Imaging Calcium respons i GFP-mærkede neuroner i hypothalamus musehjerne Slices

Summary

I denne protokol, opdatere vi de seneste fremskridt i billedbehandling Ca

Abstract

Trods en enorm stigning i vores viden om mekanismerne bag kodning af information i hjernen, et centralt spørgsmål om de præcise molekylære trin samt aktiviteten af ​​specifikke neuroner i multi-funktionelle kerner af områder i hjernen, såsom hypothalamus tilbage. Dette problem omfatter identifikation af de molekylære komponenter involveret i reguleringen af ​​forskellige Neurohormonet signaltransduktionsbegivenheder kaskader. Stigninger i intracellulær ^{Ca2 +} spiller en vigtig rolle i reguleringen af følsomheden af neuroner, både på niveau med signaltransduktion og ved synaptiske steder.

Nye værktøjer er opstået for at hjælpe med at identificere neuroner i det utal af hjernens neuroner ved at udtrykke grønt fluorescerende protein (GFP) under kontrol af en bestemt promoter. At overvåge både rumligt og tidsligt stimulus-induceret ^{Ca2 +-reaktionerne} i GFP-mærkede neuroner, en ikke-grønt fluorescerende ^{Ca2 +} indikatorfarvestof needs der skal anvendes. Desuden er konfokal mikroskopi en foretrukken fremgangsmåde til billeddannelse individuelle neuroner i vævssnit på grund af sin evne til at visualisere neuroner i forskellige planer af dybden inde i vævet, og for at begrænse ud-af-fokus fluorescens. Den ratiometrisk ^{Ca2 +-indikator} fura-2 er blevet anvendt i kombination med GFP-mærkede neuroner ^1. Imidlertid er farvestoffet exciteres af ultraviolet (UV) lys. Prisen for laseren og den begrænsede optiske indtrængningsdybde UV-lys hindret dets anvendelse i mange laboratorier. Endvidere kan GFP-fluorescens gribe ind i fura-2-signalerne ^2. Derfor besluttede vi at bruge et rødt fluorescerende ^{Ca2 +-indikatorfarvestof.} Den enorme Strokes forskydning af fura-rød tillader flerfarvet analyse af rød fluorescens i kombination med GFP anvendelse af en enkelt excitationsbølgelængde. Vi havde tidligere gode resultater med fura-rød i kombination med GFP-mærkede olfaktoriske neuroner ^3. Protokollerne for olfaktoriske vævssnit syntes at arbejde equally godt i hypothalamus neuroner ^4. Fura-rød baseret ^{Ca2 +} billeddannelse blev også med held kombineret med GFP-mærkede pankreatiske β-celler og GFP-mærkede receptorer udtrykt i HEK-celler ^5,6. En lille særhed af fura-rød er, at dens fluorescensintensitet ved 650 nm aftager, når indikatoren binder calcium ^7. Derfor fluorescensen af hvilende neuroner med lavt ^{Ca2 +-koncentrationen} har relativt høj intensitet. Det skal bemærkes, at andre røde Ca ^{2 +-indikatorfarvestoffer} eksisterer eller er under opbygning, vil der giver bedre eller forbedrede resultater i forskellige neuroner og områder i hjernen.

Protocol

1. Fremstilling af Opløsning og agarosegel

1. Fremstille ekstracellulær opløsning ifølge tabellen med dobbeltdestilleret vand. PH-værdien vil være ~ 7,3 efter 10 min beluftning med carbogen _(95% O2 / _5% CO2), osmolariteten 300 mOsm ^8. Ønskes højere osmolaritet er påkrævet, kan det justeres ved tilsætning af mere glucose (1 mM lig 1 mOsm). Opløsningen filtreres to gange under anvendelse af en 0,2 um membranfilter for at fjerne støvpartikler og eventuelle bakterielle forureninger.

