Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

इमेजिंग Hypothalamic माउस मस्तिष्क स्लाइस की GFP टैग न्यूरॉन्स में कैल्शियम प्रतिक्रियाएँ

Published: August 24, 2012 doi: 10.3791/4213

ERRATUM NOTICE

Summary

इस प्रोटोकॉल में, हम इमेजिंग Ca में हाल की प्रगति को अद्यतन

Protocol

1. समाधान और agarose जेल की तैयारी

  1. दोहरा आसुत जल के साथ तालिका के अनुसार कोशिकी समाधान तैयार. पीएच ~ 7.3 (95% 2 हे / 5% सीओ 2) carbogen, 300 osmolarity mOsm 8 के साथ 10 मिनट वातन के बाद हो जाएगा. यदि एक उच्च osmolarity आवश्यक है, यह अधिक ग्लूकोज (1 मिमी 1 mOsm बराबर होती है) को जोड़ने के द्वारा समायोजित किया जा सकता है. समाधान दो बार फ़िल्टर्ड है एक 0.2 सुक्ष्ममापी झिल्ली फिल्टर का उपयोग करने के लिए धूल कणों और संभव बैक्टीरिया contaminations को खत्म करने के लिए.
अभिकर्मक के नाम संक्षिप्तीकरण Mol. वज़न सान्द्र. कंपनी बिल्ली. N °
सोडियम क्लोराइड NaCl 58.44 छ / mol 120 मिमी VWR 27810
सोडियम हाइड्रोजन कार्बोनेट </ P> 3 NaHCO 84.01 छ / mol 25 मिमी मर्क 106329
पोटेशियम क्लोराइड KCl 74.55 छ / mol 5 मिमी मर्क 104936
BES * सी 6 15 5 एस एच 213.25 छ / mol 5 मिमी सिग्मा 14853
मैग्नीशियम सल्फेट, निर्जल 4 MgSO 120.37 छ / mol 1 मिमी सिग्मा M7506
कैल्शियम क्लोराइड dihydrate CACL * 2H 2 हे 147.02 छ / mol 1 मिमी मर्क 102382
डी monohydrate (+) ग्लूकोज सी 6 एच 12 8 हे * एच 2 हे 198.17 छ / mol 10 मिमी मर्क 108342

*N, N-बीआईएस (2-hydroxyethyl) 2 aminoethansulfonic एसिड

  1. समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है, लेकिन उपयोग करने से पहले 10 मिनट के लिए वातित carbogen (95% हे 2/5% सीओ 2) के साथ किया जाना चाहिए.
  2. इस समय भी 1 सेमी अगर जेल के 3 ब्लॉक तैयार करने के लिए काटने की प्रक्रिया के दौरान मस्तिष्क को स्थिर (3 कदम देखें). सबसे पहले, दोहरा आसुत जल में लगभग 60 से समाधान हीटिंग डिग्री सेल्सियस से 4% (w / v) अगर (सिग्मा) भंग गर्म भंग अगर समाधान 1 सेमी की ऊंचाई के लिए एक वर्ग पेट्री डिश में डाल दिया है. ठंडा और सख्त बाद, 4% अगर जेल 1 3 सेमी के ब्लॉक में कटौती की है. इन ब्लॉकों के लिए भंडारित किया जा सकता है 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 हफ्तों के लिए

2. माउस मस्तिष्क के विच्छेदन

कृपया सुनिश्चित करें कि सभी पशु प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं संबंधित संस्थानों के पशु कल्याण समितियों द्वारा की स्थापना की दिशा निर्देशों के अनुसार में प्रदर्शन कर रहे हैं.

  1. SACR से पहलेपशु ificing, यकीन है कि अगर जेल ब्लॉक के उपयोग के लिए तैयार कर रहे हैं.
  2. Isoflurane (1-4 लगभग 1 मिनट के लिए एक सटीक vaporizer का उपयोग ऑक्सीजन में isoflurane%) के साथ माउस anesthetize. यह hypoxia और इसलिए neuronal नुकसान को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है. Isoflurane के नुकसान और परिशुद्धता vaporizers का उपयोग करने की लागत रसद है. एक खुली प्रणाली में एक घातक अधिमात्रा एक विकल्प हो सकता है, के बाद से माउस बलिदान किया जाएगा सकता है. व्यावसायिक सुरक्षा इस मामले में एक गंभीर चिंता का विषय है. isoflurane सीधे कमरे के निकाल बाहर किया जाना चाहिए. इसलिए, एक खुली प्रणाली में एक ज्यादा एक रासायनिक धूआं हुड में किया जाना चाहिए.
  3. कत्ल के पीछे पैर पलटा परीक्षण करके संज्ञाहरण की गहराई की निगरानी के बाद माउस euthanize. इस पेडल या पंजा चुटकी पलटा दृढ़ता से एक या एक जानवर द्वारा एक वापसी प्रतिक्रिया बटोर उंगलियों के बीच पंजा पैर की अंगुली pinching द्वारा किया जाता है. एक जानवर है कि एक पलटा से पता चलता है संज्ञाहरण के एक शल्य स्तर पर नहीं है और निश्चित रूप में नहींराज्य euthanize.
  4. कत्ल के बाद, एक एकल बढ़त razorblade के साथ खोपड़ी केन्द्र ललाट की हड्डी से बाहरी पश्चकपाल उभार बाण के समान दिशा में कटौती करने के लिए,. खोपड़ी के दो भागों में ले जाएं, 1 व्याख्यान चबूतरे वाला पार्श्व दिशा में औसत दर्जे का दुम का अंत से, तो उदर दिशा में नीचे (चित्रा 1A-C).
  5. दो पार्श्व और एक छोटे वसंत कैंची (चित्रा 1C में दिशा काले धराशायी तीर काटने के लिए देखें) के साथ एक रंध्र मैग्नम में व्याख्यान चबूतरे वाला कटौती. ध्यान से कुंद संदंश (चित्रा 1C में व्यापक ग्रे तीर देखें) के साथ पार्श्व व्याख्यान चबूतरे वाला mediocaudal से कपाल बंद फोड़ना. बड़े जानवरों में बाण के समान सीवन में एक छोटे से कट उपयोगी और अक्सर आवश्यक है मस्तिष्क के हानिकारक cortical परतों से बचने.
  6. इस समय पश्चकपाल खोपड़ी की बांय और दांयी हड्डियों के बीच का है, और पार्श्विका हड्डियों को अलग किया जाना चाहिए. यदि अभी भी मौजूद है, ड्यूरा मैटर ध्यान संदंश का उपयोग करने के लिए br नुकसान को रोकने के हटाया जाना चाहिएअगले कदम में ऐन.
  7. दूर squamosal हड्डी, पूर्वकाल ethmoidal और ललाट रंध्र (चित्रा 1D) ले लो.
  8. मस्तिष्क अब आसानी से एक औंधा सूक्ष्म चम्मच रंग का उपयोग कर और कपाल नसों (चित्रा 1E) विच्छेद हटाया जा सकता है.

