Изображениями кальция Ответы на GFP с метками нейроны гипоталамуса фрагменты мозга мыши

Summary

В этом протоколе, мы обновляем последние достижения в области обработки изображений Ca

Protocol

1. Приготовление раствора и в агарозном геле

1. Подготовка внеклеточной решение в соответствии с таблицей с двойным дистиллированной воды. РН будет ~ 7,3 через 10 мин аэрации с карбогена (95% O _2/5% CO _2), осмолярность 300 мосм ^8. Если выше осмолярность не требуется, его можно регулировать, добавляя больше глюкозы (1 мМ равна 1 мосм). Раствор фильтруют дважды, используя 0,2 мкм мембранный фильтр для устранения пыли и возможного бактериального загрязнения.

Название реагента	Сокращение	Мол. вес	Конц.	Компания	Кат. N °
Хлористый натрий	NaCl	58,44 г / моль	120 мМ	VWR	27810
Натрия гидрокарбонат </ TD>	NaHCO 3	84,01 г / моль	25 мМ	Merck	106329
Хлористый калий	KCl	74,55 г / моль	5 мМ	Merck	104936
BES *	C 6 H 15 NO 5 S	213,25 г / моль	5 мМ	Сигма	14853
Сульфат магния, безводный	MgSO 4	120,37 г / моль	1 мМ	Сигма	M7506
Дигидрата хлорида кальция	CaCl * 2H 2 O	147,02 г / моль	1 мМ	Merck	102382
D (+)-Глюкоза моногидрат	C 6 H 12 O 8 * H 2 O	198,17 г / моль	10 мМ	Merck	108342

*N, N-бис (2-гидроксиэтил)-2-aminoethansulfonic кислоты

2. Раствор хранят при 4 ° C, но должна быть газированной с карбогена (95% O _2/5% CO ₂₎ в течение 10 минут перед использованием.
3. В это время подготовить и 1 см ³ блоков агар гель для стабилизации мозга во время резки процедуры (см. шаг 3). Во-первых, растворить 4% (вес / объем) агар (Sigma) в дважды дистиллированной воде при нагревании раствора примерно до 60 ° C. Нагретая агара растворяют раствор выливают в чашку Петри площадь на высоте 1 см. После охлаждения и затвердевания, 4% геле агара разрезают на блоки 1 см ^3. Эти блоки могут быть сохранены в течение 4 недель при температуре 4 ° C.

2. Препарирование мозга мыши

Пожалуйста, убедитесь, что все животные экспериментальные процедуры выполняются в соответствии с руководящими принципами, установленными животных комитетов соответствующих учреждений.

1. Перед SACRificing животное, убедитесь, что блоки гель агара готовы к использованию.
2. Anesthetize мыши с изофлурана (1-4% изофлурана в кислороде, используя точность испарителя в течение примерно 1 мин). Это важно для предотвращения гипоксии и, следовательно, повреждению нейронов. Недостатком изофлуран стоимость и материально-технического обеспечения с использованием высокоточных испарители. Смертельной передозировки в открытой системе может быть альтернативой, так как мыши будут принесены в жертву. Охрана труда и безопасность в этом случае вызывает серьезную озабоченность. Изофлурана должны быть непосредственно вентилироваться из комнаты. Таким образом, передозировка в открытой системе должна быть выполнена в химическом вытяжном шкафу.
3. Усыпить мыши путем обезглавливания после мониторинга глубины анестезии при тестировании рефлекса задних ног. Этот рефлекс педали или лапу щепотку осуществляется крепко зажимая лапы или ноги между пальцами, чтобы вызвать вывода ответа животного. Животное, которое показывает рефлекс не на уровне хирургической анестезии и определенно не всостоянии усыпить.
4. После обезглавливания, разрезать кожу головы с одним лезвием края централизованно в сагиттальном направлении, от лобной кости к внешним затылочного бугра. Переместите две части кожи головы, первый из медиальной хвостового конца в ростральной поперечном направлении, затем вниз в направлении вентральной (рис. 1А-C).
5. Сделайте две боковые и одна ростральной сокращение затылочного отверстия с небольшим ножницами весной (см. для резки направлении черной пунктирными стрелками на рис 1С). Осторожно расщеплять от черепа из mediocaudal к боковым ростральной с тупым пинцетом (см. широкие серые стрелки на рисунке 1С). В старых животных небольшой разрез на сагиттального шва является полезным и часто необходимо, чтобы избежать повреждения слоев коры головного мозга.
6. В этот момент затылочной, interparietal и теменных костей должна быть отсоединена. Если еще присутствует, твердой мозговой оболочки должна быть тщательно удалены с помощью щипцов, чтобы предотвратить повреждение брайн в следующем шаге.
7. Уберите чешуйчатой ​​кости, передней решетчатой ​​и лобной отверстия (рис. 1D).
8. Мозг теперь могут быть легко удалены с помощью перевернутого микро-шпатель ложку и отделяя черепных нервов (рис. 1E).