Navn på reagens	Forkortelse	Mol. vægt	Conc.	Firma	Kat. N °
Natriumchlorid	NaCl	58,44 g / mol	120 mM	VWR	27.810
Natriumhydrogencarbonat </ Td>	NaHCO3	84,01 g / mol	25 mM	Merck	106.329
Kaliumchlorid	KCl	74,55 g / mol	5 mM	Merck	104.936
BES *	C 6 H 15 NO 5 S	213,25 g / mol	5 mM	Sigma	14.853
Magnesiumsulfat, vandfrit	MgSO4	120,37 g / mol	1 mM	Sigma	M7506
Calciumchloriddihydrat	CaCl * 2H 2 O	147,02 g / mol	1 mM	Merck	102.382
D (+)-glucosemonohydrat	C 6 H 12 O 8 * H2O	198,17 g / mol	10 mM	Merck	108.342

*N, N-Bis (2-hydroxyethyl)-2-aminoethansulfonic acid

2. Opløsningen opbevares ved 4 ° C, men skal beluftes med carbogen _(95% O2 / _5% CO2) i 10 minutter før brug.
3. På dette tidspunkt forberede også 1 cm ³ blokke af agargel at stabilisere hjernen under skæringen procedure (se trin 3). Først opløses 4% (w / v) agar (Sigma) i dobbeltdestilleret vand ved opvarmning af opløsningen til cirka 60 ° C. Den opvarmede opløst agar opløsning hældes i en firkant petriskål til en højde på 1 cm. Efter afkøling og hærdning, er 4% agar gel skåret i blokke på 1 ^cm3. Disse blokke kan opbevares i op til 4 uger ved 4 ° C.

2. Dissektion af musehjernen

Sørg for, at alle animalske eksperimentelle procedurer udføres i overensstemmelse med de retningslinjer, som de dyrevelfærdsmæssige udvalgene i de respektive institutioner.

1. Før SACRificing dyret, sørge agar-gel blokke er klar til brug.
2. Bedøve mus med isofluran (1-4% isofluran i oxygen under anvendelse af en præcisions vaporizer i cirka 1 minut). Det er vigtigt at undgå hypoksi og derfor neuronbeskadigelse. En ulempe ved isofluran er omkostningerne og logistik for at bruge præcision vandfordampningsapparater. En dødelig overdosis i et åbent system kunne være et alternativ, da musen blive aflivet. Arbejdssikkerhed er i dette tilfælde et alvorligt problem. Den isofluran skal være direkte ventileres ud af lokalet. Derfor bør en overdosis i et åbent system udføres i et stinkskab.
3. Aflive musen ved halshugning, efter at overvåge dybden af ​​bedøvelse ved at teste den bageste fod refleks. Denne pedal eller paw pinch refleks udføres ved fast klemme en pote eller tå mellem fingrene for at fremkalde en tilbagetrækning reaktion af dyret. Et dyr, som viser en refleks er ikke på et kirurgisk niveau for bedøvelse og absolut ikke ien stat at aflive.
4. Efter halshugning, skære hovedbunden med en enkelt kant barberblad centralt i sagittal retning, fra den frontale knogler til den eksterne nakkeknude. Bevæge de to dele af hovedbunden, først fra den mediale kaudale ende i rostral lateral retning, derefter ned i ventrale retning (figur 1A-C).
5. Fremstilles to lateral og en rostrum snit i foramen magnum med en lille fjeder saks (se til skæring retning de sorte punkterede pile i figur 1C). Forsigtigt fraspalte baghovedet fra mediocaudal til lateral rostral med stumpe pincet (se brede grå pile i figur 1C). I ældre dyr et lille snit på den sagittale sutur er nyttigt og ofte nødvendigt for at undgå skadelige kortikale lag af hjernen.
6. På dette øjeblik occipital, interparietal og parietale knogler skal afmonteres. Hvis stadig er til stede, bør dura mater fjernes forsigtigt med pincet for at undgå beskadigelse af brain i det næste trin.
7. Fjerne den squamosal knogle, den forreste ethmoidal og frontal foramen (figur 1D).
8. Hjernen kan nu let fjernes med en inverteret mikro ske spatel og sondre hjernenerver (fig. 1E).

