мкл 5x Tl ⁺ буфера в каждую лунку клеточной пластинки. Повторите эксперимент на 3 отдельных дней, чтобы установить воспроизводимость результатов.

8. Пилот экрана

1. В заключительном этапе анализа развития, выполнить пилотный экран несколько тысяч соединений для оценки результатов анализа в условиях, которые будут использоваться в конечном счете в крупномасштабных высокой пропускной способностью экрана.
2. Plate, краситель нагрузки и промыть клетки BD PureCoat амина покрытием 384-луночных планшетах, как описано выше в разделе 3), в результате чего 20 мкл HBSS аналитического буфера в каждую лунку.Обратите внимание, что вся пластинка должна быть культивировали в течение ночи с тетрациклином, чтобы побудить Кир канал выражения.
3. Выберите примерно 2.000 до 3.000 структурно разнообразных соединений для проверки. Очень часто соответствующего и удобный в использовании соединений с известными коллекциями деятельности, потенциально обогащенные для модуляторы ионных каналов. Такие наборы включают Spectrum Collection (MicroSource) и LOPAC коллекции (Sigma). Кроме того, целесообразно включить известные модуляторы Кир интерес в экспериментальном экране. В идеале эти соединения будут добавлены в скважинах слепым, чтобы дать объективное тестирование хита сбор методов, описанных ниже. Подготовка соединений в 384-луночные полипропиленовые плиты (плиты назначения) с помощью жидких Labcyte Handler Echo или подходящим инструментом штифт для передачи соответствующего объема выбранных соединений в ДМСО из коллекции MLPCN (источник плит) к месту назначения пластин Обратите внимание, что тест соединения Только в колонках 3-22;В любой другой хорошо столбцов 1, 2, 23, 24 добавить известный ингибитор в концентрации известны в полной мере подавлять Кира, как это определено в разделе 7. В остальных скважинах столбцы 1, 2, 23 и 24 добавить соответствующий объем ДМСО для получения концентрации ДМСО из контрольной группы транспортных средств. Развести все скважин с использованием аналитического буфера Multidrop Combi. Обычно тест соединения будет составлять 20 мкм, 2-кратный выше их концентрация скрининга цели.
4. Сделать Tl ⁺ стимул пластин на основе оптимального Tl ⁺ определяют концентрацию в разделе 4.
5. Выполнение пилотного экрана. Позаботьтесь, чтобы поразить шагов выполнения протокола для поддержания соответствует времени между пластинами в преддверии отбора пилотов.
6. Как только пилот экран завершения анализа шахматной скважин из колонки 1, 2, 23 и 24 с использованием Z-премьер уравнения. Проверьте пластины, которые показывают, Z-премьер значения менее 0,5 для определения источника плохое разделение контроля населения. Удар бэлектронной выбирается с помощью ряда методов. Для пилотного экранах она является общей для вычисления среднего значения и стандартного отклонения населения управления транспортным средством и забрать хиты основана на скважинах значения> / = 3 стандартных отклонения от среднего транспортного средства контроля.
7. После удара сбор, повторное тестирование выбранных хитов в двух экземплярах, 2 комплекта пластин. Один набор пластин содержит стабильные клетки Кир в отсутствии тетрациклина, а другой стабильной клеточной линии Кир в присутствии тетрациклина. Хиты, что повторное тестирование положительные, по крайней мере один из двух повторных испытаний пластин и не показывают значительную активность в неиндуцированных пластины можно считать проверено хитов. Изучите проверено расстрельный список, чтобы определить, сколько из "скрытых" контрольных образцов не было обнаружено. Невозможность определить контроля в экспериментальном экране указывает на необходимость дальнейшей оптимизации скрининга или хит-сбор параметров.

