在GFP标记的下丘脑神经元的小鼠脑片成像钙反应

Summary

在这个协议中，我们更新了最新进展，成像钙

Abstract

在我们的知识尽管一个巨大的增加有关的机制，在大脑中的信息的编码，一个中心问题的确切分子步骤，以及特定的神经元的活性，在如下丘脑保持脑区的多功能核。这个问题包括参与各种神经激素信号转导通路的调节成分的分子识别。立面图细胞内Ca ^{2 +}在调节神经元的敏感性，发挥重要的作用，无论是在水平的信号转导，和在突触站点。

出现了新的工具，以帮助识别特定的启动子的控制下表达绿色荧光蛋白（GFP）无数的神经元在大脑的神经元。若要监视空间和时间上的刺激诱 ​​导的Ca ^{2 +的}响应在GFP-标记的神经元，非绿色荧光的Ca ^{2 +}指示剂染料Ň要使用的电火工品。此外，激光共聚焦显微镜是一个喜爱的成像单个神经元的方法，由于其能力，可视化神经元的组织内，并在不同的平面的深度限制满分的聚焦荧光组织切片。比例式的Ca ^{2 +}指示剂fura-2的组合已被用于与GFP标记的神经元^1。然而，染料通过紫外线（UV）光被激发。 UV光的激光和光穿透深度有限的成本阻碍了它的使用在许多实验室中。此外，GFP荧光可能会干扰与fura-2的信号^2。因此，我们决定使用红色荧光的Ca ^{2 +}指示剂染料。巨大的笔画呋喃红色移位允许使用一个单一的激发波长与GFP组合的红色荧光的多色分析。我们有以前了良好的效果，使用呋喃结合红色与绿色荧光蛋白标记的嗅觉神经元。嗅觉组织切片的协议似乎工作电子邮件qually下丘脑神经元。呋喃红色的Ca ^{2 +}成像也成功地结合GFP标记的胰岛β细胞和GFP标记的受体表达的HEK细胞^5,6。一个小怪癖的呋喃红是在650 nm，其荧光强度降低，一旦指标结合钙^7。因此，具有相对高的静息神经元低的Ca ^{2 +}浓度的荧光强度。应当指出，红色，其他Ca ^{2 +}的指示剂染料存在的或正在开发的，这可能给在不同的神经元和大脑区域更好的或改进的结果。

Protocol

1。解决方案和琼脂糖凝胶的制备

1. 准备所述细胞外液用双蒸水的表。的pH值将是〜7.3后，10分钟曝气Carbogen增（95％O _{2/5％CO 2），300}毫渗⁸的渗透压。如果需要更高的渗透压是必需的，它可以进行调整，通过添加更多的葡萄糖（1mM的等于1毫渗）。该溶液被过滤两次，使用0.2μm的膜过滤器，以消除灰尘颗粒和可能的细菌污染。

试剂名称	缩写	摩尔。重量	浓度。	公司	猫。 N°
氯化钠	氯化钠	58.44克/摩尔	120毫米	VWR	27810
碳酸氢钠</ TD>	碳酸氢钠	84.01克/摩尔	25毫米	默克	106329
氯化钾	氯化钾	74.55克/摩尔	5毫米	默克	104936
BES *	C 6 H 15 NO 5 S	213.25克/摩尔	5毫米	西格玛	14853
硫酸镁，无水	硫酸镁	120.37克/摩尔	1毫米	西格玛	M7506
二水氯化钙	氯化钙* 2H 2 O	147.02克/摩尔	1毫米	默克	102382
D（+） - 葡萄糖一水合物	C 6 H 12 O 8 * H 2 O	198.17克/摩尔	10毫	默克	108342

*N，N-双（2 - 羟乙基）-2 - 氨基乙磺酸

2. 将该溶液在4℃下存储，但应充气Carbogen增（95％O _{2/5％CO 2）}在使用前10分钟。
3. 此时，准备1厘米³块琼脂凝胶稳定大脑在切削过程中（见步骤3）。首先，将该溶液加热至约60℃，4％（重量/体积）的琼脂（Sigma公司）溶解在双蒸水中加热溶解的琼脂溶液倒入到一个高度为1厘米的正方形培养皿。冷却和硬化后，在4％琼脂凝胶切成1厘米^3的块。这些块可以被存储在4°C〜4周

