Imaging Kalcium svar i GFP-märkta neuroner i hypotalamus skivor mushjärna

Summary

I detta protokoll uppdaterar vi senaste framstegen i bildbehandling Ca

Abstract

Trots en enorm ökning av vår kunskap om de mekanismer som ligger bakom kodningen av information i hjärnan, en central fråga om de exakta molekylära stegen samt aktiviteten av specifika nervceller i multifunktionella kärnor av områden i hjärnan som hypotalamus kvar. Detta problem finns identifiering av de molekylära komponenterna involverade i regleringen av olika transduktion neurohormon signal kaskader. Förhöjda intracellulära Ca ^{2 +} spelar en viktig roll vid reglering av känsligheten av neuroner, såväl på nivån för signaltransduktion och vid synaptiska ställen.

Nya verktyg har skapats för att hjälpa till att identifiera neuroner i den myriad av hjärnans nervceller genom att uttrycka grönt fluorescerande protein (GFP) under kontroll av en viss promotor. Att övervaka både rumsligt och tidsmässigt stimulus-inducerad Ca ^{2 +} svar i GFP-märkta neuroner, en icke-grönt fluorescerande Ca ^{2 +} indikatorfärgämne nEEDS användas. Dessutom, är konfokalmikroskopi en favorit metod för avbildning enskilda neuroner i vävnadsskivor grund av dess förmåga att visualisera neuroner i distinkta plan djupet i vävnaden och begränsa utanför fokus fluorescens. Den kvotmetriska Ca ^{2 +} indikator fura-2 har använts i kombination med GFP-märkt neuroner ^1. Emellertid färgämnet exciteras av ultraviolett (UV) ljus. Kostnaden för lasern och den begränsade optiska inträngningsdjupet för UV-ljus hindrat dess användning i många laboratorier. Vidare kan GFP-fluorescens interferera med fura-2 signalerna ^2. Därför bestämde vi oss för att använda en röd fluorescerande Ca ^{2 +} indikatorfärgämne. Den enorma Strokes förskjutning av fura-röd tillåter multicolor analys av röd fluorescens i kombination med GFP med en enda excitationsvåglängd. Vi hade tidigare goda resultat med fura-röd i kombination med GFP-märkta lukt neuroner ^3. Protokollen för lukt vävnad skivor verkade fungera equally väl i hypotalamus neuroner ^4. Fura-röd baserade Ca ^{2 +} imaging har också framgångsrikt kombinerat med GFP-märkta pankreas β-celler och GFP-märkta receptorer som uttrycks i HEK celler ^5,6. En liten sarkasm i fura-röd är att dess fluorescensintensitet vid 650 nm minskar när indikatorn binder kalcium ^7. Därför har fluorescensen av vilande neuroner med lågt Ca ^{2 +} koncentrationen relativt hög intensitet. Det bör noteras, att andra röda Ca ^{2 +-indikatorfärgämnen} finns eller håller på att utvecklas, kan det ge bättre eller förbättrade resultat i olika nervceller och områden i hjärnan.

Protocol

1. Framställning av lösning och agarosgel

1. Framställ extracellulära lösningen enligt tabellen med dubbeldestillerat vatten. PH kommer att vara ~ 7,3 efter 10 min luftning med karbogen (95% O _2/5% CO _2), osmolariteten 300 mOsm ^8. Om en högre osmolaritet erfordras, kan den justeras genom tillsats av mer glukos (1 mM motsvarar 1 mOsm). Lösningen filtreras två gånger med en 0,2-filter im membran för att eliminera damm och eventuella bakteriella föroreningar.