3. Slicing koronale hypothalamus afsnit i Mouse Brain

1. Anbring hjernen på ventrale side på en skærefast overflade og fjernes lillehjernen med én kant barberblad (figur 2A). Denne lige snit overflade vil være grundlaget for montering af hjernen på en plade for at muliggøre udskæring af coronale hjernesnit.
2. Lim hjernen med snitfelt på bundpladen af mikrotomen (Zeiss, Hyrax V50) under anvendelse af små mængder af en hurtigtørrende højtydende cyanoacrylatklæbestof superlim (Loctite 406, figur 1A). Desuden lim en ¹ cm3 agargel blok (se 1.5) på den ventrale side af hjernen (se "v" i (figur 2B).
3. Efter et par sekunder obligationen er tørret, sætte pladen i badet med din mikrotom fyldt med 6 ° C kold iltet (95% O _2/5% CO ₂₎ ekstracellulære opløsning (se 1,1).
4. Brug passende lav udskæring hastighed og skære 300 um tykke skiver. Ved vor mikrotom, bruger vi en frekvens på 60 Hz, en amplitude på 0,8 mm og en hastighed på 0,8 mm / s (figur 2C). Den koronale hjernesnit enten opsamlet direkte efter hvert snit eller kan efterlades i badet, indtil hele hjernen har været i snit. Den koronale hjernesnit er omhyggeligt transferred til et bæger med koldt iltet ekstracellulære opløsning. Forskellige værktøjer er designet til at udføre overførslen (f.eks snit bred plast eller glas Pasteur pipetter eller brede spoon spatler). Det afhænger af experimentator der foretrækkes. Vigtigst af alt skal skiverne håndteres på passende vis for at minimere skaderne.
5. Hvis mikrotomen kan programmeres til at skære skiver automatisk, kan du begynde at forberede Ca ^{2 +} indikatorfarvestof loading løsning på dette tidspunkt. Ellers anbefales det, at udarbejdelsen af denne løsning udføres før hjernen udskæring er slut for at minimere forsinkelserne til måling af Ca ^{2 +} responser i neuroner, nemlig før trin 2.

4. Fremstilling af ^{Ca2 +} indikatorfarvestof Loading Solution

Et afgørende skridt i læsning neuroner stadig ofte sundheden for de celler, som afhænger af mængden af ​​skader, som og hastigheden afdissektion procedure. Et andet væsentligt trin synes at være anvendelsen af ​​frisk Pluronic F-127 opløsning (se 4.1). Det blive anbefalet at gøre denne opløsning i laboratoriet og ikke at anvende en premade opløsning fra en leverandør. Afhængig af temperaturen, fugtigheden og hylden levetid Pluronic F-127 opløsning, bemærkede vi nedbrydning af olfaktoriske og hjerne neuroner i ^{Ca2 +} loading procedure.

1. Forbered 20% (vægt / volumen) Pluronic F-127 (Sigma) i dimethylsulfoxid (DMSO) ved tilsætning af Pluronic F-127 pulver på toppen af ​​DMSO-opløsningen. Direkte sonikeres denne opløsning uden forudgående hvirvel eller blanding. Inden for 2 min sonication for Pluronic F-127 vil blive opløst. 100 pi Pluronic F-127 opløsninger fremstilles frisk hver uge.
2. Tag én tube 50 pg celle-permeable fura-red/AM (Invitrogen, AM, acetoxymethylester) og tilsæt 5 pi 20% Pluronic F-127-opløsning. Bland opløsningen ved hjælp af spidsen af ​​din pipette.
3. Tilføj 45 pi ekstracellulære solutipå (se 1,1) til mix og vortex det snarest.
4. Tilføje en ekstra 325 pi ekstracellulære opløsning og sonikeres røret i 3 minutter.
5. Efter sonikering tilsættes 1,156 ml oxygeneret _(95% O2 / _5% CO2) ekstracellulære opløsning for at få den endelige ^{Ca2 +} indikatorfarvestof loading opløsning (30 uM fura-red/AM, 0,33% DMSO og 0,065% Pluronic F-127) . Opbevar glasset i et mørkt sted, indtil brug (se 4,8).
6. Overfør koronale hjernesnit til en 6-brønds cellekultur plade (BD Falcon) fyldt med oxygeneret _(95% O2 / _5% CO2) ekstracellulær opløsning (op til seks skiver pr brønd).
7. Sug fra iltede ekstracellulære løsning fra afdelingerne i 6-brønds plade pas på ikke at beskadige hjernen skiver.
8. Pipette direkte 750 ul af ^{Ca2 +} indikatorfarvestof loading opløsning til hver brønd. Hjernen skiver bør være omfattet af den opløsning, der indeholder fura-red/AM (nedsænkning belastning).
9. Incubate skiverne i en O ₂ / CO ₂ cellekultur inkubator (O _2: 23,5%, _CO2: 5%) i 45 til 60 min ved 37 ° C.
10. Ved afslutningen af inkubationstiden, udskiftes ^{Ca2 +} indikatorfarvestof loading opløsning af frisk oxygeneret ekstracellulære opløsning for at forhindre overbelastning af cellerne med fura-rød og påvirke på en subtil måde ^{Ca2 +} måling via chelerende effekt af farvestoffet. Skiverne bliver derefter holdes i O ₂ / CO ₂ inkubator (jf. foregående punkt for indstillinger), indtil brug og er rentabelt for op til 3-6 timer.