Representative Results

Применение тетрациклина-индуцируемой экспрессии система обеспечивает удобный внутреннего контроля для различения Tl ⁺ поток через эндогенный пути и Кира канал интерес. Рисунок 1 показывает некоторые примеры ячейки покрытия карт, используемых в различных типах экспериментов. Положение лунки, содержащие неиндуцированных или тетрациклин клетках в обозначаются различными цветами. Рис. 2А показана карта источник пластины используются для определения оптимального Tl ⁺ концентрация для развития анализа и скрининга соединений. Цветовой градиент представляет 3-кратном разведении серии в диапазоне от 100% до 0,002% Tl ^+. Представитель флуоресценции карту интенсивности показано на рисунке 2B, с прохладным к горячим цвета указывает низкого до высокого Tl ⁺ значения потока, соответственно. Карта покрытия ячейки показана на рис 1С была использована для этого эксперимента. Припадке 4-параметрической логистической функции тОн Tl ⁺ CRC (рис. 2) используется для определения EC ₈₀ Значение 15% Tl ^+. 3А показана карта источник пластины используются для определения ДМСО толерантности анализа. Колонки 1 и 24 содержат буфере только, тогда как градиент цвета указывает на 2-кратном разведении серии в пределах от 10% до 0,01% DMSO. Представитель флуоресценции карту интенсивности показано на рис 3B, с низким Tl ⁺ значения потока указаны с более темным синим цветом. Карта покрытия ячейки показана на рисунке 1b была использована в данном эксперименте. Средняя Tl ⁺ поток значения, записанные из скважин, содержащих указанные концентрации ДМСО приведены на рисунке 3C. Данные приведены в процентах от Tl ⁺ поток записан в отсутствие ДМСО. Для этого конкретного канала Кир, ДМСО концентрации до 2,5% не влияет на Tl ⁺ поток и поэтому могут быть использованы в экспериментах. РисЮр 4А показана карта источник пластины используются для определения концентрации кривые отклика для известных ингибиторов канала Кир. Каждое соединение обозначается различным цветом и, как правило, покрыты в 3-кратном разведении серии. Представитель флуоресценции карту интенсивности показано на рисунке 4В. Карта покрытия ячейки показана на рис 1С была использована для этого эксперимента. Представитель эксперимент показывает зависимое от дозы ингибирование Tl ⁺ потока на ингибитора показано на рисунке 4С. Надежность теста определяется в так называемой "шахматной доски" анализы, которые приведены на рисунке 5. На карте источником пластины, показанной на рисунке 5а, максимально эффективная концентрация ингибитора или 0,1% ДМСО в качестве средства управления помещают в переменное скважин. Рис. 5б показывает, представитель флуоресценции карту интенсивности. Точечная диаграмма потока пик Tl ⁺ записанные с индивидуальноАль скважин представлена ​​на рис 5C. Средние значения флуоресценции обозначены сплошной линией, в то время как 3 стандартных отклонения обозначаются пунктирной линией. Премьер-Z значения, статистической мерой того, насколько хорошо разделены две популяции клеток отделяются, рассчитанные для этой пластинки составляет 0,75, что значительно выше в 0,5 порога, необходимого для высокопроизводительного скрининга.