Namn på reagens	Förkortning	Mol. vikt	Konc.	Företag	Kat. N °
Natriumklorid	NaCl	58,44 g / mol	120 mM	VWR	27.810
Natriumvätekarbonat </ Td>	NaHCOs 3	84,01 g / mol	25 mM	Merck	106.329
Kaliumklorid	KCl	74,55 g / mol	5 mM	Merck	104.936
BES *	C 6 H 15 NR 5 S	213,25 g / mol	5 mM	Sigma	14.853
Magnesiumsulfat, vattenfri	MgSO 4	120,37 g / mol	1 mM	Sigma	M7506
Kalciumkloriddihydrat	CaCl * 2H 2 O	147,02 g / mol	1 mM	Merck	102.382
D (+)-glukos-monohydrat	C 6 H 12 O 8 * H 2 O	198,17 g / mol	10 mM	Merck	108.342

*N, N-bis (2-hydroxietyl)-2-aminoethansulfonic syra

2. Lösningen lagras vid 4 ° C, men bör luftas med karbogen (95% O _2/5% CO ₂₎ under 10 minuter före användning.
3. Vid denna tidpunkt, också förbereda 1 cm ³ block av agargel att stabilisera hjärnan under den skärande proceduren (se steg 3). Först, lös 4% (vikt / volym) agar (Sigma) i dubbeldestillerat vatten genom upphettning av lösningen till ca 60 ° C. Den uppvärmda upplöst agar hälls i en fyrkantig petriskål till en höjd av 1 cm. Efter kylning och härdning, är 4% agargel skuren i block om 1 cm ^3. Dessa block kan lagras i upp till 4 veckor vid 4 ° C.

2. Dissektion av mushjärna

Kontrollera att alla djurexperimentella procedurer utförs i enlighet med de riktlinjer som fastställts av kommittéer för djurskydd respektive institutioner.

1. Före SACRificing djuret, se till att agargel blocken är klara för användning.
2. Söva musen med isofluran (1-4% isofluran i syre med en precisions förångaren under ca 1 minut). Det är viktigt att förhindra hypoxi och därmed nervskada. En nackdel med isofluran är kostnaden och logistik för att använda precision förångare. En dödlig överdos i ett öppet system kan vara ett alternativ, eftersom musen kommer att offras. Arbetarskydd är i detta fall ett allvarligt problem. Den isofluran måste vara direkt ventileras ut ur rummet. Därför bör en överdos i ett öppet system kan utföras i ett dragskåp.
3. Euthanize musen genom dekapitation efter övervaka djupet av anestesi genom att testa den bakre foten reflexen. Denna pedal eller tass nypa reflex utförs genom stadigt klämma en tass eller tå mellan sina fingrar att framkalla ett tillbakadragande reaktion av djuret. Ett djur som visar en reflex är inte en kirurgisk nivå av anestesi och definitivt inte ien stat att avliva.
4. Efter halshuggning, skär hårbotten med en enda kant rakblad centralt i sagittal riktning, från den främre benet till den externa nackknölen. Flytta de två delarna av hårbotten, först från den mediala kaudala änden i rostral sidoriktning, sedan ned i ventrala riktning (Fig. 1A-C).
5. Gör två laterala och en rostrala snitt i foramen magnum med en liten fjäder sax (se skärriktningen de svarta streckade pilarna i figur 1C). Försiktigt klyva bort kraniet från mediocaudal till sidled rostrala med trubbiga pincett (se breda grå pilarna i figur 1C). I äldre djur ett litet snitt på sagittala suturen är bra och ofta nödvändigt för att undvika skadliga kortikala skikt av hjärnan.
6. I detta ögonblick occipital, interparietal och parietalbenen bör tas bort. Om det fortfarande finns, bör dura mäter noggrant bort med pincett för att förhindra skador på brain i nästa steg.
7. Ta bort squamosal ben, den främre ethmoidal och främre foramen (figur 1D).
8. Hjärnan kan nu enkelt tas bort med en inverterad mikro sked spatel och avskiljning av kranialnerver (figur 1E).