5. Mikroskopi og analyse

I denne protokol vil fluorescensintensiteten af GFP, som identificerer cellen af interesse, og ^{Ca2 +} indikatorfarvestof måles samtidigt i hjernesnit. Således bør konfokalt mikroskop være udstyret med den korrekte laser, filtre og to fotomultiplikatorrør til at indsamle de to emissipå signaler. GFP og ændringen i fluorescensintensitet af fura-rød kan måles under anvendelse af en enkelt excitationsbølgelængde på 488 nm. Emission fluorescens fra fluorophorerne kan opsamles ved hjælp af en 522/DF35 nm filter for GFP og et langpasfilter til bølgelængder større end 600 nm for fura-rød.

1. At starte overvågning stimulus-inducerede ændringer i fluorescenssignalet, som er et mål for den intracellulære ^{Ca2 +-koncentration,} en af fura-røde loaded hjerneskiver overføres til et registreringskammer (dvs. Warner Instruments RC-27 Open badkammeret) som kan monteres på konfokalt mikroskop setup (figur 3A, B).
2. Sikre hjernen skive med en harpe (figur 3C) for at forhindre skiven til at bevæge sig på grund af perfusion hastighed badopløsningen (oxygeneret ekstracellulære opløsning, se trin 1.1). Harpen (skive holder) er fremstillet af et parallelt array af nylontråde (adskilt fra hinanden med ~ 1 mm) trukket påen U-form sølv eller platin frame. Temperaturen af ​​badet opløsningen ved dette trin bør være mindst stuetemperatur. Hvis højere temperaturer er påkrævet, passende omhu skal træffes for at forhindre kondens på mikroskop linser og bevægelse af fokusplanet på grund af skiftende dele i mikroskopet.
3. Perfundere udsnittet i 10 min med oxygeneret ekstracellulære, for at fjerne overskud af ^{ekstracellulær} Ca2 ⁺ indikatorfarvestof. Strømningshastigheden af perfusion skal justeres til ~ 100 pi / s (tips om en passende perfusionssystem se ^9).
4. Kig på skive gennem mikroskopet ved lav forstørrelse, skal du notere orienteringen af ​​skive til dit arkiv og find dit område af interesse i skive, i vores tilfælde hypothalamus område i hjernen.
5. Skift til høj forstørrelse og finde cellen af ​​interesse i udsnit ved at indsamle GFP-billeder og samtidig kontrol af fluorescensintensiteten af ​​fura-rødsignal (Figur 4A-C). Celler nær overfladen kan blive beskadiget eller døde. Derfor bør celler placeret i en dybde på mere end 10 um udvælges til billeddannelse. Vi kunne pålideligt måle cellerne op til en dybde på 40-50 um, hvorefter signalstyrken begyndte at falde. Husk, at fura-rødt signal af celler i hvile med lavt ^{Ca2 +-koncentrationen} har relativt høje fluorescensintensiteter. Denne høje fluorescensintensitet er i dette tilfælde ikke et tegn på døde celler. The GFP signal kan anvendes til at detektere enhver glidning eller bevægelse af vævet skive eller som indikator for ændringer i intracellulær pH ^10..
6. Juster lasereffekten til en værdi, der giver målinger i ændringen af ​​fura-rød fluorescens intensitet og forhindrer blegning af de to fluorophorer. Derfor starte med den laveste lasereffekten og justere for at opnå et tilstrækkeligt signal-støj-forhold ved at ændre sortniveauet (offset), detektor åbning, forstærkning og laser neutralt densitetsfilters. Bortset fra lasereffekten, bør den samme gøres for GFP signal.
7. Start med at optage billeder ved hastigheder mellem 0,5 - 2 Hz til opsamling af fura-rød og GFP-signaler. Købet rate bør optimeres til den forventede hastighed af Ca ^{2 +} signal. Spændingsafhængige ^{Ca2 +} spidser kan give hurtigere og kortere transienter end aktivering af visse signal transduktion kaskader, der kræver aktivering af forskellige sekundære budbringere. Længden for billeddannelsen skal passe til formålet med forsøget. The GFP signal over tid hjælper til at bestemme om nogen bevægelse af hjernen skive har fundet sted.
8. Under erhvervelse og eksperimentet, har alle aftastningshoved indstillinger, der skal holdes konstant at registrere pålidelige resultater, som kan sammenlignes.
9. Ændringerne i fluorescens over tid kan analyseres under anvendelse af forskellige matematiske programmer, dvs ImageJ (NIH, Bethesda, MD; http:/ / Rsb.info.nih.gov / ij /), Igor Pro (Wavemetrics) eller MatLab (The MathWorks). Ved omslutter somata af en GFP-mærket neuron indikerer området af interesse (ROI), kan netop samme område blive analyseret for ændringer i ^{Ca2 +} ved hjælp af fura-rød fluorescens-signalet over tid.