Рисунок 1. Сотовые покрытия карты, используемые для Tl ⁺ поток анализе развития. (A) карта сотового покрытия использовать для определения оптимального анализа Tl ⁺ концентрацию. Скважинах в колонке 1, строки A1-23, К1-12, F13-23, и P13-23 содержат неиндуцированные клетки (-Tet). Остальные скважины содержат клетки, которые лечили тетрациклином (+ Tet), чтобы вызвать Кир канал выражения. (B) Сотовые плаТе карты использовать для определения толерантности анализа ДМСО и выполнять шахматной анализа. Отметим, что все скважины относятся с тетрациклином (+ Tet). (C) карту сотового пластины используются для определения чувствительности анализа известных фармакологических модуляторов. Скважинах в столбце 1 и строке A1-23 содержат неиндуцированных клетки (-Tet). Остальные скважины содержат клетки, которые лечили тетрациклином (+ Tet). Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Рисунок 2. Определение оптимального анализа Tl ⁺ концентрацию. (A) Источник пластины карты используются для определения концентрации Tl ^+, что вызывает примерно 80% от максимальной FluoZin-2 флуоресценции увеличение (EC _80). Row и столбеNS 1 и 24 (желтый) содержат 5-кратным концентрации 12 мМ Tl ₂ SO _4. Остальные строки содержат 3-кратном разведении серии в пределах от 12 мм (100%) до 0,024 мм (0,002%) Tl ₂ SO _4. Серия повторяется в столбцах 2-12 и 13-23. (B) флуоресценции карту интенсивности изображающие Tl ⁺ потока для каждой скважины примерно через 1 минуту после того Tl ^+. Псевдо-цветной полосе справа показывает степень Tl ⁺ поток, с более холодным и горячим цветов, представляющих низких и высоких значений потока, соответственно. Обратите внимание, что холодные цвета в колонке 1, строки A1-23, К1-12, F13-23 и P13-23 обусловлено низким Tl ⁺ поток в неиндуцированных клеток. Остальные скважины, в том числе в столбце 24, содержат клетки, которые лечили тетрациклином, чтобы побудить Кир канал выражения (см. карту покрытия ячейки в рис. 1А). (C) среднее ± SEM CRC для Tl ^{+-зависимых} изменений флуоресценции (п = 3). Установка четырех параметров логистической функцииния с данными дало IC ₈₀ значения 15% Tl ^+. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Рисунок 3. Анализ толерантности к ДМСО. (A) карта Источник пластины используются для определения теста толерантности к ДМСО. Колонки 1 и 24 содержат буфер HBSS анализа. Строк содержат 2x концентрация 2-кратное разбавление ДМСО серии в пределах от 10% до 0,01% V / v (B) представитель флуоресценции карту интенсивности изображающие Tl ⁺ потока в каждую лунку записано примерно через 1 минуту после того Tl ^+. Псевдо-цветной полосе справа показывает степень Tl ⁺ поток, с более холодным и горячим цветов, представляющих низких и высоких значений потока, соответственно. (C) Среднее ±, SEM (n = 9) Tl ⁺ поток нормированная на которые записаны в присутствии HBSS буфера для анализа в одиночку. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Рисунок 4. Анализ чувствительности к известным фармакологически активных соединений. (A) карта Источник пластины используются для оценки деятельности известных фармакологически активных соединений в Tl ⁺ потока анализа. Row и столбцы 1 и 24 содержат 0,1% об / об ДМСО. Пластина макета позволяет проводить тестирование из 10 соединений в трех экземплярах в колонках 2-23. Строк содержат 2x концентрация 3-кратные серийные разведения серии соединений в диапазоне от 100 мкм до 2 нм (B) флуоресценции карту интенсивности изображающие Tl ⁺ потока для каждой скважины approximatelУ 1 мин после Tl ⁺ дополнение. Псевдо-цветной полосе справа показывает степень Tl ⁺ поток, с более холодным и горячим цветов, представляющих низких и высоких значений потока, соответственно. Обратите внимание, что скважины в столбце 1 и строке A1-23 содержат неиндуцированных клеток. Остальные скважины содержат тетрациклин вызванной клетки, экспрессирующие Кир канал интерес (см. клеточной пластинки карту на рис 1С). (C) представитель Tl ^{+-индуцированной} изменений в FluoZin-2 флуоресценции в скважины предварительной обработке с указанной концентрацией ингибитора канала Кир. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Рисунок 5. Определение анализ пригодности для HTS. (A) Источник пластиныКарта используется для оценки обеспеченных и вариабельность скважин, содержащей 0,1% ДМСО (автомобиля) или максимально эффективной концентрации известный ингибитор. (B) флуоресценции карту интенсивности изображающие Tl ⁺ потока в каждую лунку приблизительно 1 мин после того Tl ^+. Отметим, что все колодцы содержат тетрациклин вызванной клетки, экспрессирующие Кир канал интерес (см. клеточной пластинки карту в рис. 1b). (C) представитель точечный график стационарного значения флуоресценции получены из транспортного средства или ингибиторы обработанных скважин. Среднее флуоресценции амплитуды каждой выборки населения обозначены сплошной линией, 3 стандартных отклонения от среднего показана пунктирной линией, и переменного образцов для автомобиля (ВХЛ) и ингибитора (INH) на графике в виде отдельных пунктов. Нажмите здесь, чтобы увеличить показатель .