3. Skivning Koronala hypothalamus avsnitt av mushjärna

1. Placera hjärnan på dess ventrala sida på en cut-resistent yta och avlägsna lillhjärnan med en enda kant rakblad (figur 2A). Denna snitt yta kommer att ligga till grund för montering hjärnan på en platta för att möjliggöra skivning av coronal hjärnan sektioner.
2. Limma hjärnan med snittet sektionen på bottenplattan av mikrotom (Zeiss, Hyrax V50) med små mängder av ett snabbhärdande högpresterande cyanoakrylatlim superlim (Loctite 406, Figur 1A). Dessutom, limma en 1 cm ³ agargel blocket (se 1,5) vid den ventrala sidan av hjärnan (se "v" i (figur 2B).
3. Efter några sekunder obligationen har torkat, lägg plattan i badet av din mikrotom fylld med 6 ° C kallt syresatt (95% O _2/5% CO ₂₎ extracellulär lösning (se 1,1).
4. Använd lämplig låg skivning hastighet och skär 300 nm tjocka skivor. Vid vår mikrotom, använder vi en frekvens på 60 Hz, en amplitud av 0,8 mm och en hastighet av 0,8 mm / s (Figur 2C). De koronala hjärnsnitt antingen samlas direkt efter varje snitt eller kan lämnas kvar i badet tills hela hjärnan varit sektionerad. Den koronala hjärnan skivor transfe noggrantrred till en bägare med kallt syresatt extracellulära lösning. Olika verktyg har utformats för att utföra överföringen (t.ex. skärning bred plast eller glas Pasteur pipetter eller breda spatlar sked). Det beror på experimentator som föredrages. Viktigast bör skivorna hanteras korrekt för att minimera skadorna.
5. Om mikrotomen kan programmeras för att skära skivor automatiskt kan du börja förbereda Ca ^{2 +} indikatorlösning färgämne belastning just nu. Annars rekommenderas att beredningen av denna lösning utförs innan hjärnan skivning har avslutats för att minimera förseningar för mätning av Ca ^{2 +} svar i nervceller, nämligen innan steg 2.

4. Framställning av Ca ^{2 +} indikatorfärgämne Laddar Lösning

Ett kritiskt steg vid lastning nervceller är ofta hälsa celler som beror på omfattningen av de skador som induceras av och hastigheten pådissektion förfarandet. Ett annat viktigt steg verkar vara användningen av färsk Pluronic F-127-lösning (se 4,1). Det som rekommenderas för att göra denna lösning i laboratoriet och inte att använda en premade lösning från en leverantör. Beroende på temperatur, fuktighet och hyllan livslängd Pluronic F-127-lösning, noterade vi nedbrytning av lukt-och hjärnan nervceller under Ca ^{2 +} laddningsproceduren.

1. Förbered 20% (vikt / volym) Pluronic F-127 (Sigma) i dimetylsulfoxid (DMSO) genom tillsats av Pluronic F-127 pulver ovanpå DMSO-lösningen. Direkt sonikera lösningen utan föregående virvel eller blandning. Inom 2 minuter sonikering Pluronic F-127 kommer att upplösas. 100 pl Pluronic F-127-lösningar framställs färsk vecka.
2. Ta en tub av 50 pg cell-permeabel fura-red/AM (Invitrogen, AM, acetoximetylester) och tillsätt 5 pl 20% Pluronic F-127-lösning. Blanda lösningen med toppen av din pipett.
3. Lägg 45 pl extracellulära Solutipå (se 1,1) till mixen och vortexa det inom kort.
4. Tillsätt ytterligare 325 pl extracellulär lösning och sonikera röret under 3 min.
5. Efter ultraljudsbehandling lägga 1,156 ml syresatt (95% O _2/5% CO ₂₎ extracellulär lösning för att få din sista Ca ^{2 +} indikatorfärgämne belastning lösning (30 M fura-red/AM, 0,33% DMSO och 0,065% Pluronic F-127) . Förvara tuben på en mörk plats tills användning (se 4,8).
6. Överför de koronala hjärnsnitt till en 6-brunnars cellkultur platta (BD Falcon) fylld med syrsatt (95% O _2/5% CO ₂₎ extracellulär lösning (upp till sex skivor per brunn).
7. Sug bort syresatt extracellulära lösningen från kamrarna i 6-brunnar noga med att inte skada hjärnan skivor.
8. Pipettera direkt 750 pl av Ca ^{2 +} indikatorfärgämne buffertlösning till varje brunn. De hjärnsnitt bör omfattas av lösningen innehållande fura-red/AM (nedsänkning belastning).
9. Incubate skivorna i en O ₂ / CO ₂ cellkultur inkubator (O _2: 23,5%; CO _2: 5%) under 45 till 60 min vid 37 ° C.
10. Vid slutet av inkubationstiden, byter Ca ^{2 +} indikatorlösning färgämne belastning genom färsk oxygenerad extracellulära lösningen för att förhindra överbelastning av cellerna med fura-röd och påverka på ett subtilt sätt Ca ^{2 +} mätning via kelatbildande verkan av färgämnet. Skivorna sedan hålls i O ₂ / CO ₂ inkubator (se föregående punkt för inställningar) tills användning och är lönsamt för upp till 3-6 timmar.