^{Ca2 +} signaler kan præsenteres som arbitrære fluorescensenheder eller som værdier (bf / F) af den relative ændring i fluorescensintensitet (Af) normaliseret til baseline fluorescens (F). Denne procedure resulterer i en negativ afbøjning, når de intracellulære ^{Ca2 +-koncentration} stiger med fura-rød som ^{Ca2 +} indikatorfarvestof. For at lette fortolkningen af resultaterne, anbefaler vi at multiplicere bf / F værdier med -1 for at opnå positive fluorescenssignaler at vise en stigning i Ca ^{2 +} (figur 4C).

At sammenligne resultater mellem neuroner amplituden og frekvensen af ​​Ca 2 +-signaler ikke opstå med en regelmæssig periode eller sammenlignelige amplituder. Nogle signaler kan være stærkt påvirket af stokastiske processer i cellen. Således at kvantificere den samlede ændring i Ca ^{2 +} i en given celle og for at muliggøre sammenligning af Ca ^{2 +} respons mellem neuroner i forskellige områder af hjernen, analyse af området-under-the-kurven (AUC) er mere passende. Denne foranstaltning for mængden af Ca ^{2 +} omfatter enhver initial Ca ^{2 +} forbigående, anden faser og vedvarende forhøjede Ca ^{2 +} svar og svingninger. I dette tilfælde skal sørges for at analysere den samme tidsperiode til, at sammenligningen mellem neuroner.

6. Repræsentative resultater

For at starte kendetegnende gonadotropinfrigivende hormonreceptor (GnRHR), der udtrykker neuroner i hypothalamus vi gjort brug af transgene mus, der udtrykker GFP efter Cre-medieret excionen i GnRHR-udtrykkende neuroner ^4,11. GFP fluorescerende neuroner blev identificeret i forskellige dele af hjernen, herunder hypothalamus. For at undersøge de fysiologiske egenskaber af disse GnRHR neuroner, vi først indspillet Ca ^{2 +-signaler} i hypothalamus skiver ved hjælp af en konfokal mikroskop. Første, vi opnåede koronale hjernesnit fra disse mus under anvendelse af den ovenfor beskrevne protokol. Figur 1 viser det nødvendige værktøj, materiale og trin til udskæring af et musehjerne. De koronal hypothalamus hjerneskiver blev skåret (figur 2) og derefter sat i henhold til trinene i punkt 4 i protokollen. Enkelt hjerne skive af det relevante område er placeret i et registreringskammer, der fastgøres med en harpe (fig. 3) og derefter afbildes ved hjælp af et konfokalt mikroskop (se trin 5,1-5,9). Figur 4 viser et eksempel på to individuelle koronale hjernesnit identificerer single GnRHR-τGFP celle organer, fluorescens i hvile efter loading hjernen skive med fura-red/AM og den fusionerede konfokalt billede indikerer, at GFP neuron havde indtaget fura-rød tilstrækkeligt til at muliggøre undersøgelsen af stimulus-induceret ^{Ca2 +-signaler} i disse celler. Ved hjælp af vores protokol vi indledningsvis testede hvorvidt GnRHR neuroner benytter lignende ^{Ca2 +-signaler} for stimulus påvisning i forskellige områder af hypothalamus som reaktion på direkte aktivering med GnRH (fig. 4E). Men disse signaler forskellige i deres bølgeform afhængig af stimulus styrke og hjerne område ^4. At kvantificere ændringen i dynamikken af de ^{Ca2 +-reaktionerne,} det areal-under-the-kurven (AUC) kan beregnes som et mål for stigning i intracellulært ^{Ca2 +} (Figur 4E) ^4. Undersøgelser er i øjeblikket i gang med at undersøge den molekylære baggrund bag de Ca ^{2 +} bølger og svingninger, deres afhængighed af sex og hormonel status af dyret, og om de kan moduleresaf andre naturlige stimuli.