2。解剖小鼠脑组织

请确保所有的动物试验程序进行，按照动物福利委员会，各院校所确定的指导方针。

1. 在SACRificing的动物，确保琼脂凝胶块是可以使用的。
2. 用异氟醚麻醉鼠标（1-4％异氟烷在氧气中，使用约1分钟的精密汽化器）。这是重要的防止缺氧和因此，神经元损害。异氟醚的缺点是采用精密的蒸发器的成本和物流。在一个开放的系统，可以替代一个致命的过量，因为鼠标，将被牺牲。职业安全是在这种情况下，一个严重的问题。异氟醚必须直接排出的房间。因此，过量应在一个开放的系统中进行的化学通风柜。
3. 监测麻醉深度后，通过测试后足部反射安乐死鼠标斩首。这是由踏板或爪子掐反射牢牢夹住的手指引起戒断反应的动物的爪子或脚趾之间。显示了反射的动物，是不是在手术麻醉，绝对不会在状态安乐死。
4. 断头后，在头皮上切一个边剃胡刀集中在径向方向上，从额骨枕外隆凸。将两部分的头皮，首先从在延髓的横向方向的内侧尾端，然后向下在腹侧的方向（ 图1A-C）。
5. 请两个横向和一个延髓切割枕骨大孔中的与一个小弹簧剪刀（见用于切割黑色虚线箭头方向在图1C）。小心地切割关闭头盖骨mediocaudal横向吻端钝钳（请参阅广泛的灰色箭头在图1C）。在年龄较大的动物在矢状缝了一小截是有益的，往往是必要的，以避免损坏的大脑皮质层。
6. 此时，枕部，interparietal和顶骨分离。如果仍然存在，应小心取出硬脑膜，使用产钳，以防止损坏的BR艾因在下一步骤中。
7. 掉鳞骨，筛前额叶孔（ 图1D）。
8. 大脑现在可以很容易地删除用倒置微勺铲和颅神经切断（ 图1E）。

3。小鼠脑组织切片的冠状沟下丘脑段

1. 将大脑腹侧上其上的抗切割的表面上，并与单刃刀片（ 图2A），除去小脑。这条直线切割面将是一盘上安装的大脑，使冠状脑切片的切片的基础。
2. 胶中的大脑的切割部分在底板上的切片机（蔡司，岩狸V50）使用低量的一种快速固化的高性能的氰基丙烯酸酯类粘合剂胶水（乐泰406， 图1A）。此外，胶水1厘米的琼脂凝胶块（见1.5）的大脑腹侧（见'V' 图2B）的相对侧的凝胶块。
3. 几秒钟后，债券干燥，充满了你的切片放入洗澡水把盘子6°C冷氧合（95％O _{2/5％CO 2）}细胞外液（见1.1）。
4. 使用适当的低切割速度和切割300微米厚的切片。在我们的薄样切片机的情况下，我们使用了一个频率为60 Hz，振幅为0.8毫米和0.8 mm / s的（ 图2C）的速度。冠状脑切片直接收​​集每一次切割后，可以留在洗澡，直到全脑切片。冠状脑切片都经过精心transferred的冷氧合细胞外液的烧杯中。已经设计了各种工具执行传输操作（ 例如切割广泛的塑料或玻璃的巴斯德移液管或广泛的勺子的刮板）。它取决于正在优选的experimentator。最重要的是，片应适当的处理，以减少损失。
5. 如果切片机，可以编程到自动切割片，在这一刻，你就可以开始准备的Ca ^{2 +}指示剂染料装载解决方案。否则，它是推荐的，该溶液的制备前脑切片已经结束，以尽量减少延迟测量的Ca ^{2 +}的响应中的神经元，即在开始第2步之前进行。