3. माउस मस्तिष्क के कोरोनल Hypothalamic धारा स्लाइसिंग

  1. अपने उदर पक्ष पर एक कट प्रतिरोधी सतह पर मस्तिष्क और जगह एक एकल बढ़त रेजर ब्लेड (2 चित्रा) के साथ सेरिबैलम हटा. यह सीधे कट सतह एक राज्याभिषेक मस्तिष्क वर्गों के टुकड़ा करने की क्रिया को सक्षम प्लेट पर बढ़ते मस्तिष्क के लिए आधार होगा.
  2. सूक्ष्म की baseplate पर कटौती खंड (Zeiss, V50 Hyrax) एक तेजी इलाज के उच्च प्रदर्शन cyanoacrylate चिपकने वाला superglue (चित्रा 1A लॉकटाइट 406) की कम मात्रा का उपयोग के साथ मस्तिष्क गोंद. इसके अलावा, एक 1 सेमी मस्तिष्क के उदर पक्ष पर 3 अगर जेल (1.5 देखें) ब्लॉक (देखें में 'वी' गोंद (चित्रा 2B) से ब्लेड को काटने के विपरीत पक्ष पर स्थित हो जाएगा.
  3. कुछ सेकंड बाद बांड सूख गया है, अपने सूक्ष्म तक्षणी के स्नान के साथ भरा में थाली डाल 6 ° C ठंड (95% हे / 5 2% सीओ 2) oxygenated कोशिकी समाधान (1.1 देखें).
  4. उपयुक्त कम वेग टुकड़ा करने की क्रिया का प्रयोग करें और 300 सुक्ष्ममापी मोटी स्लाइस में कटौती. हमारे सूक्ष्म तक्षणी के मामले में, हम 60 हर्ट्ज, 0.8 मिमी की एक आयाम और 0.8 मिमी / (चित्रा 2C) के वेग के एक आवृत्ति का उपयोग करें. राज्याभिषेक मस्तिष्क स्लाइस या तो प्रत्येक में कटौती के बाद सीधे एकत्र या स्नान में छोड़ा जा सकता है जब तक पूरे मस्तिष्क sectioned किया गया है. राज्याभिषेक मस्तिष्क स्लाइसें transfe सावधानी से कर रहे हैंठंड oxygenated कोशिकी समाधान के साथ एक बीकर rred. विभिन्न उपकरणों के हस्तांतरण (जैसे कटौती व्यापक प्लास्टिक या कांच पाश्चर pipettes या व्यापक चम्मच spatulas) करने के लिए डिजाइन किया गया है. यह experimentator जो पसंद किया जा रहा है पर निर्भर करता है. सबसे महत्वपूर्ण बात, स्लाइस को उचित प्रकार से हैंडल किया जाना चाहिए करने के लिए क्षति को कम से कम करने के लिए.
  5. यदि सूक्ष्म स्लाइस स्वतः में कटौती के लिए प्रोग्राम किया जा सकता है, आप इस पल में Ca 2 + सूचक डाई लोड समाधान तैयार करने के लिए शुरू कर सकते हैं. अन्यथा, यह सिफारिश की है कि इस समाधान की तैयारी से पहले टुकड़ा करने की क्रिया मस्तिष्क न्यूरॉन्स में Ca 2 + प्रतिक्रियाओं को मापने, अर्थात् चरण 2 शुरू करने से पहले के लिए देरी को कम करने के लिए समाप्त हो गया है के लिए किया जाता है.