Figur 1. Værktøj, materialer og trin til udskæring af et muse-hjerne. A. Værktøj og materialer til hjernen dissektion: 1, Loctite 406 superlim, 2, micro ske spatel, 3, single kant barberblad, 4, små og mellemstore foråret saks, 5, stumpe pincet, 6, sakse, 7, petriskål indeholdende agar gel blok 8, bundplade til montering hjerne i mikrotom. BF. Billeder af nogle trin, der er beskrevet i punkt 2 i protokollen. B. Fotografi af en mus hoved indikerer skærepositionen i hovedbunden (rød linje) og pile (orange), der angiver den retning, huden bør trækkes væk fra knoglen (se trin 2,4). C. Fotografi af muse hovedet efter at huden trækkes bort viser de knoglestrukturer (se trin 2.4). Skæring retning saks og retningen for at bryde åbne kraniet med de stumpe pincet er angivet med enten den sortestiplede pile eller grå brede pile, hhv. D. Fotografi af musens hjerne efter at de forskellige knoglestrukturer (se trin fra 2,5 til 2,7). E. Fotografi af fjernelsen af ​​hjernen stadig er forbundet til kraniet via kranienerver. F. Fotografi af en relativ ubeskadiget musehjerne.

Figur 2. Udskæring af koronale hypothalamus dele af musehjernen. A. Fotografere angiver positionen af ​​den fælles kant barberblad til fjernelse af cerebellum (se trin 3.1). B. Placering af agargel blok i forhold til hjernen limet på basispladen af ​​mikrotomen (se trin 3.2). C. Skæring af koronale hjerne skive (her bemærke placeringen af ​​hjernen og gel-blok positioner med hensyn til kniven af ​​mikrotomen, se trin 3.4.). d, dorsal, v, ventral.

Figur 4. Ca ^{2 +-signaler} i τGFP neuroner i mus hypothalamus hjerneskiver. AD. Identifikation af en GFP neuron og samtidig erhvervelse af fura-rød fluorescens i coronal musehjerne skiver. A. Konfokal billede af en koronal hjerne skive identificere GnRHR-τGFP neuroner (grøn). B. relativt ensartede fluorescenssignal (rød) af hjernen område vist i A observeret efter indlæsning hjernen skive med fura-red/AM. C. sammenflettede billede viser neurons afbildet i en belastet med ^{Ca2 +} indikatorfarvestof (gullig). Grænser for GFP neuron somata er angivet med stiplede hvide linjer, mens eksempler på to ikke-GFP somata (pile) er angivet i grå linjer. D. Eksempel på GFP og ikke-GFP-neuron med højere mængder af rød fluorescens i forhold til baggrunden. E. Eksempler på somatisk stimulus-induceret ^{Ca2 +-reaktionerne} fra individuelle GFP-mærkede neuroner i forskellige hypothalamus-hjerneområder (Pe, periventricular kerne, DM, dorsomedial hypothalamus, Arc, arcuate nucleus). Areal-under-the-kurven (AUC) er vist ved røde område. Den tydelige Ca ^{2 +} signaler mellem GnRHR-udtrykkende neuroner fra forskellige hypothalamus kerner kan sammenlignes med AUC som estimat for den samlede ændring i Ca ^{2 +} i en given celle i samme periode. F. skematiske tegninger og diagrammer, der angiver placeringen af GFP-mærkede neuroner blev analyseret i AE øvre plade:. Placering af en koronale hjerne sfdeling indeholdende hypothalamus i hjernen regioner (rød linje) midterste og nederste panel:. Skematisk tegning af en hjerne skive (midten) og forstørrelse af sin røde boxed område (nederste panel), der angiver med røde prikker den omtrentlige position af de registrerede GFP-mærkede neuroner fra Pe, DM og Arc vist i E; sort område i nederste panel ordningen: 3 ^rd ventrikel. Lavere to diagrammer er tilpasset fra Paxinos og Franklin ^12. Nederste venstre hjørne angiver afstanden (mm) fra Bregma.