4。制备的Ca ^{2 +}指示剂染料加载解决方案

加载的神经元的一个关键步骤仍然常常取决于损伤的量的细胞，这些细胞的健康状况的速度和解剖过程。另一个重要的步骤似乎是F-127的解决方案（见4.1）的使用新鲜的普朗尼克的。它被推荐使该解决方案在实验室里，而不是使用一个预制的解决方案供应商。根据对温度，湿度和货架寿命的Pluronic F-127溶液中，我们注意到嗅觉和脑的神经元的退化过程中的Ca ^{2 +}的装入程序。

1. 准备的20％（重量/体积）的Pluronic F-127（Sigma公司）在二甲亚砜（DMSO）的DMSO溶液的顶部加入的Pluronic F-127粉末。直接超声，恕不另行涡或混合解决方案。在2分钟内超声的Pluronic F-127将被解散。 100微升的Pluronic F-127的解决方案都准备了新鲜的每周一次。
2. 取一个试管的50微克细胞渗透fura-red/AM的（Invitrogen公司，AM，乙酰氧甲基酯），加5μl20％的Pluronic F-127的解决方案。混合使用移液器的尖端解决方案。
3. 加入45微升外soluti（见1.1）的组合涡不久的。
4. 添加一个额外的325微升细胞外液，超声处理3分钟的管。
5. 后超声处理，添加1.156毫升充氧（95％O _{2/5％CO 2）}的细胞外液中得到你的最后的Ca ^{2 +} 指示剂染料加载溶液 （30的μMfura-red/AM，0.33％DMSO和0.065％的Pluronic F-127） 。存储管直至使用（见4.8）在黑暗的地方。
6. 冠状脑切片转移到6孔细胞培养板（BD Falcon）中填充有充氧（95％O _{2/5％CO 2）}的细胞外液中（最多六个片每孔）。
7. 吸走从腔室的含氧的细胞外液中的6孔板中，小心不要损坏脑切片。
8. 移液管直接的Ca ^{2 +}指示剂染料加载溶液每孔750微升。大脑切片应该覆盖的解决方案，含fura-red/AM（浸泡加载）。
9. Incubate的切片，在37°C O ₂ / CO ₂细胞培养箱（O _{2：CO 2} 23.5％：5％），45至60分钟
10. 结束时的培养时间，更换新鲜的含氧的细胞外液中，以防止过 ​​载带fura-红和细胞在一种微妙的方式的影响通过螯合作用的染料的Ca ^{2 +}测量的Ca ^{2 +}指示剂染料加载溶液。切片然后被保持在O ₂ / CO ₂培养箱中（见前面的设置点），直到使用是可行的最多至3-6小时。

5。显微镜及分析

在这个协议中，GFP，其中确定了感兴趣的小区，和Ca ^{2 +的}指示剂染料的荧光强度将被同时测量在大脑切片。因此，激光共聚焦显微镜应配备正确的激光，过滤器和两个光电倍增管收集2及排放的信号。 GFP和呋喃红色的荧光强度的变化，可以使用一个单一的激发波长为488 nm测量。可以使用522/DF35的纳米过滤器GFP和波长大于600nm的为呋喃红色的长通滤波器，用于收集从荧光团发射的荧光。