5. Mikroskopi och analys

I detta protokoll kommer fluorescensintensiteten hos GFP, som identifierar cellen av intresse, och av Ca ^{2 +} indikatorfärgämne mätas samtidigt i hjärnsnitt. Sålunda bör det konfokala mikroskopet vara utrustad med den korrekta lasern, filter och två fotomultiplikatorrör för att samla de båda emissipå signaler. GFP och förändringen i fluorescensintensitet av fura-rött kan mätas med användning av en enda excitationsvåglängd av 488 nm. Emission fluorescens från fluoroforerna kan uppsamlas med användning av ett 522/DF35 nm filter för GFP och en lång-passfilter för våglängder större än 600 nm för fura-röd.

1. För att starta kontroll stimulus-inducerade förändringar i fluorescenssignalen, som är ett mått på den intracellulära Ca ^{2 +} koncentration, en av fura-röda laddade hjärnsnitt överförs till en inspelning kammare (dvs. Warner Instruments RC-27 Öppen badkammaren) som kan monteras på konfokalmikroskop inställning (figur 3A, B).
2. Säkra hjärnan skiva med en harpa (figur 3C) för att förhindra att skivan att röra sig på grund av perfusionen hastighet badlösningen (syresatt extracellulär lösning, se steg 1,1). Harpan (skiva hållare) är tillverkad av en parallell uppsättning av nylontrådar (separerade från varandra genom ~ 1 mm) uppträdda påen U-form silver eller platina ram. Temperaturen hos badet lösningen vid detta steg bör vara minst rumstemperatur. Om högre temperaturer krävs, måste lämplig vård tas för att förhindra kondens på mikroskop linser och förflyttning av fokalplanet grund skiftande delar i mikroskop.
3. Perfundera segmentet under 10 min med syrsatt extracellulära lösningen för att avlägsna eventuellt överskott av extracellulär Ca ^{2 +} indikatorfärgämne. Flödeshastigheten av perfusionen bör justeras till ~ 100 | il / s (tips om ett lämpligt perfusionssystem se ^9).
4. Titta på skiva genom mikroskopet vid låg förstoring, anteckna orienteringen av skivan för din bokföring och hitta ditt intresseområde i skivan, i vårt fall hypotalamus område i hjärnan.
5. Byt till hög förstoring och hitta cellen av intresse i den del genom att samla GFP bilder och samtidigt kontrollera fluorescensintensiteten av fura-rödsignalen (Figur 4A-C). Celler nära ytan kan bli skadad eller död. Därför bör celler belägna på ett djup av mer än 10 | im väljas för avbildning. Vi tillförlitligt kunde mäta celler upp till ett djup av 40-50 ^ m, började varefter signalstyrkan falla. Kom ihåg att den fura-röda signalen av celler i vila med låg Ca ^{2 +} koncentrationen relativt hög fluorescensintensiteter. Denna höga fluorescensintensitet är i detta fall inte ett tecken på döda celler. GFP-signalen kan användas för att detektera varje förändring eller förflyttning av vävnaden skiva eller som en indikator för förändringar i intracellulärt pH ^10.
6. Justera lasereffekten till ett värde som tillåter mätningar i förändringen av fura-röd fluorescens intensitet och förhindrar blekning av de två fluoroforerna. Därför, börja med den lägsta lasereffekten och justera för att erhålla en tillräcklig signal-till-brus-förhållande genom att ändra svartnivå (offset), detektorapertur, förstärkning och laser neutraldensitetsfilters.. Med undantag för lasereffekt, bör samma göras för GFP-signalen.
7. Börja med att hämta bilder med hastigheter mellan 0,5 till 2 Hz att samla fura-röd och GFP-signaler. Förvärvet kurs bör optimeras för att den förväntade Ca ^{2 +-signal.} Spänningsberoende ^{Ca2 +} spikar kan orsaka snabbare och kortare transienter än aktivering av vissa signaltransduktionskaskader kräver aktivering av olika second messengers. Längden av bilden förvärvet bör vara lämplig för syftet med experimentet. GFP-signalen över tiden kommer att avgöra om någon rörelse av hjärnan skiva har inträffat.
8. Under förvärvet och experimentet alla scanning huvud inställningar måste hållas konstant för att registrera tillförlitliga resultat som kan jämföras.
9. Förändringarna i fluorescens över tid kan analyseras med olika matematiska program, dvs ImageJ (NIH, Bethesda, MD; http:/ / Rsb.info.nih.gov / ij /), Igor Pro (Wavemetrics) eller MatLab (The MathWorks). Genom omger somata av en GFP-märkt neuron anger regionen av intresse (ROI), kan denna exakt samma region analyseras för förändringar i Ca ^{2 +} med användning av fura-röd fluorescens signalen över tiden.