4. Ca 2 + संकेतक डाई लोड हो रहा है समाधान की तैयारी

लोड हो रहा है न्यूरॉन्स में एक महत्वपूर्ण कदम अक्सर है जो कोशिकाओं द्वारा प्रेरित क्षति की राशि पर निर्भर करता है और स्वास्थ्य की गति बनी हुई हैविच्छेदन की प्रक्रिया. एक अन्य आवश्यक कदम F-127 (4.1 देखें) समाधान ताजा Pluronic का उपयोग किया जा रहा है. यह करने के लिए प्रयोगशाला में इस समाधान बनाने के लिए और एक विक्रेता से एक premade समाधान का उपयोग नहीं किया जा रहा है की सिफारिश की है. तापमान, नमी और F-127 Pluronic समाधान की शेल्फ जीवनकाल पर निर्भर करता है, हम Ca 2 loading + प्रक्रिया के दौरान घ्राण और मस्तिष्क न्यूरॉन्स की गिरावट का उल्लेख किया.

  1. DMSO समाधान के शीर्ष पर F-127 पाउडर Pluronic जोड़कर डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) में 20% (w / v) F-127 Pluronic (सिग्मा) तैयार करो. सीधे पूर्व भंवर या मिश्रण के बिना इस समाधान sonicate. 2 मिनट sonication Pluronic F-127 के भीतर भंग कर दिया जाएगा. 100 μl Pluronic समाधान F-127 ताजा साप्ताहिक तैयार कर रहे हैं.
  2. 50 ग्राम सेल पारगम्य fura-red/AM (Invitrogen, AM, acetoxymethyl एस्टर) की एक ट्यूब ले लो और 5 μl 20% F-127 समाधान Pluronic जोड़ें. मिश्रण समाधान अपने विंदुक टिप का उपयोग.
  3. 45 μl कोशिकी soluti जोड़ेंमिश्रण है और इसे शीघ्र ही भंवर (1.1 देखें).
  4. एक अतिरिक्त 325 μl कोशिकी समाधान जोड़ें और 3 मिनट के लिए ट्यूब sonicate.
  5. बाद sonication 1.156 oxygenated मिलीलीटर (95% हे 2/5% सीओ 2) कोशिकी समाधान अपने अंतिम Ca 2 + सूचक डाई लोड हो रहा है (30 सुक्ष्ममापी fura-red/AM, 0.33% DMSO और 0.065% Pluronic एफ 127) समाधान पाने के जोड़ . (4.8 देखें) का उपयोग करें जब तक एक अंधेरी जगह में ट्यूब स्टोर.
  6. राज्याभिषेक मस्तिष्क स्लाइसें स्थानांतरण एक सेल 6 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट (बी फाल्कन) oxygenated (95% हे 2/5% सीओ 2) बाह्य समाधान (अच्छी तरह से प्रति छह स्लाइस) के साथ भरा.
  7. 6-अच्छी तरह से देखभाल करने के लिए मस्तिष्क स्लाइसें नुकसान नहीं की थाली के कक्षों से oxygenated कोशिकी समाधान चूसो.
  8. Pipet सीधे Ca 2 + सूचक डाई लोड हो रहा है हर अच्छी तरह से करने के लिए समाधान के 750 μl. (विसर्जन लोड हो रहा है) fura-red/AM युक्त समाधान द्वारा मस्तिष्क स्लाइसें कवर किया जाना चाहिए.
  9. Incubat37 में 45 से 60 मिनट के लिए डिग्री सेल्सियस:;: ई एक 2 हे / सीओ 2 सेल संस्कृति इनक्यूबेटर (5% सीओ 2 23.5% 2 हे) में स्लाइस
  10. ऊष्मायन समय के अंत में, ताजा oxygenated कोशिकी समाधान fura लाल के साथ कोशिकाओं ओवरलोडिंग को रोकने के लिए और एक सूक्ष्म तरीके में डाई chelating कार्रवाई के माध्यम से 2 Ca + माप को प्रभावित द्वारा सीए 2 + सूचक डाई लोड समाधान की जगह. स्लाइस तो 2 / हे उपयोग करें जब तक सीओ 2 इनक्यूबेटर (सेटिंग्स के लिए पिछले बिंदु देखें) में रखा जा रहा है और 3-6 घंटे के लिए व्यवहार्य हैं.

5. माइक्रोस्कोपी और विश्लेषण

इस प्रोटोकॉल में GFP, जो ब्याज की सेल की पहचान और Ca 2 + सूचक डाई प्रतिदीप्ति तीव्रता मस्तिष्क स्लाइसें में एक साथ मापा जाएगा. इस प्रकार, confocal खुर्दबीन सही लेजर, फिल्टर और दो photomultiplier ट्यूबों के साथ सुसज्जित किया जाना चाहिए दो emissi इकट्ठासंकेतों पर. GFP और fura लाल प्रतिदीप्ति तीव्रता में परिवर्तन 488 एनएम के एकल उत्तेजना तरंग दैर्ध्य का उपयोग करके मापा जा सकता है. Fluorophores से उत्सर्जन प्रतिदीप्ति एक 522/DF35 एनएम GFP और fura लाल के लिए 600 एनएम से अधिक तरंगदैर्य लंबी पास फिल्टर के लिए फिल्टर का उपयोग कर एकत्र किया जा सकता है.