1. 要启动呋喃红色加载的脑切片的监测刺激诱 ​​导的荧光信号中的变化，这是对细胞内Ca ^{2 +}浓度的措施，其中一个被转移到一个记录的腔室（ 即华纳仪器RC-27打开浴商会）设置（ 图3A，B）上的激光共聚焦显微镜，可以安装。
2. 固定的脑切片用竖琴（ 图3C），以防止切片移动由于浴溶液（含氧细胞外液的灌注速度;见步骤1.1）。竖琴（片保持器）制成的尼龙线程（彼此分离的〜1毫米）的平行阵列串成U形银或铂金的框架。浴溶液的温度，在此步骤中，至少应为室温。如果需要更高的温度，应采取适当的照顾，以避免水汽凝结在显微镜镜头和运动的焦平面由于在显微镜下将部分。
3. 灌注10分钟含氧细胞外液，以消除任何盈余外Ca ^{2 +}指示剂染料片。灌注的流量应调节到〜100微升/秒（提示关于适当的灌注系统见^9）。
4. 通过在低倍率的显微镜切片，记在片记录片的方向，找到你感兴趣的领域，在我们的例子中，在大脑中的下丘脑区。
5. 变更为高倍率和找到通过收集的GFP图像切片中的感兴趣的细胞，并同时检查呋喃红色的荧光强度信号（ 图4A-C）。可能会损坏或死细胞的表面附近。因此，座落于大于10μm的深度的细胞应选择用于成像。我们可以可靠地测量细胞最多为40-50微米的深度，此后的信号强度开始下降。请记住，低​​Ca ^{2 +}浓度的细胞在休息呋喃红灯信号具有相对高的荧光强度。这种高的荧光强度是在这种情况下，不是一个符号的死细胞。 GFP信号可以被用来检测任何漂移或运动的组织切片或在细胞内pH值¹⁰的变化是一个指标。
6. 调整激光功率到允许呋喃红色荧光强度的变化的测量值，该值，并防止两个荧光基团的漂白。因此，从具有最低的激光功率和调整，以获得足够的信号 - 噪声比，通过改变黑色电平（偏移量），检测器的光圈，增益和激光中性密度滤光器第除激光功率，应做相同的GFP信号。
7. 开始采集图像的速度在0.5 - 2赫兹收集呋喃红色和绿色荧光蛋白信号。采集的速度进行优化，以预期收益率的Ca ^{2 +}信号。电压依赖性Ca ^{2 +}尖峰可能比一些各种第二信使需要激活的信号转导级联的激活导致更快和更短的瞬变。图像采集的长度应该是适当的实验的目的。 GFP信号，随着时间的推移，将有助于确定是否发生了任何运动的大脑切片。
8. 在采集和实验，所有的扫描头的设置应保持记录，可以比较可靠的结果。
9. 随着时间的推移荧光的变化可以分析不同的数学课程， 即 ImageJ的（NIH，Bethesda，马里兰州， HTTP:/ / rsb.info.nih.gov / IJ /），伊戈尔临（Wavemetrics）的或MATLAB（MathWorks公司）。通过包围的胞体的GFP标记的神经元表示感兴趣的区域（ROI）中，此完全相同的区域可以进行分析的变化在Ca ^{2 +}使用呋喃红色荧光信号随着时间的推移。

Ca ^{2 +的}信号可以表示为任意的荧光单位，或作为值（ΔF/ F）的荧光强度（ΔF）归一化到基线荧光（F）的相对变化。本程序的查询结果中的负偏转时，细胞内Ca ^{2 +}浓度增加的Ca ^{2 +}指示剂染料使用呋喃红色。为了缓解对结果的解释，我们建议ΔF/ F值乘以-1，取得了积极的荧光信号显示一个崛起中的Ca ^{2 +（} 图4C）。

神经元之间的振幅和频率的Ca来比较结果2 +信号不发生一个普通的期间或类似的幅度。随机过程在细胞内的某些信号可能会强烈影响。因此，量化的总变化中的Ca ^{2 +}在给定的细胞的Ca ^{2 +}的反应不同脑区神经元，分析曲线下面积（AUC）之间的比较是比较合适的。这种措施的量的Ca ^{2 +}包括任何初始的Ca ^{2 +}瞬变，第二阶段和持续升高的Ca ^{2 +的}响应和振荡。在这种情况下护理应采取分析相同的时间段，以使神经元之间的比较。