Discussion

Обработка данных: После того как данные собраны, общий шаг анализа заключается в нормализации флуоресценции ответ каждого колодца, F, к своему исходному значению в начале эксперимента, F _0. Это обычно упоминается как "статическое отношение" и символизирует "F / F ^_0". В случаях, когда F ₀ доминируют индикатора краситель статического соотношение существенно исправить многие факторы, такие как disuniformities освещения, сигнал сбора, и сотовый номер. В случаях, когда краситель сигнал слабый или фоновой флуоресценции или отражения в системе высок, статический коэффициент не будет эффективной, если фон может быть соответствующим образом оформлены до расчета статических отношение. После нормализации данных, это характерно для уменьшения флуоресценции сигнала к одному значению, которое будет использоваться для количественной оценки активности и забрать хитов. Чаще всего это будет сделано путем подгонки данныхточек в 10 секунд после добавления Tl ⁺ для получения начального наклона вызвало увеличение флуоресценции. Для хитом сбор, популярный подход заключается в предположении, что подавляющее большинство соединений в тесте населения являются неактивными (нулевая гипотеза в силу). Среднее значение и стандартное отклонение рассчитывается для теста населения и хиты, которые выбраны три стандартных отклонения от среднего значения.

Разделение протокола долгое инкубации соединения: Для обнаружения Кир канала ингибиторов, в частности, действующий на внутриклеточные сайты связывания, это может быть ценным для инкубации клеток с тестируемых соединений в течение длительного периода времени (например, 20 мин) до добавления Tl ^+. Если соединения добавляют "офлайн" до анализа вводится в ридер, оптические свойства исследуемых соединений (например, флуоресценции) не может быть легко узнаваемым и может отрицательно повлиять на часто используемыенормализации данных подходов, таких как "статический коэффициент" F / F ₀ описанных выше в результате ложных срабатываний и / или ложных негативов. Чтобы избежать этой проблемы, одновременно избегая необходимости держать планшет для анализа на читателя в течение длительного инкубационного, одним из решений является использование "два чтения" протокол. Первое чтение представляет собой короткий (например, 30 секунд) эксперимент, в котором соединение добавляют в течение 10 секунд, чтобы захват предварительного соединения дополнение F ₀ и оценить соединений в оптические эффекты в системе. Пластины удаляется от читателя и инкубировали в течение требуемого периода и вернулись к читателю для того таллия. После того как прочтений завершены, сначала прочитайте F ₀ может быть использован для нормализации данных из второго чтения позволяет избежать многих проблем, связанных с добавлением соединений "офлайн", позволяя возможность держать читателя заняты сбором данных таким образом, улучшение скрининга. Эти два чтения подход является наиболее легко implemПодарить при использовании автоматизированной системы скрининга. Важно отметить, что два чтения подход не позволит устранить проблемы, вызванные флуоресцентные соединения, которые насыщают детектора и / или привести считывания артефактов в ПЗС-камеры.

Настройка анализа для активаторов: Не все каналы Kir которые максимально активированы в состоянии покоя, таким образом, это может быть возможным разработать тест, который может обнаружить малые молекулы активаторов. В этих случаях, при выборе EC ₈₀ концентрации Tl ⁺ не может обеспечить достаточный "запас" для анализа, чтобы надежно обнаружить возбудителей. Таким образом, можно выбрать для использования более низкой концентрации Tl ⁺ (например, ЕК ₂₀₎ в анализах активатор. В некоторых случаях анализ может показать достаточно низкой изменчивости, чтобы позволить использование EC ₅₀ концентрации Tl ⁺ и при этом обеспечить подходящее разрешение как активируется и ингибирует канала населения. В этом случае анализ м.ай проводиться в двойной активатор / ингибитор режиме. При наличии известных активаторов могут быть использованы, чтобы помочь определить соответствующие Tl ⁺ Концентрация чтобы максимально повысить шансы обнаружения канала активаторов.