3. Нарезка Корональные гипоталамуса разделы мозга мыши

1. Поместите мозга на его вентральной стороне на порезостойкие поверхности и удаления мозжечка с одним лезвием бритвы края (рис. 2A). Это прямая поверхность разреза будет основой для монтажа головного мозга на тарелку чтобы нарезка корональных разделов мозга.
2. Клей мозга с разрезом раздел на плите из микротома (Zeiss, Hyrax V50) с использованием малых количеств быстрого отверждения высокой производительности цианакрилатный клей суперклей (Loctite 406; рис. 1А). Кроме того, клей 1 см ³ геле агара блока (см. п. 1.5) на вентральной стороне мозга (см. 'V' в (рис. 2В).
3. Через несколько секунд связь высохнет, положите пластину в ванну вашей микротома заполнен 6 ° C холодным кислородом (95% O _2/5% CO ₂₎ внеклеточной решение (см. 1.1).
4. Используйте соответствующие низкой скорости нарезки и нарезать толщиной 300 мкм ломтиками. В случае, если наши микротома, мы используем частотой 60 Гц, амплитудой 0,8 мм и скоростью 0,8 мм / с (рис. 2). Корональной кусочков мозга, либо собранные непосредственно после каждого пореза или можно оставить в ванной, пока весь мозг был разрез. Корональной кусочков мозга тщательно transferred в стакан с холодным кислородом внеклеточной решение. Различные инструменты были разработаны, чтобы выполнить передачу (например, сокращение широкой пластиковой или стеклянной пипетки Пастера или широкий шпатель ложка). Это зависит от экспериментатора который является предпочтительным. Самое главное, что кусочки должны быть обработаны соответствующим образом минимизировать ущерб.
5. Если микротома может быть запрограммирована на автоматическое нарезать кусочками, можно начинать готовить Ca ^{2 +} индикатор загрузки красителя решение на данный момент. В противном случае, рекомендуется, что подготовка этого решения выполняется до мозга нарезки закончился свести к минимуму задержки для измерения Ca ^{2 +} ответы в нейронах, а именно перед началом шага 2.

4. Подготовка Ca ^{2 +} раствора индикатора загрузки краска

Важным шагом в загрузке нейронов остается часто на здоровье клеток, которые зависят от количества повреждений, вызванных и скоростьвскрытие процедуры. Другим важным шагом представляется использование свежих Pluronic F-127 решения (см. 4.1). Она в настоящее время рекомендуется делать это решение в лаборатории, а не использовать готовые решения от поставщика. В зависимости от температуры, влажности и шельфа жизни Pluronic F-127 решение, мы отметили ухудшение обоняния и нейронов головного мозга во время Ca ^{2 +} процедура загрузки.