Ca ^{2 +-signaler} kan presenteras som godtyckliga fluorescensenheter eller som värden (AF / F) av den relativa förändringen i fluorescensintensitet (AF) normaliserad till baslinjen fluorescens (F). Denna procedur resulterar i en negativ avböjning när de intracellulära Ca ^{2 +} koncentrationen ökar med fura-rött som Ca ^{2 +} indikatorfärgämne. För att underlätta tolkningen av resultaten, rekommenderar vi multiplicera AF / F-värden med -1 för att få positiva fluorescenssignaler för att visa en ökning i Ca ^{2 +} (Figur 4C).

Att jämföra resultat mellan neuroner amplituden och frekvensen av Ca 2 +-signaler inte med en vanlig period eller jämförbara amplituder. Vissa signaler kan påverkas starkt av stokastiska processer i cellen. Således, för att kvantifiera den totala förändringen i Ca ^{2 +} i en given cell och för att möjliggöra jämförelser av Ca ^{2 +} responser mellan nervceller i olika hjärnregioner, analys av området, under-kurvan (AUC) är mer lämplig. Detta mått på mängden av Ca ^{2 +} omfattar alla ursprungliga Ca ^{2 +} övergående, andra faser och ihållande förhöjda Ca ^{2 +} svar och svängningar. I detta fall bör försiktighet iakttas för att analysera samma tidsperiod för att möjliggöra jämförelse mellan neuroner.

6. Representativa resultat

Att börja karakterisera gonadotropinfrisättande hormon-receptor (GnRHR) uttrycker neuroner i hypotalamus vi använt transgena möss som uttrycker GFP efter Cre-medierad spännen i GnRHR-uttryckande neuron ^4,11. GFP fluorescerande neuroner identifierades i olika områden i hjärnan, inklusive hypotalamus. För att undersöka de fysiologiska egenskaperna hos dessa GnRHR neuroner, vi först in Ca ^{2 +} signaler i hypotalamus skivor med en konfokalmikroskop. Först fick vi koronala hjärnsnitt från dessa möss med användning av ovan beskrivna protokoll. Figur 1 visar det nödvändiga verktyg, material och steg för utskärning en mushjärna. Den koronala hypotalamiska hjärnan skivor skars (figur 2) och sedan lastas enligt stegen i punkt 4 i protokollet. Enda hjärna bit av lämpligt område placeras i en inspelning kammare som fästs med en harpa (figur 3) och sedan avbildas med en konfokalmikroskop (se steg från 5,1 till 5,9). Figur 4 visar ett exempel på två olika koronalt hjärnan skivor identifiera enstaka GnRHR-τGFP cell organ, fluorescens vid vila efter loading. hjärnan segmentet med fura-red/AM och den sammanslagna konfokal bilden indikerar att GFP-neuronen hade tagit upp fura-röd tillräckligt för att möjliggöra undersökning av stimulus-inducerad Ca ^{2 +} signaler i dessa celler. Med vår protokoll vi testade inledningsvis huruvida GnRHR neuroner utnyttjar liknande Ca ^{2 +} signaler för stimulans detektion i olika områden i hypotalamus som svar på direkt aktivering med GnRH (figur 4E). Men skilde dessa signaler i sin vågform beroende på stimulans styrka och hjärna område ^4. För att kvantifiera förändringar i dynamiken av Ca ^{2 +} svar, ytan-under-kurvan kan (AUC) beräknas som ett mått på ökningen av intracellulär Ca ^{2 +} (Figur 4E) ^4. Studier pågår för att undersöka den molekylära grunden ligger till grund för Ca ^{2 +} vågor och svängningar, deras beroende av kön och hormonella status djuret och om de kan anpassasav andra naturliga stimuli.