Ограничения: Есть некоторые ограничения, которые следует учитывать при разработке и реализации Tl ⁺ на основе потока высокой пропускной способностью экрана. Например, анализ опирается на косвенные меры активности канала Кир помощью флуоресцентных зондов, оптические свойства которых могут быть непосредственно затронуты соединений в экран. Таким образом, важные наблюдения из Tl ⁺ поток экспериментов должно быть подтверждено с помощью напряжения зажим электрофизиологии, который считается «золотым стандартом» метод для фармакологии ионных каналов. Кроме того, малые молекулы могут иметь прямое воздействие на эндогенные Tl ⁺ путей потока выражается в НЕК-293 клеток, что приводит к выявлению ложно-положительных хитов. ТетрациклиномE-индуцибельной система особенно полезна для различения ложно-положительных хиты из Кира канала направлена ​​модуляторов, поскольку хитов могут быть быстро отображены в неиндуцированных клетки для воздействия на эндогенные путей. Наконец, низкой растворимости Tl ⁺ в хлорид-содержащих буферы ограничивать концентрацию Tl ^+, которые могут быть использованы в анализе, требует использования не-физиологических Tl ⁺ стимул буфер, который может увеличить фармакологии цель ^11. Совместимости различных буферов с целью проценты должны быть тщательно проанализированы во время анализа развития. Это может быть сделано путем создания контрольных сумм для известных модуляторов, используя различные буферы Tl ⁺ стимул и выборе условий, в которых фармакологии наиболее близко соответствует наблюдаемому с помощью физиологических буферах.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
pcDNA5/TO	Invitrogen	V1033-20	Tetracycline-inducible expression vector
T-REx-HEK293 cells	Invitrogen	R71007	Tetracycline-inducible cell line
Lipofectamine LTX/Plus Reagent	Invitrogen	15338100	Transfection reagent
FBS	ATLANTA Biologicals	S11550	Cell culture media
DMEM	Invitrogen	11965	Cell culture media
Hygromycin B	Invitrogen	10687-010	Cell culture media
Blasticidin S	Invitrogen	R210-01	Cell culture media
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140	Cell culture media
HBSS-divalent free	Mediatech	21022CV	Cell washing
Trypsin-0.25%	Mediatech	25053CI	Cell dissociation
Tetracycline-HCl	Sigma	T9823	Induction reagent
Dialyzed FBS	ATLANTA Biologicals	S12650	Plating media
FluoZin-2	Invitrogen	F24189	Fluorescent dye
Pluronic F-127	Invitrogen	P-3000MP	Dye loading
HBSS	Invitrogen	14175	Assay buffer
HEPES	Invitrogen	15630	Assay buffer
NaHCO3	Sigma	S6297	Tl+ stimulus buffer
MgSO4	Sigma	M2643	Tl+ stimulus buffer
CaSO4∙2H2O	Sigma	C3771	Tl+ stimulus buffer
D-Glucose	Sigma	G7528	Tl+ stimulus buffer
Thallium sulfate	Aldrich	204625	Tl+ stimulus buffer
HEPES	Sigma	H4034	Tl+ stimulus buffer
DMSO	Sigma	D4540	Solvent
Eight-channel electronic pipettor	Biohit	E300	Cell plating in 384-well plates
BD PureCoat amine-coated 384-well plates	BD Biosciences	356719	Assay microplates
Echo qualified 384-Well polypropylene microplate (384PP)	Labcyte	P-05525	Compound source microplates
384-well polypropylene microplates	Greiner Bio-One	781280
Multidrop Combi reagent dispenser	Thermo Scientific	5840300
ELx405 microplate washer	BioTek	ELx405HT	Automated cell washing
Echo liquid handler	Labcyte	Labcyte Echo 550
Bravo automated liquid handling platform	Agilent Technologies	Standard model
Hamamatsu FDSS 6000	Hamamatsu		Kinetic imaging plate reader
Table 1. List of Materials and Reagents.