  1. प्रतिदीप्ति संकेत की निगरानी में उत्तेजना प्रेरित परिवर्तन, जो intracellular Ca 2 + एकाग्रता की एक उपाय है शुरू एक fura लाल लोड मस्तिष्क स्लाइस की एक रिकॉर्डिंग कक्ष (यानी वार्नर उपकरण RC-27 ओपन स्नान चैंबर) को सौंप दिया है कि confocal खुर्दबीन सेटअप (चित्रा 3 ए, बी) पर रखा जा सकता है.
  2. सुरक्षित एक वीणा (चित्रा -3 सी) के साथ मस्तिष्क टुकड़ा टुकड़ा स्नान समाधान के छिड़काव की गति के कारण कदम को रोकने के लिए (oxygenated कोशिकी समाधान, 1.1 कदम देखें). वीणा (टुकड़ा धारक) नायलॉन के धागे का एक समानांतर सरणी (~ 1 मिमी से एक दूसरे से अलग) पर महसूस किया जाता हैएक U आकार चांदी या प्लेटिनम फ्रेम. इस कदम पर स्नान समाधान का तापमान कम से कम कमरे के तापमान होना चाहिए. यदि उच्च तापमान की आवश्यकता है, उचित देखभाल खुर्दबीन खुर्दबीन में भागों स्थानांतरण के कारण ध्यान के विमान और लेंस आंदोलन पर संक्षेपण को रोकने के लिए लिया जा सकता है.
  3. Oxygenated कोशिकी कोशिकी Ca 2 + सूचक डाई के किसी भी अधिशेष निकालने के समाधान के साथ 10 मिनट के लिए टुकड़ा छिड़कना. छिड़काव के प्रवाह की दर ~ 100 / μl (के बारे में एक उचित छिड़काव प्रणाली देखने के 9) के लिए समायोजित किया जाना चाहिए.
  4. कम बढ़ाई माइक्रोस्कोप के माध्यम से टुकड़ा को देखो, अपने रिकॉर्ड के लिए टुकड़ा के उन्मुखीकरण के एक नोट बनाने के लिए और टुकड़ा में ब्याज की अपने क्षेत्र खोजने के लिए, हमारे मामले में मस्तिष्क में hypothalamic क्षेत्र.
  5. उच्च बढ़ाई बदलें और GFP एकत्रित द्वारा टुकड़ा में रुचि के सेल को खोजने के लिए और साथ ही fura लाल प्रतिदीप्ति तीव्रता की जाँचसंकेत (चित्रा -4 ए - सी). सतह के पास कोशिकाएं क्षतिग्रस्त हो सकता है या मर चुका है. इसलिए, 10 से अधिक सुक्ष्ममापी की गहराई में स्थित कोशिकाओं इमेजिंग के लिए चुना जाना चाहिए. हम मज़बूती से कोशिकाओं की गहराई 40-50 सुक्ष्ममापी उपाय करने के लिए कर सकते हैं, whereafter सिग्नल की शक्ति ड्रॉप करने के लिए शुरू कर दिया. याद रखें कि बाकी में कम Ca 2 + एकाग्रता के साथ कोशिकाओं के संकेत fura लाल रिश्तेदार उच्च प्रतिदीप्ति तीव्रता है. यह उच्च प्रतिदीप्ति तीव्रता इस मामले में मृत कोशिकाओं के संकेत नहीं है. GFP संकेत करने के लिए किसी भी या ऊतक टुकड़ा या intracellular 10 पीएच में परिवर्तन के लिए एक संकेतक के रूप में बहाव आंदोलन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  6. एक मूल्य है कि fura लाल प्रतिदीप्ति तीव्रता के परिवर्तन में माप की अनुमति देता है और दो fluorophores के विरंजन रोकता लेजर शक्ति को समायोजित करें. इसलिए, सबसे कम लेजर शक्ति के साथ शुरू और काला स्तर (ऑफसेट), डिटेक्टर एपर्चर, लाभ और लेजर तटस्थ घनत्व फिल्टर को बदलने के द्वारा एक पर्याप्त संकेत करने वाली शोर अनुपात प्राप्त करने के लिए समायोजितहै. लेजर शक्ति के लिए छोड़कर, वही GFP संकेत के लिए किया जाना चाहिए.
  7. 0.5 के बीच दरों पर छवियों को प्राप्त करने के लिए शुरू कर सकते हैं - 2 हर्ट्ज fura लाल और GFP संकेतों को इकट्ठा करने के लिए. अधिग्रहण की दर Ca 2 + संकेत की उम्मीद की दर के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए. वोल्ट निर्भर Ca 2 + spikes कुछ संकेत transduction cascades विभिन्न 2 दूतों की सक्रियता की आवश्यकता के सक्रियण की तुलना में जल्दी और कम यात्रियों के कारण हो सकता है. छवि अधिग्रहण की लंबाई प्रयोग का उद्देश्य के लिए उपयुक्त होना चाहिए. समय पर GFP संकेत में मदद मिलेगी कि अगर मस्तिष्क टुकड़ा के किसी भी आंदोलन हुआ है.
  8. अधिग्रहण और प्रयोग के दौरान, सभी स्कैनिंग सिर सेटिंग्स के लिए लगातार आयोजित किया विश्वसनीय परिणाम है कि तुलना की जा सकती रिकॉर्ड है.
  9. समय पर प्रतिदीप्ति में परिवर्तन विभिन्न गणितीय कार्यक्रम, यानी ImageJ (एनआईएच, Bethesda, एमडी का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता है http:/ / / Rsb.info.nih.gov ij /), इगोर (Wavemetrics) प्रो या MatLab (MathWorks). एक GFP टैग ब्याज क्षेत्र का संकेत न्यूरॉन के somata encircling (आरओआई), इस सटीक एक ही क्षेत्र Ca 2 में परिवर्तन के लिए विश्लेषण किया जा सकता है + fura समय पर लाल प्रतिदीप्ति संकेत का उपयोग कर.