Discussion

Et vigtigt spørgsmål i neurovidenskab er at forstå, hvordan hjernen bearbejder social information. En fremherskende kilde til nødvendige oplysninger til social anerkendelse er kodet af olfaktoriske eller pheromonal signaler. Påvisningen af disse signaler ved neuronale populationer i næsen og anerkendelse af de signaler i hjernen, især hypothalamus, spiller en central rolle i mange sociale processer og indflydelse hormoner og andre neuroendokrine faktorer ^13-16. En væsentlig hindring for at analysere neuronale reaktioner i hjernen områder som hypothalamus, som indeholder multifunktionelle kerner med flere neuroner er identifikationen af ​​specifikke neuroner af interesse.

Mange transgene muselinjer er blevet udviklet, i hvilken hovedsagelig GFP hjælpe til at identificere neuroner. Desværre er den fluorescerende egenskab af GFP komplicerer målinger med ^{Ca2 +-indikatorfarvestoffer,} såsom fluo-3 og fluo-4 ^17. Vi begyndte derfor at undersøgate GFP-mærkede neuroner under anvendelse af en rød-skiftet ^{Ca2 +} indikatorfarvestof, som fura-rød ^3,4. Fura-rød baseret ^{Ca2 +} billeddannelse er tidligere blevet kombineret med GFP-mærkede pankreatiske β-celler og GFP-mærkede receptorer udtrykt i HEK-celler ^5,6. Ligesom fura-2, har nogle cross-talk mellem fura-rød og GFP blevet rapporteret ^2. Alligevel kan ved hjælp af høj kvalitet emission filtersæt med specifikke båndbredder og dikromatiske stråledeler filtre begrænse crosstalk / gennemblødning mellem farvestofferne i et vist omfang. Det er klogt at bekræfte indstillingerne af et konfokalt mikroskop ved at måle begge kanaler (grøn og rød fluorescens) samtidig med (1) hjernesnit med GFP-mærkede neuroner, men ikke belastet med det ^{Ca2 +} indikatorfarvestof samt som (2) hjerneskiver uden GFP-mærkede neuroner, men ladet med rød-skiftede ^{Ca2 +-indikator.} Brug de samme indstillinger på konfokal mikroskop som med en almindelig eksperiment, kan forskeren derefter bemærke, hvis eny fluorescens detekteres i uensartede kanal, hvilket bør undgås.

Nogle forskere bruger Rhod-2 eller anbefale brugen af X-rhod1 som alternativ rød-skiftet farve i kombination med GFP-mærkede celler ^2,18,19. Imidlertid Rhod AM farvestoffer synes at have en tendens til at koncentrere sig i mitokondrier ²⁰ og har i mange neuroner lav mærkningseffekt ^17. På grund af behovet for forbedret rød-skiftet Ca ^{2 +-indikatorer,} investigatorer og virksomheder er ved at udvikle nye prober med forhåbentlig overlegen ydelse ^21.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Sigma	A1296
Fura-red/AM	Invitrogen	F-3021
Pluronic F-127	Sigma	P2443
Dimethyl sulfoxide	Fisher Scientific	BP231
Vibrating-Blade Microtome Hyrax V 50	Zeiss	9770170
Cooling Device CU 65 for Microtome Hyrax V 50	Zeiss	9920120
O2/CO2 Incubator, CB210-UL	Binder	0019389
Super glue, Loctite 406TM	Henckel	142580
Double spatulas, spoon shape	Bochem	3182
Microspoon spatulas, spoon shape	Bochem	3344
Spring Scissors, Moria-Vannas-Wolff - 7mm Blades	Fine Science Tools	15370-52
Spring Scissors, Vannas - 3mm Blades	Fine Science Tools	15000-00
Wagner Scissors	Fine Science Tools	14071-12
Medical Forceps, Dumont 7b	Fine Science Tools	11270-20
Large Rectangular Open Bath Chamber (RC-27)	Warner Instruments	64-0238
Confocal Microscope BioRad Radiance 2100	Zeiss	n.a.