Figur 1. Verktyg, material och steg för utskärning en mus hjärna. A. Verktyg och material som används för hjärnans dissektion: 1, Loctite 406 superlim, 2, mikro sked spatel, 3, enkel kant rakblad, 4, små och medelstora våren sax, 5, trubbiga pincett, 6, sax, 7, petriskål innehållande agar gel block; 8, bottenplatta för montering hjärna i mikrotom. BF. Bilder av vissa steg som anges i punkt 2 i protokollet. B. Fotografi av en mus huvud indikerar skärläge i hårbotten (röd linje) och pilar (orange) som anger den riktning huden ska dras bort från benet (se steg 2,4). C. Foto av musen huvudet efter att huden dras bort visar benstrukturer (se steg 2,4). Skärriktning sax och riktningen för att bryta öppen kraniet med de trubbiga pincett anges med antingen svartastreckade pilar eller grå breda pilar, respektive. D. Fotografi av mus hjärnan efter eliminering av de olika benstrukturer (se steg från 2,5 till 2,7). E. Foto av avlägsnandet av hjärnan kopplas fortfarande skallen via kranialnerver. F. Fotografi av en relativt oskadade mus hjärna.

Figur 2. Skivning av koronalt hypotalamus delar av mushjärna. A. Fotografera visar läget för den enda kanten rakblad för att eliminera lillhjärnan (se steg 3.1). B. Placering av agargel blocket i förhållande till hjärnan limmade på fundamentet av mikrotomen (se steg 3,2). C. slipning av koronala hjärnans skiva (notera här platsen för hjärnan och gel positioner blockera med avseende på kniven för mikrotom, se steg 3,4.). d. rygg, v, ventrala.

Figur 4. Ca ^{2 +} signaler i τGFP nervceller av mus hypotalamus i hjärnan skivor. AD. Identifiering av en GFP neuron och samtidigt förvärv av fura-röd fluorescens i koronala skivor mushjärna. A. Konfokal bild av en koronalt hjärnan skiva identifierar GnRHR-τGFP neuroner (grön). B. relativt enhetlig fluorescenssignal (röd) i hjärnan området som visas i A observerades efter laddning hjärnan skiva med fura-red/AM. C. sammanslagna bilden visar neuRons avbildas i en laddad med Ca ^{2 +} indikatorfärgämne (gulaktig). Gränser av GFP neuron somata anges med streckade vita linjer, medan exempel på två icke-GFP somata (pilar) visas i grå linjer. D. Exempel för ett GFP och icke-GFP-neuron med högre mängder av röd fluorescens jämfört med bakgrunden. E. Exempel på somatisk stimulans-inducerad Ca ^{2 +} svar från enskilda GFP-märkta neuroner i olika hypotalamus hjärnområden (PE, periventrikulär kärna, DM, dorsomediala hypotalamus, Arc, bågformade kärnan). Area-under-kurvan (AUC) skildras av det röda området. Den distinkta Ca ^{2 +} signaler mellan GnRHR-uttryckande neuron från olika hypotalamus kärnor kan jämföras med AUC som en uppskattning för den totala förändringen i Ca ^{2 +} i en given cell under samma period. F. schematiska ritningar och diagram som visar var GFP-märkta neuroner analyseras i AE Övre panel:. Placering av en koronalt hjärnansvsnitt innehåller hypotalamus hjärnregioner (röd linje) mellersta och nedre panelen:. Schematisk ritning av en hjärna skiva (mitten) och förstoring av den röda inramade området (nedre panelen) som anger med röda prickar den ungefärliga positionen för de inspelade GFP-märkta neuroner från Pe, DM och Arc visad i E, svart område i nedre panelen schema: 3 ^e ventrikeln. Lägre två diagram är anpassade från Paxinos och Franklin ^12. Nedre vänstra hörnet indikerar avståndet (mm) från Bregma.