Ca 2 + संकेतों मनमाना प्रतिदीप्ति इकाइयों के रूप में या आधारभूत प्रतिदीप्ति (एफ) के लिए सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति (ΔF) तीव्रता में रिश्तेदार परिवर्तन के मूल्यों (/ ΔF एफ) के रूप में प्रस्तुत किया जा सकता है. एक नकारात्मक विक्षेपन में इस प्रक्रिया का परिणाम जब intracellular Ca 2 + एकाग्रता Ca 2 + सूचक डाई के रूप में fura - लाल रंग का प्रयोग बढ़ जाती है. परिणामों की व्याख्या को कम करने के लिए, हम -1 साथ / ΔF एफ मूल्यों गुणा सकारात्मक प्रतिदीप्ति संकेत प्राप्त करने के लिए Ca 2 + (चित्रा 4C) में वृद्धि को प्रदर्शित करने की सलाह देते हैं.

न्यूरॉन्स और सीए के आयाम आवृत्ति के बीच परिणामों की तुलना 2 + संकेतों को एक नियमित अवधि या तुलनीय amplitudes के साथ नहीं होती है. कुछ संकेतों दृढ़ता से कोशिका के भीतर stochastic प्रक्रियाओं से प्रभावित किया जा सकता है. इस प्रकार, 2 Ca में कुल परिवर्तन यों + एक दिया सेल में और 2 Ca की तुलना अलग मस्तिष्क क्षेत्रों, क्षेत्र के अंतर्गत वक्र (एयूसी) के विश्लेषण में न्यूरॉन्स के बीच प्रतिक्रियाओं को अधिक उपयुक्त है. Ca 2 की राशि के लिए यह उपाय + किसी भी प्रारंभिक 2 Ca + क्षणिक, 2 चरणों शामिल है और ऊंचा Ca 2 + प्रतिक्रियाओं और दोलनों निरंतर. इस मामले की देखभाल में न्यूरॉन्स के बीच तुलना को सक्षम करने के लिए एक ही समय अवधि का विश्लेषण करने के लिए लिया जाना चाहिए.

6. प्रतिनिधि परिणाम

Gonadotropin हार्मोन जारी (GnRHR) रिसेप्टर hypothalamus में न्यूरॉन्स व्यक्त निस्र्पक शुरू हम ट्रांसजेनिक चूहों का इस्तेमाल किया है कि exci Cre - मध्यस्थता के बाद व्यक्त GFPमें सायन न्यूरॉन्स 4,11 GnRHR व्यक्त. GFP फ्लोरोसेंट न्यूरॉन्स hypothalamus सहित विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों में पहचान की गई. Confocal खुर्दबीन का उपयोग hypothalamic स्लाइस में इन GnRHR न्यूरॉन्स के शारीरिक गुणों की जांच करने के लिए, हम पहली बार दर्ज Ca 2 + संकेत है. सबसे पहले, हम इन चूहों से ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग राज्याभिषेक मस्तिष्क स्लाइसें प्राप्त चित्रा 1 आवश्यक उपकरण, सामग्री, और एक माउस मस्तिष्क excising लिए कदम दिखाता है. राज्याभिषेक hypothalamic मस्तिष्क स्लाइस काट रहे थे (2 चित्रा) और फिर प्रोटोकॉल के 4 बिंदु में कदम के अनुसार भरा हुआ है. उपयुक्त क्षेत्र के एकल मस्तिष्क टुकड़ा एक रिकॉर्डिंग कक्ष में रखा जाता है, एक वीणा (चित्रा 3) के साथ सुरक्षित है और फिर एक confocal खुर्दबीन का उपयोग imaged (5.1-5.9 चरण देखें). चित्रा 4 दो व्यक्ति राज्याभिषेक मस्तिष्क एकल की पहचान स्लाइस की एक उदाहरण दिखाता है GnRHR τGFP सेल निकायों, loadin के बाद आराम में प्रतिदीप्तिजी fura-red/AM साथ मस्तिष्क टुकड़ा और विलय confocal छवि को दर्शाता है कि GFP न्यूरॉन fura लाल लिया था पर्याप्त प्रोत्साहन प्रेरित 2 Ca की जांच सक्षम इन कोशिकाओं में संकेत है. हमारे प्रोटोकॉल का उपयोग हम शुरू में परीक्षण कि GnRHR न्यूरॉन्स hypothalamus के विभिन्न क्षेत्रों में GnRH साथ सीधे सक्रियण (चित्रा 4E) जवाब में प्रोत्साहन का पता लगाने के लिए इसी तरह की Ca 2 + संकेतों का उपयोग. हालांकि, इन संकेतों उनके प्रोत्साहन ताकत और मस्तिष्क क्षेत्र में 4 पर निर्भर करता है तरंग में मतभेद था. Ca 2 + प्रतिक्रियाओं की गतिशीलता में बदलाव यों, इस क्षेत्र के अंतर्गत वक्र (एयूसी) intracellular Ca 2 + (चित्रा 4E) 4 में वृद्धि के लिए एक उपाय के रूप में गणना की जा सकती है. वर्तमान में अध्ययन करने के लिए आणविक आधार अंतर्निहित Ca 2 + लहरों और दोलनों, सेक्स पर अपनी निर्भरता और जानवर के हार्मोन के स्तर की जांच के लिए चल रहा है, और क्या वे modulated किया जा सकताअन्य प्राकृतिक उत्तेजनाओं के द्वारा.