6。代表性的成果

特征促性腺激素释放激素受体（GnRHR）表达下丘脑神经元，我们利用转基因小鼠表达GFP后Cre重组酶介导的EXCI促性腺激素释放激素受体 ​​表达神经元的锡安^4,11。 GFP荧光确定了不同的脑区，包括下丘脑神经元。为了研究这些GnRH受体神经元的生理特性，我们首先记录的Ca ^{2 +}信号，利用共聚焦显微镜下丘脑片。首先，我们使用上述协议从这些小鼠获得冠状脑切片， 图1示出必要的工具，材料和步骤，用于切除鼠脑。冠状下丘脑的脑切片，切（ 图2），然后装入根据协议4点的步骤。单脑切片的适当的区域中被放置在记录室中，固定用的竖琴（ 图3），然后利用共聚焦显微镜（参见步骤5.1-5.9）成像。 图4示出了示例的两个单独的冠状脑切片，确定单个促性腺激素释放激素受体-τGFP细胞体，在休息后LOADIN的荧光克的的大脑切片fura-red/AM和合并后的共聚焦图像，表明GFP神经元呋喃红色足以使调查的刺激诱 ​​导的Ca ^{2 +}信号在这些细胞。使用我们的协议中，我们最初的测试GnRH受体神经元是否采用类似的Ca ^{2 +}信号，刺激下丘脑的不同领域的检测响应直接激活，促性腺激素释放激素（ 图4E）。然而，这些不同的信号波形依赖于刺激的强度和大脑区域^4。要量化的Ca ^{2 +}的响应中的动态的变化，下面积的曲线（AUC），可以计算出作为衡量的增加细胞内Ca ^{2 +（} 图^4E）4。研究目前正在进行调查的分子基础的Ca ^{2 +}波和振荡，他们对性的依赖和激素水平的动物，它们是否可以被调制其他自然刺激。

图1。切除小鼠脑的工具，材料和步骤。A.用于大脑解剖的工具和材料：1，乐泰406胶水，2，微勺子锅铲; 3，单刃剃刀刀片4，中小春风似剪刀5，钝钳; 6，剪刀7，含有琼脂培养皿凝胶块，底板安装的大脑切片机。 BF。协议的第2点中描述的一些步骤的图片。 B.鼠标头的照片，表示切割位置的头皮（红色线）和指示应该被拉到皮肤远离骨（见步骤2.4）的方向的箭头（橙色）。 C.照片的老鼠头后的皮肤被拉开的骨骼结构（见2.4）。切削方向的剪刀和方向与钝镊子砸开头盖骨的黑色表示虚线箭头或灰色的宽箭头。 D.对小鼠脑组织消除各种骨结构（见步骤2.5 - 2.7）的照片。 E.摄影去除的大脑仍然通过头骨的颅神经。 F.一个相对完好的小鼠大脑的照片。

图2。切片冠状了小鼠大脑的下丘脑部分。A.拍摄指示的位置的单边沿刀片用于消除小脑（见步骤3.1）。 B.有关的大脑的琼脂凝胶块中的位置的切片机的底板粘接到（见步骤3.2）。 C.切割的冠状脑切片（注意这里的位置脑方面的切片机的刀片和凝胶块位置;看一步。3.4）。 D，背，V，腹侧。

图4。的Ca ^{2 +}信号的神经元对小鼠下丘脑的脑切片τGFP。AD。鉴定GFP的神经元，并同时采集冠鼠脑切片呋喃红色荧光。 A.共聚焦图像识别促性腺激素释放激素受体​​τGFP神经元（ 绿色 ）的冠状脑片。 B.相对均匀的荧光信号（红色）的大脑区域显示在一个观察加载后的脑片fura-red/AM。 C.合并后的图像显示神经RONS描绘的A胶卷与Ca ^{2 +}指示剂染料（ 黄色 ）。 GFP神经元胞体的边界在白色虚线线，而在灰色线表示的两个非绿色荧光蛋白的胞体（箭头）的例子。 D.实施例的背景相比，较高量的红色荧光的GFP和非-GFP的神经元。 E.体细胞刺激诱 ​​导的Ca ^{2 +的}例子从单个GFP标记在不同的下丘脑脑区的神经元（PE，室周核DM，下丘脑背内侧弧，弓状核）的响应。下面积的曲线（AUC）是描绘由红色区域。不同的Ca ^{2 +}信号之间的促性腺激素释放激素受体 ​​表达从不同的丘脑核的神经元可以使用AUC估计的总变化中的Ca ^{2 +}在给定的单元格在同一时期相比。 F.电路图附图和图表表示的位置的GFP标记的神经元在AE分析。 上图 ：一个冠状脑s的位置ection下丘脑的脑区（红线）。（ 中 ）和放大的的红色盒装区域（ 下图 ）与红点的大致位置记录的绿色荧光蛋白标记的神经元的脑切片中，下面板示意图PE，DM和电弧在E;在较低的面板方案： ^第三脑室的黑色区域。下两图均改编自Paxinos和富兰克林^12。左下角数字表示的距离（mm）从囟。