Discussion

En stor fråga inom neurovetenskap är att förstå hur hjärnan bearbetar social information. En dominerande källa till information som är nödvändig för socialt erkännande kodas av lukt eller feromonal signaler. Detektering av dessa signaler genom neuronala populationer i näsan och erkännande av signalerna i hjärnan, särskilt hypotalamus, spelar en viktig roll i många sociala processer och hormoner inflytande och andra neuroendokrina faktorer ^13-16. En väsentlig hinder att analysera neuronala svar i hjärnområden som hypotalamus som innehåller multifunktionella kärnor med flera neuroner är identifieringen av specifika nervceller av intresse.

Många transgen mus linjer har utvecklats, där främst GFP hjälper till att identifiera nervceller. Olyckligtvis komplicerar fluorescensegenskap av GFP mätningar med Ca ^{2 +} indikatorfärgämnen såsom fluo-3 och fluo-4 ^17. Vi började därför att undersökagrind GFP-märkta neuroner med användning av en röd-skiftad Ca ^{2 +} indikatorfärgämne, såsom fura-röd ^3,4. Fura-röd baserade Ca ^{2 +} avbildning tidigare kombinerades med GFP-märkt pankreatiska β-celler och GFP-märkta receptorer uttryckta i HEK-celler ^5,6. Liksom fura-2, har en viss överhörning mellan fura-röd och GFP rapporterats ^2. Ändå, kan använda högkvalitativa uppsättningar emissionsfilter med specifika bandbredder och TVÅFÄRGAD filter stråldelare begränsar överhörning / genomblödning mellan färgämnena i viss utsträckning. Det är klokt att bekräfta inställningarna för ett konfokalt mikroskop genom att mäta båda kanalerna (grön och röd fluorescens) samtidigt med (1) hjärnsnitt med GFP-märkta neuroner, men inte laddas med det Ca ^{2 +} indikatorfärgämne, samt som (2) hjärnsnitt utan GFP-märkta neuroner men laddas med rödskiftat Ca ^{2 +} indikator. Med samma inställningar på konfokalmikroskop som med en vanlig experiment kan utredaren notera då om eny fluorescens detekteras i disparata kanalen, vilket bör undvikas.

Vissa forskare använder Rhod-2 eller rekommenderar användning av X-rhod1 som ett alternativ röda skiftat färg i kombination med GFP-märkta celler ^2,18,19. Emellertid, Rhod AM färgämnen verkar ha en tendens att koncentreras i mitokondrier ²⁰ och har i många neuroner låg märkningseffektivitet ^17. På grund av behovet av förbättrad röda skiftat Ca ^{2 +-indikatorer,} utredare och företag för närvarande utvecklar nya prober med förhoppningsvis överlägsen prestanda ^21.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Sigma	A1296
Fura-red/AM	Invitrogen	F-3021
Pluronic F-127	Sigma	P2443
Dimethyl sulfoxide	Fisher Scientific	BP231
Vibrating-Blade Microtome Hyrax V 50	Zeiss	9770170
Cooling Device CU 65 for Microtome Hyrax V 50	Zeiss	9920120
O2/CO2 Incubator, CB210-UL	Binder	0019389
Super glue, Loctite 406TM	Henckel	142580
Double spatulas, spoon shape	Bochem	3182
Microspoon spatulas, spoon shape	Bochem	3344
Spring Scissors, Moria-Vannas-Wolff - 7mm Blades	Fine Science Tools	15370-52
Spring Scissors, Vannas - 3mm Blades	Fine Science Tools	15000-00
Wagner Scissors	Fine Science Tools	14071-12
Medical Forceps, Dumont 7b	Fine Science Tools	11270-20
Large Rectangular Open Bath Chamber (RC-27)	Warner Instruments	64-0238
Confocal Microscope BioRad Radiance 2100	Zeiss	n.a.