1. Подготовьте 20% (вес / объем) Pluronic F-127 (Sigma) в диметилсульфоксид (ДМСО), добавив Pluronic F-127 порошок на верхней части растворе ДМСО. Непосредственно разрушать ультразвуком это решение без предварительной вихрь или перемешивания. В течение 2 мин ультразвуком Pluronic F-127 будет распущен. 100 мкл Pluronic F-127 растворы готовят свежую раз в неделю.
2. Принимать по одной трубе 50 мкг клеточной проницаемой fura-red/AM (Invitrogen; AM, ацетоксиметил эфир) и добавить 5 мкл 20% Pluronic F-127 решение. Смешайте решение с помощью кончика пипетки.
3. Добавить 45 мкл внеклеточной solutiна (см. п. 1.1) в смесь и вихревые это в ближайшее время.
4. Добавить еще 325 мкл внеклеточный раствор и разрушать ультразвуком трубку в течение 3 мин.
5. После обработки ультразвуком добавить 1,156 мл кислородом (95% O _2/5% CO ₂₎ внеклеточной решение, чтобы получить окончательное Ca ^{2 +} индикатор загрузки красителя решения (30 мкМ fura-red/AM, 0,33% ДМСО и 0,065% Pluronic F-127) . Храните трубу в темное место до использования (см. 4.8).
6. Передача короны кусочки мозга 6-а культура клеток пластины (BD Falcon), заполненный кислородом (95% O _2/5% CO ₂₎ внеклеточный раствор (до шести ломтиков на лунку).
7. Отсасывать кислородом внеклеточный раствор из палат 6-луночный планшет, стараясь не повредить мозг ломтиками.
8. Внесите 750 мкл непосредственно Са ^{2 +} индикатор загрузки красителя решение в каждую лунку. Срезах мозга должны быть покрыты раствором, содержащим fura-red/AM (погружение нагрузки).
9. Incubatе ломтики в O ₂ / CO ₂ инкубаторе культуры клеток (O _2: 23,5%; CO _2: 5%), от 45 до 60 мин при 37 ° C.
10. В конце инкубационного периода, заменить Ca ^{2 +} индикатор загрузки красителя решение по свежим кислородом внеклеточной решение, чтобы предотвратить перегрузку клеток с фура-красный и влияния в тонкий способ Ca ^{2 +} измерения с помощью действий хелатирующие на красителе. Ломтиками, затем держат в O ₂ / CO _{2-инкубаторе} (см. предыдущий пункт для настройки) до использования и являются жизнеспособными в течение 3-6 часов.

5. Микроскопии и анализа

В этом протоколе, интенсивность флуоресценции GFP, который определяет ячейку интерес, и Са ^{2 +} индикатор краситель будет измеряться одновременно в срезах мозга. Таким образом, конфокальной микроскопии должны быть оборудованы правильный лазер, фильтры и две трубки фотоумножителя собрать два emissiна сигналы. GFP и изменение интенсивности флуоресценции фура-красный может быть измерена с помощью одной длине волны возбуждения 488 нм. Выбросы флуоресценции от флуорофоров могут собираться с помощью 522/DF35 нм фильтр для GFP и длинный фильтр для длин волн больше 600 нм для фура-красный.

1. Чтобы начать мониторинг стимул-индуцированные изменения в сигнал флуоресценции, которые являются мерой внутриклеточные концентрации Са ^{2 +,} одна из фура-красный загруженных кусочки мозга передается в записи камеры (т.е. Warner Instruments RC-27 с открытой камерой Bath) , который может быть установлен на конфокальной микроскопии установки (рис. 3а, б).
2. Закрепить среза мозга с арфой (рис. 3), чтобы предотвратить срез двигаться из-за перфузии скорость ванну решение (окисленные внеклеточной решение; см. п. 1.1). Арфа (часть держателя) изготовлен из массива параллельных нейлоновых нитей (отделены друг от друга на ~ 1 мм), нанизанные насеребро U форме или платины кадра. Температура воды в ванне решение на этот шаг должен быть по крайней мере комнатной температуре. Если требуются более высокие температуры, соответствующее внимание должно быть принято, чтобы предотвратить образование конденсата на линзах микроскопа и движения плоскости фокуса из-за смещения деталей в микроскоп.
3. Заливать срез в течение 10 мин с кислородом внеклеточный раствор для удаления излишков внеклеточной Ca ^{2 +} краситель индикатор. Расход перфузии должны быть скорректированы до ~ 100 мкл / с (советы относительно соответствующей системы перфузии см. ^9).
4. Посмотрите на срез под микроскопом при малом увеличении, обратите внимание на ориентацию среза для ваших записей и найти интересующую вас область в срезе, в нашем случае гипоталамической области головного мозга.
5. Изменения к большим увеличением и найти ячейку интерес в срезе по сбору GFP изображений и одновременно проверяя интенсивность флуоресценции фура-красныйсигнал (рис. 4A-C). Клетки вблизи поверхности могут быть повреждены или мертвым. Таким образом, клетки, расположенные на глубине более 10 мкм должна быть выбрана для работы с изображениями. Мы могли бы надежно измерить клетки до глубины 40-50 мкм, после чего мощность сигнала начал падать. Помните, что фура-красный сигнал клеток в состоянии покоя с низкой концентрации Са ^{2 +} имеют относительно высокой интенсивности флуоресценции. Такая высокая интенсивность флуоресценции в данном случае не является признаком мертвых клеток. Сигнал GFP может быть использован для обнаружения дрейфа или движение ткани ломтик или в качестве индикатора для изменения внутриклеточного рН ^10.
6. Регулировка мощности лазера до значения, что позволяет проводить измерения в изменении фура-красной флуоресценции и предотвращает обесцвечивание двух флуорофоров. Таким образом, начать с самой низкой мощности лазера и настроить для получения достаточной сигнал-шум за счет изменения уровня черного (смещение), детектор диафрагмы, усиления и лазерной фильтр нейтральной плотностис. Кроме мощность лазера, то же самое должно быть сделано для сигнала GFP.
7. Начать получать изображения со скоростью от 0,5 - 2 Гц для сбора фура-красный и GFP сигналов. Приобретение ставка должна быть оптимизирована с ожидаемой скоростью Ca ^{2 +} сигнал. Потенциал-зависимых Са ^{2 +} шипами может привести к быстрым и коротким переходным, чем активация некоторых каскадов передачи сигнала требует активации различных вторичных мессенджеров. Длина захвата изображения должны соответствовать цели эксперимента. GFP сигнала во времени поможет определить, есть ли движение среза мозга не произошло.
8. Во время приобретения и эксперимент, все настройки сканирования головы должны быть постоянными для записи надежных результатов, которые могут быть сопоставлены.
9. Изменения в флуоресценции с течением времени могут быть проанализированы с помощью различных математических программ, т.е. ImageJ (NIH, Bethesda, MD; HTTP:/ / Rsb.info.nih.gov / ц /), Игорь Pro (Wavemetrics) или MatLab (MathWorks). По окружающих somata из GFP с метками нейрона с указанием область интереса (ROI), это точно такой же регионе могут быть проанализированы изменения в Ca ^{2 +} использование фура-красного флуоресцентного сигнала с течением времени.