Discussion

在神经科学中的一个主要问题是了解大脑是如何处理社会信息化。一个主要的编码嗅觉或信息素信号源所需的信息社会的认可。这些信号在鼻子和识别的信号在大脑中，尤其是下丘脑的神经元群体的检测，发挥了关键作用，许多社会进程和影响的激素和其他神经内分泌因子^13-16。的一个重要障碍等脑区的神经元的反应，下丘脑多功能与多个神经元细胞核的分析是感兴趣的特定神经元的鉴定。

许多转基因小鼠系已被开发，其中主要的GFP有助于识别神经元。不幸的是，用Ca ^{2 +}指示剂染料如荧光-3和荧光4月^17日的GFP的荧光性质的复杂性测量。因此我们开始investi的门GFP标记的神经元，用红移的Ca ^{2 +}指示剂染料，如呋喃红^3,4。的Fura-红色根据Ca ^{2 +的}摄像曾结合GFP标记的胰腺β-细胞和GFP标记的受体表达在HEK细胞^5,6。 fura-2的一样，一些已经呋喃红色和绿色荧光蛋白之间的串扰^2。然而，使用高品质的排放与的具体带宽和二色性分束器的过滤器的过滤器组可以限制/泄放通过染料之间的在一定程度上的串扰。这是明智的，通过测量两个通道（绿色和红色荧光）在同一时间使用GFP标记的神经元（1）的脑切片的共焦显微镜来确认设定，但不加载与Ca ^{2 +的}指示剂染料，以及（2）大脑切片没有GFP-标记的神经元，但装有红移的Ca ^{2 +的}指示器。在激光共聚焦显微镜使用相同的设置作为一个普通的实验中，研究者可以注意，如果Ŷ荧光检测中的完全不同的信道，但应该避免使用。

一些研究者使用RHOD-2，或建议使用X-rhod1的作为替代红移的染料结合GFP标记的细胞^2,18,19。然而，RHOD AM的染料似乎有一种倾向，集中在线粒体^20，并有许多神经元标记效率低^17。由于需要改进的Ca ^{2 +-}指标，调查员和公司目前正在开发新的探针与希望的卓越性能²¹红移。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Sigma	A1296
Fura-red/AM	Invitrogen	F-3021
Pluronic F-127	Sigma	P2443
Dimethyl sulfoxide	Fisher Scientific	BP231
Vibrating-Blade Microtome Hyrax V 50	Zeiss	9770170
Cooling Device CU 65 for Microtome Hyrax V 50	Zeiss	9920120
O2/CO2 Incubator, CB210-UL	Binder	0019389
Super glue, Loctite 406TM	Henckel	142580
Double spatulas, spoon shape	Bochem	3182
Microspoon spatulas, spoon shape	Bochem	3344
Spring Scissors, Moria-Vannas-Wolff - 7mm Blades	Fine Science Tools	15370-52
Spring Scissors, Vannas - 3mm Blades	Fine Science Tools	15000-00
Wagner Scissors	Fine Science Tools	14071-12
Medical Forceps, Dumont 7b	Fine Science Tools	11270-20
Large Rectangular Open Bath Chamber (RC-27)	Warner Instruments	64-0238
Confocal Microscope BioRad Radiance 2100	Zeiss	n.a.