चित्रा 1
चित्रा 1. उपकरण, सामग्री, और एक माउस मस्तिष्क excising लिए कदम. ए मस्तिष्क विच्छेदन के लिए उपकरण और सामग्री: 1, लॉकटाइट 406 superglue, 2, माइक्रो चम्मच रंग, 3, एकल बढ़त रेजर ब्लेड, 4, छोटे और मध्यम वसंत कैंची, 5, कुंद संदंश, 6, कैंची, 7, पेट्री डिश अगर युक्त जेल ब्लॉक, 8 है, सूक्ष्म में बढ़ते मस्तिष्क के लिए बेस प्लेट. BF. कुछ कदम प्रोटोकॉल के 2 अंक में वर्णित किया जा रहा है की छवियाँ. एक माउस सिर की खोपड़ी के काटने के स्थान (लाल रेखा) और तीर (नारंगी) दिशा त्वचा की हड्डी से दूर खींच लिया जाना चाहिए (2.4 कदम देखें) का संकेत संकेत बी तस्वीर. सी. माउस सिर के फोटोग्राफ के बाद त्वचा से दूर खींच लिया है हड्डी संरचनाओं (2.4 कदम देखें). कुंद संदंश के साथ खुला कपाल को तोड़ने के लिए दिशा और कैंची के दिशा काटना या तो काले रंग के साथ संकेत दिया हैतीर या ग्रे व्यापक तीर धराशायी, क्रमशः. विभिन्न हड्डी संरचनाओं को नष्ट करने के बाद माउस मस्तिष्क (2.7 - 2.5 कदम देखें) डी. तस्वीर. कपाल नसों के माध्यम से मस्तिष्क के हटाने के ई. तस्वीर अभी भी खोपड़ी से जुड़ा हुआ है. एक अपेक्षाकृत undamaged माउस मस्तिष्क के एफ तस्वीर.

चित्रा 2
चित्रा 2. माउस मस्तिष्क के राज्याभिषेक hypothalamic वर्गों की स्लाइसिंग ए. सेरिबैलम (3.1 कदम देखें) को नष्ट करने के लिए एकल बढ़त धार की स्थिति का संकेत तस्वीर. अगर मस्तिष्क के संबंध में जेल ब्लॉक बी स्थिति सूक्ष्म की baseplate पर चिपके (3.2 कदम देखें). राज्याभिषेक मस्तिष्क टुकड़ा सी. काटना (यहाँ मस्तिष्क और जेल सूक्ष्म तक्षणी के काटने ब्लेड के संबंध में ब्लॉक पदों के स्थान ध्यान दें, कदम 3.4 देखें). घ, पृष्ठीय, वि, उदर.

चित्रा 3

चित्रा 4
चित्रा 4. Ca 2 + माउस hypothalamic मस्तिष्क स्लाइसें τGFP न्यूरॉन्स में संकेतों ई.. एक GFP न्यूरॉन और राज्याभिषेक माउस मस्तिष्क स्लाइसें में fura लाल प्रतिदीप्ति के साथ - साथ अधिग्रहण की पहचान. ए एक राज्याभिषेक मस्तिष्क टुकड़ा GnRHR τGFP न्यूरॉन्स (हरा) की पहचान की Confocal छवि. मस्तिष्क टुकड़ा के साथ fura-red/AM लोड करने के बाद मनाया में बी अपेक्षाकृत वर्दी मस्तिष्क क्षेत्र के प्रतिदीप्ति संकेत (लाल) दिखाया गया है. सी. Neu दिखा छवि विलयrons 2 सीए के साथ लोड + सूचक डाई (पीले) में दर्शाया. GFP न्यूरॉन somata की सीमाओं धराशायी सफेद लाइनों में संकेत कर रहे हैं, जबकि दो गैर GFP somata (तीर) के उदाहरण ग्रे लाइनों में संकेत कर रहे हैं. एक और पृष्ठभूमि की तुलना में उच्च लाल प्रतिदीप्ति की मात्रा के साथ गैर GFP न्यूरॉन GFP डी. उदाहरण. ई. उदाहरण दैहिक प्रोत्साहन प्रेरित Ca 2 + अलग hypothalamic मस्तिष्क के क्षेत्रों में अलग - अलग GFP टैग न्यूरॉन्स (पे, नाभिक periventricular, डीएम, dorsomedial hypothalamus, आर्क, arcuate नाभिक) से प्रतिक्रियाएं. क्षेत्र के तहत वक्र (एयूसी) लाल क्षेत्र से दर्शाया जाता है. अलग Ca 2 के बीच संकेतों + GnRHR अलग hypothalamic नाभिक से न्यूरॉन्स व्यक्त की तुलना में 2 Ca में कुल बदलाव के लिए एक अनुमान के रूप में नीलामी का उपयोग किया जा सकता है इसी अवधि के दौरान एक भी कक्ष में +. एफ योजनाबद्ध चित्र और चित्र GFP टैग में AE विश्लेषण न्यूरॉन्स के स्थान का संकेत पैनल ऊपरी: एक राज्याभिषेक मस्तिष्क का स्थानhypothalamic मस्तिष्क क्षेत्रों (लाल रेखा) से युक्त ection मध्य और निचले पैनल: एक मस्तिष्क टुकड़ा (मध्य) और उसके लाल बॉक्सिंग क्षेत्र की बढ़ती (कम पैनल) लाल डॉट्स के साथ से दर्ज GFP टैग न्यूरॉन्स की अनुमानित स्थिति का संकेत के योजनाबद्ध ड्राइंग आर्क, डीएम और पे ई में दिखाया गया है, कम पैनल योजना में काले क्षेत्र: 3 Rd निलय. लोअर दो चित्र Paxinos और फ्रैंकलिन 12 से अनुकूलित कर रहे हैं. निचले बाएँ कोने संख्या शीर्षस्थान से दूरी (मिमी) इंगित करता है.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