Ca ^{2 +} сигналы могут быть представлены в виде произвольных единицах флуоресценции или значения (f / F) относительного изменения интенсивности флуоресценции (ΔF), нормированная к базовому флуоресценции (F). Эта процедура приводит к отрицательным отклонением, когда внутриклеточные концентрации Са ^{2 +} увеличивает использование фура-красные, как Ca ^{2 +} краситель индикатор. Чтобы облегчить интерпретацию результатов, мы рекомендуем умножения f / F значений от -1 до получения положительных сигналов флуоресценции для отображения рост Ca ^{2 +} (рис. 4в).

Для сравнения результатов между нейронами амплитуды и частоты Ca 2 + сигналы не происходят с регулярной период или сопоставимой амплитуды. Некоторые сигналы могут быть под сильным влиянием случайных процессов внутри клетки. Таким образом, для количественной оценки общего изменения Ca ^{2 +} в данной клетке и дать возможность сравнения Ca ^{2 +} ответы между нейронами в различных регионах мозга, анализ площади под кривой (AUC) является более целесообразным. Эта мера на сумму Ca ^{2 +} включает в себя любые начальные Ca ^{2 +} преходящее, второй фаз и устойчивый повышенный Ca ^{2 +} ответы и колебания. В этом случае следует позаботиться, чтобы проанализировать тот же период времени для того, чтобы сравнение между нейронами.

6. Представитель Результаты

Для начала характеризующих гонадотропин-рилизинг-гормон-рецептор (GnRHR), выражающая нейронов в гипоталамусе мы использовали трансгенных мышей, экспрессирующих GFP после Cre-опосредованной возбужденияния в GnRHR-экспрессирующих нейронов ^4,11. GFP флуоресцентные нейроны были обнаружены в различных областях мозга, включая гипоталамус. Для изучения физиологических свойств этих GnRHR нейронов, мы сначала записали Ca ^{2 +} сигналы в гипоталамус ломтики помощью конфокальной микроскопии. Во-первых, мы получили корональной кусочков мозга от этих мышей с использованием описанного выше протокола. Рисунке 1 показаны необходимые инструменты, материалы и шаги для вырезания мозга мыши. Корональных гипоталамус ломтики мозга были сокращены (рис. 2), а затем загружаются в соответствии с шагами в пункте 4 протокола. Одноместный срез мозга соответствующей области помещаются в записи камеры, крепится с арфой (рис. 3), а затем отображаемого помощью конфокальной микроскопии (см. шаги 5.1-5.9). Рисунок 4 показывает пример двух отдельных корональных ломтики мозга установления единых GnRHR-τGFP клеточных тел, флуоресценции на отдых после Loadinг среза мозга с fura-red/AM и объединенный конфокальной изображения о том, что GFP нейрона заняли фура-красные достаточно включить исследование стимул-индуцированной Ca ^{2 +} сигналов в этих клетках. Используя наши протокола мы изначально проверяли, действительно ли GnRHR нейроны используют похожие Ca ^{2 +} сигналов для обнаружения стимула в различных областях гипоталамуса в ответ на прямой активации с ГнРГ (рис. 4E). Тем не менее, эти сигналы отличаются по своим сигнала в зависимости от силы раздражителя и ⁴ области мозга. Для количественной оценки изменений в динамике Ca ^{2 +} ответы, площади под кривой (AUC) может быть рассчитана как мера для увеличения внутриклеточного Ca ^{2 +} (рис. 4E) ^4. Исследования осуществляются в настоящее время для исследования молекулярной основы, лежащие в основе Ca ^{2 +} волн и колебаний, их зависимости от пола и гормонального статуса животных, и могут ли они быть модулированнымдругие природные раздражители.

Рисунок 1. Инструменты, материалы и шаги для вырезания мозга мыши. A. Инструменты и материалы, используемые для рассечения мозга: 1, Loctite 406 клей, 2, микро шпателем ложки, 3, одно лезвие края, 4, малый и средний ножницы весной, 5, тупой пинцет, 6, ножницы, 7, чашки Петри, содержащей агар Гель блоков, 8, базовая пластина для монтажа мозга в микротоме. BF. Изображения некоторые шаги, описанные в пункте 2 протокола. B. Фотография мышь головы с указанием позиции резки волосистой части головы (красная линия) и стрелки (оранжевый), указывающий направление кожу следует оторвалась от кости (см. п. 2.4). С фотографией мыши головой после кожи оторвался показывает костных структур (см. п. 2.4). Резка направление ножниц и направление за нарушение открытой череп с тупой пинцет указывается либо с чернымпунктирными стрелками или серые широкие стрелки, соответственно. D. Фотография мозга мышей после устранения различных костных структур (см. шаг 2,5 - 2,7). Е. Фотография вынос мозга по-прежнему подключен к черепу через черепных нервов. F. Фотография относительно неповрежденный мозг мыши.

Рисунок 2. Нарезка из корональных участков гипоталамуса головного мозга мыши. A. Сфотографируйте, указывающие положение одним лезвием бритвы края для устранения мозжечка (см. п. 3.1). В. Позиция гель агара блока по отношению к мозгу наклеиваются на плиту из микротома (см. п. 3.2). C. резки корональных срез головного мозга (отметим здесь расположение головного мозга и гель блок должности в связи с лезвием из микротома, см. шаг 3.4.). г спины, V, вентральный.

Рисунок 4. Ca ^{2 +} сигналов в τGFP нейронов гипоталамуса мыши кусочки мозга. Нашей эры. Определение GFP нейрона и одновременное приобретение фура-красной флуоресценции в корональных ломтики мозга мыши. А. конфокальной изображения корональных срез мозга выявления GnRHR-τGFP нейроны (зеленый). B. Относительно равномерное флуоресцентного сигнала (красный) области мозга показаны на наблюдалась после загрузки среза мозга с fura-red/AM. C. Объединенные изображение, показывающее нейтроновадроны изображенные на загружается с Ca ^{2 +} индикатор красителя (желтоватый). Границы GFP нейрона somata указаны в пунктирные белые линии, в то время как примеры двух не-GFP somata (стрелки) указаны в серых линий. D. Пример GFP и не-GFP нейронов с более высоким количеством красной флуоресценции по сравнению с фоном. E. Примеры соматических стимул-индуцированной Ca ^{2 +} ответы от отдельных GFP с метками нейронов в различных областях мозга гипоталамус (Pe, перивентрикулярной ядра, DM, дорсомедиального гипоталамуса; Arc, дугообразные ядра). Площади под кривой (AUC) изображается красной зоне. Различных Ca ^{2 +} сигналов между GnRHR-экспрессирующих нейронов из различных ядрах гипоталамуса могут быть сравнены с использованием AUC, как оценка общего изменения Ca ^{2 +} в данной клетке за тот же период. F. схемы и диаграммы с указанием расположения GFP с метками нейронов проанализированы в AE Верхняя панель: Местоположение. Корональной мозга сперегиба содержащие гипоталамической областях мозга (красная линия) средние и нижние панели. Схематическое изображение среза мозга (в центре) и увеличения его красной коробке область (нижняя панель) с указанием красными точками примерное положение записанных GFP с метками нейронов Пе, DM и Триумфальной показан на E; черная область в нижней панели схеме: ^3-го желудочка. Нижние две диаграммы взяты из Paxinos и Франклин ^12. Нижний левый угол число указывает расстояние (мм) от брегмы.