तंत्रिका विज्ञान के क्षेत्र में एक बड़ा सवाल समझने के लिए कैसे मस्तिष्क सामाजिक जानकारी प्रक्रियाओं है. सामाजिक मान्यता के लिए आवश्यक जानकारी के प्रमुख स्रोत घ्राण या pheromonal संकेतों द्वारा इनकोडिंग है. नाक में neuronal आबादी और मस्तिष्क, विशेष रूप से hypothalamus में संकेतों की पहचान के द्वारा इन संकेतों का पता लगाने, कई सामाजिक प्रक्रियाओं और प्रभाव हार्मोन और अन्य neuroendocrine 13-16 कारकों में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. मस्तिष्क क्षेत्रों में कई न्यूरॉन्स के साथ multifunctional नाभिक युक्त hypothalamus तरह neuronal प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण का एक अनिवार्य बाधा हित के विशिष्ट न्यूरॉन्स की पहचान है.

कई ट्रांसजेनिक माउस लाइनों विकसित किया गया है, जिसमें मुख्य रूप से GFP न्यूरॉन्स की पहचान करने में मदद करता है. दुर्भाग्य से, GFP की फ्लोरोसेंट संपत्ति Ca fluo-3 और 17 fluo-4 के रूप में 2 + सूचक रंगों का उपयोग माप पेचीदा है. इसलिए हम जांच करने के लिए शुरू कर दियागेट का उपयोग कर एक लाल स्थानांतरित Ca 2 + सूचक डाई 3,4 fura लाल की तरह, न्यूरॉन्स GFP टैग. आधारित Fura Ca 2 लाल + इमेजिंग पहले के साथ जोड़ दिया गया था GFP टैग अग्नाशय β कोशिकाओं और GFP टैग HEK 5,6 कोशिकाओं में व्यक्त रिसेप्टर्स. Fura-2 की तरह, fura लाल और GFP के बीच कुछ पार बात 2 सूचित किया गया है. फिर भी, विशिष्ट बैंडविड्थ और दुरंगा beamsplitter फिल्टर के साथ उच्च गुणवत्ता वाले उत्सर्जन फिल्टर सेट का उपयोग करते हुए / रंगों के बीच खून बहाना crosstalk के माध्यम से कुछ हद तक सीमित कर सकते हैं. एक confocal खुर्दबीन के लिए एक ही समय में दोनों चैनलों (हरे और लाल प्रतिदीप्ति) को मापने GFP टैग न्यूरॉन्स के साथ (1) मस्तिष्क स्लाइसें का उपयोग सेटिंग्स की पुष्टि करने के लिए बुद्धिमान है, लेकिन Ca 2 + सूचक डाई के साथ नहीं भरा हुआ है, के रूप में अच्छी तरह से (2) के बिना मस्तिष्क स्लाइसें न्यूरॉन्स GFP टैग लेकिन लाल स्थानांतरित Ca 2 + सूचक के साथ भरा हुआ है. के रूप में एक नियमित रूप से प्रयोग के साथ confocal खुर्दबीन पर एक ही सेटिंग का प्रयोग, अन्वेषक तो नोट कर सकते हैं अगर एकy प्रतिदीप्ति असमान चैनल, जो बचा जाना चाहिए में पाया जाता है.

कुछ जांचकर्ताओं Rhod-2 का उपयोग करें या कोशिकाओं GFP टैग 2,18,19 के साथ एक संयोजन में डाई वैकल्पिक लाल स्थानांतरित एक्स rhod1 के उपयोग की सलाह देते हैं. हालांकि, Rhod AM रंजक एक mitochondria में 20 ध्यान केंद्रित करने की प्रवृत्ति है लगते हैं और कई न्यूरॉन्स में कम लेबलिंग 17 दक्षता है. सुधार लाल स्थानांतरित Ca 2 + संकेतकों जांचकर्ताओं और कंपनियों है वर्तमान में विकसित कर रहे हैं उम्मीद है कि बेहतर प्रदर्शन के साथ 21 नए जांच. की जरूरत के कारण