Discussion

Главный вопрос в неврологии, чтобы понять, как мозг обрабатывает социальную информацию. Основным источником информации, необходимой для социального признания кодируется обонятельный или феромонов сигналов. Обнаружение этих сигналов популяций нейронов в носу и признание сигналы в мозге, особенно в гипоталамусе, играют ключевую роль во многих социальных процессах и влиянии гормонов и других нейроэндокринных факторов ^13-16. Существенным препятствием анализа ответов нейронов в областях мозга, как гипоталамус содержащие многофункциональный ядер с несколькими нейронами является выявление специфических нейронов интерес.

Многие трансгенные линии мышей были разработаны, в которых главным образом GFP помогает определить нейронов. К сожалению, флуоресцентные свойства GFP усложняет измерения с помощью Ca ^{2 +} индикатор красители, такие как Fluo-3 и флуо-4 ^17. Поэтому мы начали исследоватьВорота GFP с метками нейронов использованием красное смещение Ca ^{2 +} индикатор красителя, как фура-красный ^3,4. Фура-красной основе Ca ^{2 +} визуализации ранее в сочетании с GFP с метками панкреатических β-клеток и GFP с метками рецепторы экспрессируются в клетках НЕК ^5,6. Как и фура-2, некоторые перекрестные помехи между фура-красный и GFP было сообщено ^2. Тем не менее, с использованием высоких наборов выбросов качества фильтра с конкретной полосы пропускания и двухцветные фильтры светоделитель может ограничить помехи / проступание между красителями до некоторой степени. Целесообразно, чтобы подтвердить настройки конфокальной микроскопии путем измерения обоих каналов (зеленый и красный флуоресценции) в то же время используя (1) ломтики мозга с GFP с метками нейронов, но не загружается с Ca ^{2 +} индикатор красителей, а также в (2) срезах мозга без GFP с метками нейронов, но загружается с красным смещением Ca ^{2 +} индикатор. Используя те же настройки на конфокальной микроскопии как с обычным эксперимента, следователь может заметить, еслиУ флуоресценции обнаружены в разных каналов, которые следует избегать.

Некоторые исследователи используют Род-2 или рекомендуют использовать X-rhod1 в качестве альтернативы красное смещение красителей в сочетании с GFP с метками клеток ^2,18,19. Тем не менее, Род AM красители, кажется, имеют тенденцию концентрироваться в митохондриях ²⁰ и во многих нейронах низкая эффективность маркировки ^17. В связи с необходимостью улучшения красное смещение Ca ^{2 +-показатели,} исследователи и компании в настоящее время разрабатывают новые зонды, мы надеемся, превосходную производительность ^21.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Sigma	A1296
Fura-red/AM	Invitrogen	F-3021
Pluronic F-127	Sigma	P2443
Dimethyl sulfoxide	Fisher Scientific	BP231
Vibrating-Blade Microtome Hyrax V 50	Zeiss	9770170
Cooling Device CU 65 for Microtome Hyrax V 50	Zeiss	9920120
O2/CO2 Incubator, CB210-UL	Binder	0019389
Super glue, Loctite 406TM	Henckel	142580
Double spatulas, spoon shape	Bochem	3182
Microspoon spatulas, spoon shape	Bochem	3344
Spring Scissors, Moria-Vannas-Wolff - 7mm Blades	Fine Science Tools	15370-52
Spring Scissors, Vannas - 3mm Blades	Fine Science Tools	15000-00
Wagner Scissors	Fine Science Tools	14071-12
Medical Forceps, Dumont 7b	Fine Science Tools	11270-20
Large Rectangular Open Bath Chamber (RC-27)	Warner Instruments	64-0238
Confocal Microscope BioRad Radiance 2100	Zeiss	n.a.