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

हम धन्यवाद हमारे सहयोगियों जो इस काम में भाग लिया यहाँ संक्षेप. इस काम ड्यूश Forschungsgemeinschaft (894 SFB), DFG Schwerpunktprogramm 1392 'olfaction के एकीकृत विश्लेषण से अनुदान और वोक्सवैगन फाउंडेशन (TLZ) द्वारा समर्थित किया गया. TLZ वोक्सवैगन फाउंडेशन के एक Lichtenberg प्रोफेसर है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Sigma A1296
Fura-red/AM Invitrogen F-3021
Pluronic F-127 Sigma P2443
Dimethyl sulfoxide Fisher Scientific BP231
Vibrating-Blade Microtome Hyrax V 50 Zeiss 9770170
Cooling Device CU 65 for Microtome Hyrax V 50 Zeiss 9920120
O2/CO2 Incubator, CB210-UL Binder 0019389
Super glue, Loctite 406TM Henckel 142580
Double spatulas, spoon shape Bochem 3182
Microspoon spatulas, spoon shape Bochem 3344
Spring Scissors, Moria-Vannas-Wolff - 7mm Blades Fine Science Tools 15370-52
Spring Scissors, Vannas - 3mm Blades Fine Science Tools 15000-00
Wagner Scissors Fine Science Tools 14071-12
Medical Forceps, Dumont 7b Fine Science Tools 11270-20
Large Rectangular Open Bath Chamber (RC-27) Warner Instruments 64-0238
Confocal Microscope BioRad Radiance 2100 Zeiss n.a.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Almholt, K., Arkhammar, P. O., Thastrup, O., Tullin, S. Simultaneous visualization of the translocation of protein kinase Calpha-green fluorescent protein hybrids and intracellular calcium concentrations. Biochem. J. 337 (Pt 2), 211-218 (1999).
  2. Bolsover, S., Ibrahim, O., O'Luanaigh, N., Williams, H., Cockcroft, S. Use of fluorescent Ca2+ dyes with green fluorescent protein and its variants: problems and solutions. Biochem. J. 356, 345-352 (2001).
  3. Leinders-Zufall, T., Ishii, T., Mombaerts, P., Zufall, F., Boehm, T. Structural requirements for the activation of vomeronasal sensory neurons by MHC peptides. Nat. Neurosci. 12, 1551-1558 (2009).
  4. Wen, S. Genetic identification of GnRH receptor neurons: a new model for studying neural circuits underlying reproductive physiology in the mouse brain. Endocrinology. 152, 1515-1526 (2011).
  5. Hara, M. Imaging pancreatic beta-cells in the intact pancreas. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 290, E1041-E1047 (2006).
  6. Doherty, A. J., Coutinho, V., Collingridge, G. L., Henley, J. M. Rapid internalization and surface expression of a functional, fluorescently tagged G-protein-coupled glutamate receptor. Biochem. J. 341 (Pt 2), 415-422 (1999).
  7. Kurebayashi, N., Harkins, A. B., Baylor, S. M. Use of fura red as an intracellular calcium indicator in frog skeletal muscle fibers. Biophys. J. 64, 1934-1960 (1993).
  8. Heyward, P. M., Chen, C., Clarke, I. J. Gonadotropin-releasing hormone modifies action potential generation in sheep pars distalis gonadotropes. Neuroendocrinology. 58, 646-654 (1993).
  9. Leinders-Zufall, T. Technique for setting up the perfusion of a recording chamber for physiological studies with cultured and acutely dissociated cells. , Avaliable from: http://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/perfusion_strategies.pdf (1998).
  10. Kneen, M., Farinas, J., Li, Y., Verkman, A. S. Green fluorescent protein as a noninvasive intracellular pH indicator. Biophys. J. 74, 1591-1599 (1998).
  11. Wen, S. Functional characterization of genetically labeled gonadotropes. Endocrinology. 149, 2701-2711 (2008).
  12. Paxinos, G., Franklin, J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , 2nd edn, Academic Press. (2001).
  13. Tirindelli, R., Dibattista, M., Pifferi, S., Menini, A. From pheromones to behavior. Physiol. Rev. 89, 921-956 (2009).
  14. Kelliher, K. R., Wersinger, S. R. Olfactory regulation of the sexual behavior and reproductive physiology of the laboratory mouse: effects and neural mechanisms. ILAR J. 50, 28-42 (2009).
  15. Yoon, H., Enquist, L. W., Dulac, C. Olfactory inputs to hypothalamic neurons controlling reproduction and fertility. Cell. 123, 669-682 (2005).
  16. Boehm, U., Zou, Z., Buck, L. B. Feedback loops link odor and pheromone signaling with reproduction. Cell. 123, 683-695 (2005).
  17. Wilson, J. M., Dombeck, D. A., Diaz-Rios, M., Harris-Warrick, R. M., Brownstone, R. M. Two-photon calcium imaging of network activity in XFP-expressing neurons in the mouse. J. Neurophysiol. 97, 3118-3125 (2007).
  18. Hu, J. Detection of near-atmospheric concentrations of CO2 by an olfactory subsystem in the mouse. Science. 317, 953-957 (2007).
  19. Perez, C. A. A transient receptor potential channel expressed in taste receptor cells. Nat. Neurosci. 5, 1169-1176 (2002).
  20. Trollinger, D. R., Cascio, W. E., Lemasters, J. J. Selective loading of Rhod 2 into mitochondria shows mitochondrial Ca2+ transients during the contractile cycle in adult rabbit cardiac myocytes. Biochem Biophys. Res. Commun. 236, 738-742 (1997).
  21. Properties of Asante Calcium Red - a novel ratiometric indicator with long excitation wavelength. Meshik, X. A., Hyrc, K. L., Goldberg, M. P. Neuroscience Meeting Planner, , Society for Neuroscience. San Diego, CA. (2010).

Tags

तंत्रिका विज्ञान 66 अंक आण्विक जीवविज्ञान चिकित्सा GFP fura लाल कैल्शियम confocal इमेजिंग न्यूरॉन hypothalamus मस्तिष्क गंध माउस टुकड़ा तैयारी

Erratum

Formal Correction: Erratum: Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices
Posted by JoVE Editors on 10/01/2012. Citeable Link.

There was a typo in the abstract of Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices. 'Stokes' was spelt with an 'r' at publication. This has been corrected to

The huge Stokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength.

from

The huge Strokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength.

इमेजिंग Hypothalamic माउस मस्तिष्क स्लाइस की GFP टैग न्यूरॉन्स में कैल्शियम प्रतिक्रियाएँ
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schauer, C., Leinders-Zufall, T.More

Schauer, C., Leinders-Zufall, T. Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices. J. Vis. Exp. (66), e4213, doi:10.3791/4213 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter