Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Hipotalamik Fare Beyin Dilimleri GFP etiketli Nöronlar in Görüntüleme Kalsiyum Cevapları

Published: August 24, 2012 doi: 10.3791/4213

ERRATUM NOTICE

Summary

Bu protokol, biz görüntüleme Ca son gelişmeleri güncellemek

Abstract

Beyinde bilgi kodlama, kesin moleküler adımları yanı sıra hipotalamus kalır gibi beyin bölgelerinin çok fonksiyonlu çekirdekler belirli nöronların aktivitesi açısından merkezi bir soru altında yatan mekanizmalar hakkında bilgimiz çok büyük bir artış olmasına rağmen. Bu sorun, çeşitli nevrohormondur sinyal iletim cascades düzenlenmesinde rol oynayan moleküler bileşenlerin tanımlanmasını içerir. Hücre içi Ca2 + yükselmesi iki sinyal iletim seviyesinde ve sinaptik de nöron duyarlılık düzenlenmesinde önemli bir rol oynamaktadır.

Yeni araçlar, belirli bir promotör kontrolü altında yeşil floresan protein (GFP) ifade ederek beyin nöronlarının sayısız nöronlar belirlemenize yardımcı olmak için ortaya çıkmıştır. Hem mekansal ve zamansal olarak uyaran-indüklenen izlemek için Ca 2 GFP etiketli nöronlar, olmayan bir yeşil floresan Ca 2 + göstergesi boya n + yanıtlarıeeds kullanılır. Buna ek olarak, konfokal mikroskopi doku içindeki derinliği farklı düzlemlerde nöronlar görselleştirmek ve out-of-odak floresans sınırlamak için kabiliyeti nedeniyle doku dilimleri görüntüleme bireysel nöronların bir favori yöntemidir. Nöronlar 1 GFP-etiketli rasyometrik Ca 2 + gösterge fura-2 kombinasyon halinde kullanılmıştır. Ancak, boya ultraviyole (UV) ışık tarafından heyecanlı. UV ışık lazer ve sınırlı optik penetrasyon derinliği maliyeti birçok laboratuvarda kullanımı engellemiştir. Ayrıca, GFP floresan fura-2 sinyalleri 2 etkileyebilir. Bu nedenle, bir kırmızı floresan Ca 2 + gösterge boyası kullanmaya karar verdi. Fura-kırmızı büyük Strokes vites bir tek uyarılma dalgaboyu kullanılarak GFP ile kombinasyon halinde kırmızı renkli floresans analiz izin verir. Biz olfaktör nöronlar 3 GFP etiketli birlikte fura-kırmızı kullanarak önceden iyi sonuçlar vardı. Olfaktör doku dilimleri için protokoller e işe yaradıqually iyi hipotalamik nöronlar 4. Ca 2 tabanlı Fura-kırmızı + görüntüleme de başarıyla GFP etiketli pankreatik β-hücreleri ve HEK hücre 5,6 olarak ifade GFP etiketli reseptörleri ile kombine edildi. Fura-kırmızı küçük bir cilvesi göstergesi kalsiyum 7 bağlar kez 650 nm'de onun floresans yoğunluğunu azaltır olmasıdır. Bu nedenle, düşük Ca2 + konsantrasyon ile dinlenme nöronların floresan nispeten yüksek yoğunluğuna sahiptir. Unutulmamalıdır, diğer kırmızı Ca 2 +-göstergesi boyalar var veya şu anda geliştirilmekte olan, farklı nöron ve beyin bölgelerinde daha iyi ya da daha iyi sonuçlar verebilir.

Protocol

1. Çözüm ve Agaroz Jel Hazırlanması

  1. Çift distile su ile tabloya göre ekstrasellüler çözüm hazırlayın. PH değeri 7.3 olacak ~ carbogen (% 95 O2 /% 5 CO2), osmolarite 300 mOsm 8 ile 10 dk sonra havalandırma. Daha yüksek bir osmolarite gerekli ise, daha fazla glikoz (1 mM 1 mOsm eşit) eklenmesi ile ayarlanabilir. Çözelti, toz partikülleri ve olası bakteriyel kontaminasyon ortadan kaldırmak için bir 0.2 um zar filtresi kullanılarak iki kez süzülür.
Reaktif Adı Kısaltma Mol. ağırlık Kons. Şirket Kedi. N °
Sodyum klorür NaCl 58.44 g / mol 120 mM VWR 27810
Sodyum hidrojen karbonat </ Td> NaHCO 3 84,01 g / mol 25 mM Merck 106329
Potasyum klorür KCl 74.55 g / mol 5 mM Merck 104936
BES * C 6 H 15 NO 5 S 213,25 g / mol 5 mM Sigma 14853
Magnezyum sülfat, susuz MgSO4 120,37 g / mol 1 mM Sigma M7506
Kalsiyum klorür dihidrat CaCl * 2H 2 O 147,02 g / mol 1 mM Merck 102382
D (+)-glikoz monohidrat C 6 H 12 O 8 * H 2 O 198.17 g / mol 10 mM Merck 108342

*N, N-Bis (2-hidroksietil)-2-aminoethansulfonic asit

  1. Çözelti 4 ° C'de muhafaza edilir, ancak kullanımdan önce 10 dakika için carbogen (% 95 O2 /% 5 CO2) ile havalandırılır olmalıdır.
  2. Şu anda, (bkz: adım 3) kesme işlemi sırasında beyin stabilize etmek için 1 cm agar jel 3 blok da hazırlar. İlk olarak, yaklaşık olarak 60 ° C'ye ısıtma çözelti ile çifte damıtılmış su içinde% 4 (w / v) agar (Sigma) çözülür Isıtmalı çözünmüş agar solüsyonu 1 cm yüksekliğinde bir kare Petri kabı içine dökülür. Soğutma ve sertleşme sonra,% 4 agar jeli 1 cm3 bloklar halinde kesilir. Bu bloklar 4 ° C'de 4 hafta kadar saklanabilir

2. Fare Beyin diseksiyonu

Tüm hayvan deney prosedürleri ilgili kurumların hayvan refahı kuruluşlar tarafından oluşturulan ilkelere uygun olarak yapıldığından emin olun.

  1. SACR öncehayvan ificing, agar jel blokları kullanıma hazır olduğundan emin olun.
  2. Izofluran ile fare (yaklaşık 1 dak için hassas bir buharlaştırıcı kullanılarak oksijen izofluran% 1-4) uyuştur. Bu hipoksi ve dolayısıyla nöronal hasarı önlemek için önemlidir. Izofluran bir dezavantajı hassas buharlaştırıcılar kullanarak maliyet ve lojistik. Fare feda edilecektir yana açık bir sistem içinde bir ölümcül aşırı doz, bir alternatif olabilir. İş güvenliği bu durumda ciddi bir endişe içinde. Izofluran doğrudan odadan boşaltılmalıdır. Bu nedenle, açık bir sistem içinde bir aşırı kimyasal bir çeker ocak içinde yapılmalıdır.
  3. Arka ayak refleks test ederek anestezi derinliğinin izlenmesi sonra hayvanlar fare Euthanize. Bu pedal pençe ya da kıskı refleks sıkıca hayvan tarafından bir çekme yanıt ortaya çıkarmak için, bir kişi parmaklarını arasında bir pençe ya da parmak kısma göre gerçekleştirilir. Bir refleks gösterir bir hayvan anestezi cerrahi bir düzeyde değildir ve kesinlikle deötenaziyle bir devlet.
  4. Dekapitasyon sonra, frontal kemikten dış oksipital tümsek için, sagital yönde merkezi tek bir kenar jilet ile kafa derisi kesilir. Daha sonra aşağı yönde ventral (Şekil 1A-C), rostral yanal yönde orta kuyruk ucundan ilk olarak, kafa derisi iki parçası hareket ettirin.
  5. İki yan ve küçük bir yay makas (Şekil 1C yön siyah kesikli oklar kesme için bakınız) foramen magnum bir rostral kesim olun. Künt forseps (Şekil 1C konusunda geniş gri oklar) ile yanal rostral için mediocaudal gelen kafatası kapalı dikkatlice yapışmak. Büyük hayvanlarda sutur küçük bir kesim beynin zarar kortikal katmanları önlemek için yararlı ve sık sık gerekli olabilir.
  6. Bu anda oksipital, interparietal ve parietal kemikler ayrılmasıdır. Hala mevcut ise, dura mater dikkatli br zarar görmesini önlemek için forseps kullanılarak kaldırılmalıdırsonraki adımda ain.
  7. Squamosal kemik, anterior etmoid ve frontal foramen (Şekil 1D) götürün.
  8. Beyin artık kolayca ters mikro kaşık spatula kullanarak ve kranial sinirler (Şekil 1E) severing kaldırılabilir.

3. Fare Beyin Koronal Hipotalamus Bölümleri Dilimleme

  1. Bir kesim dayanıklı yüzey üzerinde ventral tarafta beyin yerleştirin ve tek bir kenar jilet (Şekil 2A) ile serebellum çıkarın. Bu, düz kesim yüzeyi koronal beyin bölümleri dilimleme sağlamak için bir plaka üzerinde beyin montaj için temel olacaktır.
  2. Hızlı kür alan yüksek performanslı siyanoakrilat yapıştırıcı yapıştırıcı (; Şekil 1A Loctite 406) düşük miktarda kullanarak Mikrotom kaide üzerine kesme bölümünde (Zeiss, damanı V50) ile Tutkal beyin. Buna ek olarak, tutkal beynin ventral tarafında 1 cm 3 agar jel bloğu (1.5 'e bakınız) (in' v 'bakın (Şekil 2B) kesme bıçağının karşı tarafında yer alacaktır.
  3. Tahvil kuruduktan birkaç saniye sonra, ile dolu Mikrotom banyoya tabak koydu 6 ° C soğuk oksijenli (% 95 O 2 /% 5 CO 2) ekstrasellüler çözeltisi (1.1).
  4. Uygun düşük dilimleme hızı kullanın ve 300 mikron kalınlığında dilimler kesip. Bizim mikrotom durumunda, 60 Hz, 0.8 mm bir genişlik ve 0.8 mm / s (Şekil 2C) Bir hız frekans kullanır. Koronal beyin dilimleri ya her kesimden sonra doğrudan toplanan veya tüm beyin kesitli olmuştur kadar banyosunda bırakılabilir. Koronal beyin dilimleri dikkatle transfe edilirSoğuk oksijenli ekstraselüler çözümü ile bir behere rred. Çeşitli araçları transferi (örn. kesim geniş plastik veya cam Pasteur pipetler veya geniş kaşık spatula) gerçekleştirmek için dizayn edilmiştir. Bu tercih edilmektedir experimentator bağlıdır. En önemlisi, dilim hasarı en aza indirmek için uygun ele alınmalıdır.
  5. Mikrotom otomatik dilimler kesmek için programlanmış olabilir, bu anda Ca 2 + göstergesi boya yükleme çözeltisi hazırlamak için başlayabilirsiniz. Aksi takdirde, dilimleme beyin adım 2 başlamadan önce, yani nöronlarda Ca 2 + tepkilerini ölçmek için en aza indirmek için gecikme sona erdikten önce bu çözeltinin hazırlanması yapılması tavsiye edilmektedir.

4. Ca 2 + Gösterge Boya Yükleme Çözüm hazırlanması

Yükleme nöronlarda kritik bir safha, sık sık neden olduğu hasar miktarına bağlıdır hücrelerinin sağlık ve hız olmuşturdiseksiyon prosedürü. Bir diğer önemli adım taze Pluronic kullanımı F-127 çözümü (4.1) gibi görünüyor. Bu laboratuvarda bu çözüm yapmak ve bir satıcıdan bir premade çözüm kullanmamaları tavsiye ediliyor. Sıcaklık, nem ve F-127 çözümü Pluronic ve raf ömrü ile ilgili olarak, biz, Ca 2 + yükleme işlemi sırasında koku ve beyin nöron bozulması kaydetti.

  1. DMSO çözelti üstüne Pluronic F-127 pudra katarak, dimetil sülfoksit (DMSO) içinde% 20 (w / v) Pluronic F-127 (Sigma) hazırlayın. Doğrudan önceki girdap veya karıştırma olmadan bu çözümü sonikasyon. 2 dakika sonikasyon içinde Pluronic F-127 eritilecektir. 100 ul Pluronic F-127 çözümler haftada bir taze hazırlanmıştır.
  2. 50 mikrogram hücre geçirgen fura-red/AM (Invitrogen, AM, asetoksimetil ester) bir tüpü alın ve F-127 çözümü 5 ul% 20 Pluronic ekleyin. Pipet ucu kullanılarak çözelti karıştırılır.
  3. 45 ul ekstraselüler soluti ekleüzerine karışımı ve kısa vorteks ona (1.1).
  4. Ek bir 325 ul ekstrasellüler çözüm ekleyin ve 3 dk süreyle tüp sonikasyon.
  5. Sonication oksijenli 1.156 ml (% 95 O 2 /% 5 CO 2), son Ca 2 + göstergesi boya yükleme çözeltisi (30 uM fura-red/AM,% 0.33 DMSO ve% 0.065 Pluronic F-127) almak için ekstrasellüler çözüm ekledikten sonra . Kullanıma kadar karanlık bir yerde (4.8), tüp saklayın.
  6. Oksijenli (% 95 O 2 /% 5 CO 2) ekstrasellüler çözeltisi (kuyu başına kadar altı dilim) ile dolu bir 6-hücre kültürü plaka (BD Falcon) için koronal beyin dilimleri aktarın.
  7. Beyin dilimleri zarar vermemeye dikkat ederek 6-plaka odalarından oksijenli ekstrasellüler çözüm emmek.
  8. Her kuyuya Ca 2 + göstergesi boya yükleme çözümü Pipet doğrudan 750 ul. Beyin dilimleri fura-red/AM (daldırma yükleme) içeren çözelti ile kaplanmış olmalıdır.
  9. Incubat37 ve 45 ila 60 dakika boyunca ° C:;: bir O 2 / CO 2 hücre kültürü kuluçka makinesi (% 5 CO2% 23.5 'O 2) e dilimleri
  10. İnkübasyon süresinin sonunda, Fura-kırmızı hücreleri ile aşırı ve boya kenetleme hareket yoluyla ince bir şekilde Ca 2 + ölçüm etkileyen önlemek için taze çözelti ile oksijenli hücre dışı Ca2 + indikatör boya yükleme çözelti değiştirin. Dilimler sonra O 2 / kullanıma kadar CO 2 inkübatör (ayarlar için önceki maddeye bakınız) tutulur ve 3-6 saat için geçerli olan edilmektedir.

5. Mikroskopi ve Analiz

Bu protokolde, ilgi hücreyi tanımlar GFP, ve Ca 2 + göstergesi boya floresan yoğunluğu beyin dilimleri aynı anda ölçülecektir. Böylece, konfokal mikroskop iki yayılımı toplamak için doğru lazer, filtre ve iki fotoçoğaltıcı tüp ile donatılmış olmalıdırsinyalleri. GFP ve Fura-kırmızı flüoresans şiddeti değişikliği 488 nm'lik bir uyarma dalga boyunda tek kullanılarak ölçülebilir. Floroforlar gelen Emisyon floresans GFP ve fura-kırmızı için 600 nm den büyük dalga boyları için uzun geçiş filtresi için filtre 522/DF35 nm kullanılarak toplanabilir.

  1. Hücre içi Ca 2 + konsantrasyonunun bir ölçüsüdür floresans sinyal izleme uyaran indüklenen değişiklikler, başlatmak için fura-kırmızı yüklü beyin dilim birinin bir kayıt odası (yani Warner Instruments RC-27 Açık Banyo Odası) aktarılır ki konfokal mikroskop setup (Şekil 3A, B) üzerine monte edilebilir.
  2. (; Adım 1.1 'e bakınız oksijenli ekstrasellüler çözüm) nedeniyle banyo çözüm perfüzyon hızına geçmek için dilim önlemek için arp (Şekil 3C) ile beyin dilim sabitleyin. Durmak (dilim tutucu) tutturulabilir naylon parçacığı paralel bir dizi (~ 1 mm ile birbirinden ayrılmış) yapılmıştırU şeklinde gümüş veya platin çerçeve. Bu aşamada küvet Çözeltinin sıcaklığı oda sıcaklığı en az olmalıdır. Yüksek sıcaklık gerekli olursa, uygun bakım mikroskobu parçaları değişen nedeniyle odak düzlemi mikroskop mercekleri ve hareket üzerine yoğunlaşmayı önlemek için alınmalıdır.
  3. Hücre dışı Ca2 + gösterge boyası herhangi bir fazlalık çıkarmak için oksijenli ekstraselüler çözeltisi ile 10 dakika süreyle dilim serpmek. Perfüzyon debisi ~ 100 s / ul (uygun bir perfüzyon sistemi 9'a bakınız ilgili ipuçları) ayarlanmalıdır.
  4. Düşük büyütmede mikroskop aracılığıyla dilim bak, kayıtlarınız için dilim yönünü bir yere not edin ve beyindeki hipotalamik alanda bizim durumumuzda, dilim ilgi alanı bulabilirsiniz.
  5. Yüksek büyütme değiştirin ve GFP görüntüleri toplayarak dilim ilgi hücre bulmak ve aynı anda fura-kırmızı floresan yoğunluğu kontrolSinyal (Şekil 4A-C). Yüzeye yakın hücreler hasarlı veya ölü olabilir. Bu nedenle, daha fazla 10 um arasında bir derinlikte bulunan hücreler görüntüleme için seçilmelidir. Biz güvenilir 40-50 mikron derinliğinde hücreleri ölçebilir, whereafter sinyal gücü düşmeye başladı. Düşük Ca 2 + konsantrasyonu istirahatte hücrelerin fura-kırmızı sinyal görece yüksek floresans yoğunlukları var unutmayın. Bu yüksek floresans şiddetinin bu durumda ölü hücrelerin bir işaretidir. GFP sinyali doku dilim veya hücre içi pH 10 değişiklikler için bir gösterge olarak herhangi bir kayması ya da hareketi tespit etmek için kullanılabilir.
  6. Fura-kırmızı floresans şiddetinin değişimi ölçümleri sağlar ve iki floroforlar ağartma engelleyen bir değere lazer gücünü ayarlayın. Bu nedenle, düşük lazer gücü ile başlar ve siyah düzeyi (ofset), dedektör diyafram, kazanç ve lazer nötral yoğunluk filtresi değiştirerek yeterli bir sinyal-gürültü oranı elde etmek için ayarlayıns. Lazer gücü dışında, aynı GFP sinyali için yapılmalıdır.
  7. 0.5 arasındaki oranlarda görüntüler elde etmek için Başlat - 2 Hz fura-kırmızı ve GFP sinyalleri toplamak için. Toplama düzeyi her bir Ca2 + sinyalinin beklenen oran için optimize edilmelidir. Voltaj-bağımlı Ca2 + kramponları çeşitli ikincil habercilerin aktivasyon gerektiren bazı sinyal iletimi kaskadlar aktivasyonu daha hızlı ve daha kısa geçici neden olabilir. Görüntü elde etme süresini deneyin amacı için uygun olmalıdır. Zamanla GFP sinyali beyin dilim herhangi bir hareket oluştu olmadığını belirlemek yardımcı olacaktır.
  8. Edinimi ve deney sırasında, tüm tarama kafası ayarları mukayese edilebilir güvenilir sonuçlar kaydetmek için sabit tutulması gerekir.
  9. ; Zamanla floresans değişimleri farklı matematiksel programlar, yani ImageJ (NIH, Bethesda, MD kullanılarak analiz edilebilir http:/ / Rsb.info.nih.gov / ij /), Igor Pro (Wavemetrics) veya MatLab (MathWorks). İlgilenilen bölgeyi gösteren bir GFP etiketli nöronun somata çevreleyen tarafından (ROI), bu aynı bölgede Ca 2 değişiklikler için analiz edilebilir + zamanla fura-kırmızı floresans sinyali kullanılarak.

Ca 2 + sinyalleri rasgele floresan birimleri olarak veya başlangıç ​​floresans (F) için normalize floresans yoğunluğunu (hızındaki) içinde göreceli değişim değerlerinin (hızındaki / F) olarak sunulabilir. Bu prosedür, bir negatif sapma ile sonuçlanır Ca 2 + gösterge boya gibi fura-kırmızı kullanarak, hücre içi Ca2 + konsantrasyonu artar. Sonuçların yorumlanması kolaylaştırmak için, Ca 2 + (Şekil 4C) bir artış görüntülemek için pozitif floresans sinyalleri almak için -1 ile hızındaki / F değerleri çarpmadan öneririz.

Nöronların Ca genlik ve frekans arasındaki sonuçları karşılaştırmak için 2 + sinyalleri düzenli bir dönem veya karşılaştırılabilir genlikleri ile meydana gelmez. Bazı sinyaller güçlü hücre içinde stokastik süreçler tarafından etkilenebilir. Böylece, belirli bir hücrede + Ca 2 toplam değişimin niceliğini ve beynin farklı bölgelerinde, alan-altında-eğrisi (EAA) analizi nöronlar arasındaki + tepkileri daha uygun olduğunu Ca 2 karşılaştırma etkinleştirmek için. Ca 2 miktarı için bu tedbir + herhangi bir başlangıç ​​Ca 2 + geçici, ikinci aşamalarını kapsar ve artmış Ca 2 + yanıtları ve salınımlar sürdürmüştür. Bu durumda basamakta nöronlar arasında karşılaştırma yapabilmek için aynı zaman diliminde analiz için alınmalıdır.

6. Temsilcisi Sonuçlar

Hipotalamustaki nöronlarda eksprese gonadotropin salgılatıcı hormon reseptörü (GnRHR) karakterize başlatmak için biz transgenik farelerin kullanımı yaptığınız Cre-aracılı exci sonra ekspres GFPde sion nöronlar 4,11 GnRHR-ifade. GFP floresan nöronlar hipotalamus dahil olmak üzere çeşitli beyin alanları tespit edilmiştir. Bu GnRHR nöronların fizyolojik özelliklerini incelemek için, öncelikle Ca 2 + kaydedilen bir konfokal mikroskop kullanılarak hipotalamik dilimlerden sinyaller. İlk olarak, yukarıda tarif edilen protokol kullanılarak bu fareler, koronal beyin kesitleri elde edilmiştir. Şekil 1, bu gerekli araçları, malzeme ve bir fare beyin eksize için adımlar gösterilmektedir. Koronal hipotalamik beyin dilimlerini protokolünün 4. noktasına adımlara göre kesilir (Şekil 2) ve daha sonra yüklendi. Uygun alan Tek beyin dilim (adım 5,1-5,9 bakınız) bir enstrüman (Şekil 3) ile sabitlenir ve daha sonra bir konfokal mikroskop ile görüntülenmiştir, bir kayıt odasına yerleştirilir. Şekil 4, tek bir tespit iki ayrı koronal beyin kesitleri bir örnek gösterilmektedir GnRHR-τGFP hücre gövdeleri, loadin sonra istirahat floresansg fura-red/AM ile beyin dilim ve GFP nöron uyaran-indüklenen Ca 2 soruşturma sağlamak için yeterince fura-kırmızı aldığını belirten Birleştirilen konfokal görüntü + bu hücrelerde sinyaller. Bizim protokol kullanarak biz başlangıçta GnRHR nöronlar GnRH ile doğrudan aktivasyonu (Şekil 4E) yanıt olarak hipotalamusun farklı alanlarda teşvik tespiti için benzer Ca 2 + sinyalleri kullanan olmadığını test. Ancak, bu sinyalleri uyaran gücünü ve beyin alanında 4 bağlı olarak kendi dalga farklıydı. Ca 2 + yanıtların dinamik olarak değişiklik ölçmek için, bölge-altında-eğri (AUC) hücre içi Ca2 + (Şekil 4E) 4 artışı için bir ölçü olarak hesaplanabilir. Çalışmalar şu anda Ca 2 + dalgalar ve titreşimler, seks bağımlılığı ve hayvanın hormonal durum altında yatan moleküler temelini araştırmak için çalışmalar devam etmektedir ve bunlar modüle edilebilir olmadığınıdiğer doğal uyaranlarla.

Şekil 1
Şekil 1. Araçlar, malzeme ve bir fare beyin eksize için adımlar. A. Beyin diseksiyon için kullanılan araçlar ve malzemeler: 1, Loctite 406 yapıştırıcı; 2, mikro kaşık spatula, 3, tek kenar jilet, 4, küçük ve orta bahar makas, 5, künt forseps; 6, makas, 7, Petri agar içeren jel bloğu; 8, mikrotom içine montaj beyin için taban plakası. BF. Protokol noktası 2'de tarif edilen bazı adımlar görüntüleri. Kesme kafa derisi pozisyonlar (kırmızı çizgi) ve deri (adım 2.4) kemik uzak çekilmelidir yönünü gösteren oklarla (turuncu) gösteren bir fare kafası B. Fotoğraf. Ten (adım 2.4) kemik yapıları gösteren uzağa doğru çekilir sonra fare kafa C. Fotoğraf. Küt forseps ile kafatasına açık bozduğu için makas ve yön doğrultusunda kesme ya da siyah ile gösterilirsırasıyla, oklar veya gri geniş okları kesik. Çeşitli kemik yapıları ortadan kaldırarak sonra fare beyin (- 2.7 adım 2.5) D. Fotoğraf. Beyin çıkarılması E. Fotoğraf yine kafatası sinirleri üzerinden kafatası bağlanır. Nispeten zarar görmemiş fare beyin F. Fotoğraf.

Şekil 2,
Şekil 2. Fare beyin koronal hipotalamik bölümden Dilimleme. A. (Adım 3.1) serebellum ortadan kaldırmak için tek bir kenar jilet yerini gösteren fotoğraf. Beyin göre agar jel blok B. Pozisyon (adım 3.2) mikrotom bir taban plakası üzerine yapıştırılır. Koronal beyin dilim C Kesme (burada beyin ve Mikrotom kesme bıçağı açısından jel blok pozisyonların yerini not edin;. Adım 3.4 'e bakınız). d, dorsal; v, ventral.

Şekil 3

Şekil 4,
Şekil 4. Ca 2 fare hipotalamik beyin dilimleri τGFP nöronlarda + sinyalleri. AD. Bir GFP nöron ve koronal fare beyin dilimleri fura-kırmızı floresans eşzamanlı edinimi belirlenmesi. GnRHR-τGFP nöronlar (yeşil) tanımlayan bir koronal beyin dilim A. Konfokal görüntü. Beyin bölgesinde B. nispeten homojen bir floresan sinyali (kırmızı) A fura-red/AM ile beyin dilim yükleme sonra gözlenen gösterilmektedir. C. neu gösteren görüntüyü MergedRons A Ca 2 + yüklü gösterge boyası (sarımsı) tasvir. Iki olmayan GFP somata (oklar) örnekleri gri hatları belirtilmiştir oysa GFP nöron somata sınırları, kesik beyaz çizgiler olarak gösterilmektedir. Arka plana göre kırmızı floresans yüksek miktarda bir GFP ve non-GFP nöron D. örneği. Somatik uyaran indüklenen Ca 2 E. örnekleri farklı hipotalamik beyin alanlarda bireysel GFP etiketli nöronlar (Pe, periventriküler çekirdeği; DM, dorsomedial hipotalamus; Arc, arkuat nükleus) + 'dan yanıtları. Alan-altında-eğrisi (EAA) kırmızı alan ile gösterilir. Farklı Ca 2 arasındaki + sinyalleri GnRHR-ifade Farklı hipotalamik nükleus nöronları Ca 2 toplam değişim için bir tahmin olarak EAA ile mukayese edilebilir + aynı dönemde belirli bir hücrede. F. Şematik çizimler ve diyagram AE analiz GFP etiketli nöronların yerini gösteren paneli Üst:. Koronal beyin s konumuhipotalamik beyin bölgeleri (kırmızı çizgi) içeren ection Orta ve alt panel:. beyin dilim (orta) ve kırmızı noktalar itibaren kaydedilen GFP etiketli nöronların yaklaşık konumunu gösteren, kırmızı kutulu alanı büyütme (alt panel) şematik çizimi E gösterilen Pe, DM ve Arc; alt panel düzeni siyah alan: 3. ventrikül. Alt iki diyagramları Paxinos ve Franklin 12 uyarlanmıştır. Sol alt köşedeki sayı bregma mesafe (mm) gösterir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Sinirbilim bir önemli soru beynin sosyal bilgiler nasıl işlediğini anlamak. Sosyal tanıma için gerekli bilgilerin bir baskın kaynağı koku veya pheromonal sinyalleri tarafından kodlanmıştır. Nöronal burun nüfus ve özellikle beyin, hipotalamus sinyallerin tanınması ile bu sinyallerin tespiti, birçok sosyal süreçler ve etki hormonlar ve diğer nöroendokrin faktörler 13-16 anahtar bir rol oynamaktadır. Birden çok fonksiyonlu nöronlar çekirdekler içeren hipotalamus gibi beyin bölgelerinde nöronal yanıtları analiz temel bir engel belirli ilgi nöronların tanımlanmasıdır.

Birçok transgenik fare hatları genellikle GFP nöronlar belirlemeye yardımcı olan, geliştirilmiştir. Ne yazık ki, GFP floresan özelliği, flüoresan 3 ve flüoresan 4 17 olarak Ca 2 + göstergesi boyalar kullanılarak ölçümler zorlaştırmaktadır. Bu nedenle, investi başladıkapısı fura-kırmızı 3,4 gibi bir kırmızı-kaymıştır Ca 2 + göstergesi boya kullanılarak nöron GFP etiketli. Ca 2 tabanlı Fura-kırmızı + görüntüleme Önceden ile kombine edildi GFP etiketli pankreatik β-hücreleri ve HEK hücre 5,6 olarak ifade GFP etiketli reseptörleri. Fura-2 gibi, Fura-kırmızı ve GFP arasında bazı çapraz konuşma 2 rapor edilmiştir. Ancak, belirli bir bant genişliği ve iki renkli ışın ayıracı filtreleri ile yüksek kalitede emisyon filtre setleri kullanarak / belli ölçüde boyalar arasındaki sızdırma-yoluyla karışma sınırlayabilirsiniz. Bu GFP etiketli nöronlar ile (1) beyin dilimleri kullanarak aynı anda iki kanal (yeşil ve kırmızı floresans) ölçerek bir konfokal mikroskop ayarları onaylamak için akıllıca, ama Ca 2 + göstergesi boya ile yüklü olarak iyi değil (2) olmadan beyin dilimleri nöronlar GFP etiketli ama kırmızı kayar Ca 2 + göstergesi ile yüklü olarak. Düzenli bir deneyde olduğu gibi konfokal mikroskop aynı ayarları kullanarak, araştırıcı sonra not eğer biry floresans kaçınılmalıdır farklı kanalı tespit edilir.

Bazı araştırmacılar Rhod-2 kullanın veya 2,18,19 GFP etiketli hücreleri ile birlikte bir kırmızı-kaymıştır alternatif boya olarak X-rhod1 kullanımını öneriyoruz. Ancak, Rhod boyalar mitokondri 20 konsantre bir eğilim var gibi görünüyor ve birçok nöron düşük etiketleme verimliliği 17 var AM. Geliştirilmiş Ca 2 +-göstergeleri, müfettişler ve şirket şu anda umarım üstün performansı 21 ile yeni sondalar gelişmekte olan kırmızı-kaymıştır. Ihtiyacı nedeniyle

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Biz çalışmalarına katılan meslektaşlarımızın burada özetlenen ederim. Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 894), DFG Schwerpunktprogramm 1392 'koku duyusunun Bütünleştirici analizi' dan hibe ve Volkswagen Vakfı (TLZ) tarafından desteklenmiştir. TLZ Volkswagen Vakfı Lichtenberg Profesörü.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Sigma A1296
Fura-red/AM Invitrogen F-3021
Pluronic F-127 Sigma P2443
Dimethyl sulfoxide Fisher Scientific BP231
Vibrating-Blade Microtome Hyrax V 50 Zeiss 9770170
Cooling Device CU 65 for Microtome Hyrax V 50 Zeiss 9920120
O2/CO2 Incubator, CB210-UL Binder 0019389
Super glue, Loctite 406TM Henckel 142580
Double spatulas, spoon shape Bochem 3182
Microspoon spatulas, spoon shape Bochem 3344
Spring Scissors, Moria-Vannas-Wolff - 7mm Blades Fine Science Tools 15370-52
Spring Scissors, Vannas - 3mm Blades Fine Science Tools 15000-00
Wagner Scissors Fine Science Tools 14071-12
Medical Forceps, Dumont 7b Fine Science Tools 11270-20
Large Rectangular Open Bath Chamber (RC-27) Warner Instruments 64-0238
Confocal Microscope BioRad Radiance 2100 Zeiss n.a.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Almholt, K., Arkhammar, P. O., Thastrup, O., Tullin, S. Simultaneous visualization of the translocation of protein kinase Calpha-green fluorescent protein hybrids and intracellular calcium concentrations. Biochem. J. 337 (Pt 2), 211-218 (1999).
  2. Bolsover, S., Ibrahim, O., O'Luanaigh, N., Williams, H., Cockcroft, S. Use of fluorescent Ca2+ dyes with green fluorescent protein and its variants: problems and solutions. Biochem. J. 356, 345-352 (2001).
  3. Leinders-Zufall, T., Ishii, T., Mombaerts, P., Zufall, F., Boehm, T. Structural requirements for the activation of vomeronasal sensory neurons by MHC peptides. Nat. Neurosci. 12, 1551-1558 (2009).
  4. Wen, S. Genetic identification of GnRH receptor neurons: a new model for studying neural circuits underlying reproductive physiology in the mouse brain. Endocrinology. 152, 1515-1526 (2011).
  5. Hara, M. Imaging pancreatic beta-cells in the intact pancreas. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 290, E1041-E1047 (2006).
  6. Doherty, A. J., Coutinho, V., Collingridge, G. L., Henley, J. M. Rapid internalization and surface expression of a functional, fluorescently tagged G-protein-coupled glutamate receptor. Biochem. J. 341 (Pt 2), 415-422 (1999).
  7. Kurebayashi, N., Harkins, A. B., Baylor, S. M. Use of fura red as an intracellular calcium indicator in frog skeletal muscle fibers. Biophys. J. 64, 1934-1960 (1993).
  8. Heyward, P. M., Chen, C., Clarke, I. J. Gonadotropin-releasing hormone modifies action potential generation in sheep pars distalis gonadotropes. Neuroendocrinology. 58, 646-654 (1993).
  9. Leinders-Zufall, T. Technique for setting up the perfusion of a recording chamber for physiological studies with cultured and acutely dissociated cells. , Avaliable from: http://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/perfusion_strategies.pdf (1998).
  10. Kneen, M., Farinas, J., Li, Y., Verkman, A. S. Green fluorescent protein as a noninvasive intracellular pH indicator. Biophys. J. 74, 1591-1599 (1998).
  11. Wen, S. Functional characterization of genetically labeled gonadotropes. Endocrinology. 149, 2701-2711 (2008).
  12. Paxinos, G., Franklin, J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , 2nd edn, Academic Press. (2001).
  13. Tirindelli, R., Dibattista, M., Pifferi, S., Menini, A. From pheromones to behavior. Physiol. Rev. 89, 921-956 (2009).
  14. Kelliher, K. R., Wersinger, S. R. Olfactory regulation of the sexual behavior and reproductive physiology of the laboratory mouse: effects and neural mechanisms. ILAR J. 50, 28-42 (2009).
  15. Yoon, H., Enquist, L. W., Dulac, C. Olfactory inputs to hypothalamic neurons controlling reproduction and fertility. Cell. 123, 669-682 (2005).
  16. Boehm, U., Zou, Z., Buck, L. B. Feedback loops link odor and pheromone signaling with reproduction. Cell. 123, 683-695 (2005).
  17. Wilson, J. M., Dombeck, D. A., Diaz-Rios, M., Harris-Warrick, R. M., Brownstone, R. M. Two-photon calcium imaging of network activity in XFP-expressing neurons in the mouse. J. Neurophysiol. 97, 3118-3125 (2007).
  18. Hu, J. Detection of near-atmospheric concentrations of CO2 by an olfactory subsystem in the mouse. Science. 317, 953-957 (2007).
  19. Perez, C. A. A transient receptor potential channel expressed in taste receptor cells. Nat. Neurosci. 5, 1169-1176 (2002).
  20. Trollinger, D. R., Cascio, W. E., Lemasters, J. J. Selective loading of Rhod 2 into mitochondria shows mitochondrial Ca2+ transients during the contractile cycle in adult rabbit cardiac myocytes. Biochem Biophys. Res. Commun. 236, 738-742 (1997).
  21. Properties of Asante Calcium Red - a novel ratiometric indicator with long excitation wavelength. Meshik, X. A., Hyrc, K. L., Goldberg, M. P. Neuroscience Meeting Planner, , Society for Neuroscience. San Diego, CA. (2010).

Tags

Nörobilim Sayı 66 Moleküler Biyoloji Tıp GFP fura-kırmızı kalsiyum konfokal görüntüleme nöron hipotalamus beyin koku fare dilim hazırlık

Erratum

Formal Correction: Erratum: Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices
Posted by JoVE Editors on 10/01/2012. Citeable Link.

There was a typo in the abstract of Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices. 'Stokes' was spelt with an 'r' at publication. This has been corrected to

The huge Stokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength.

from

The huge Strokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength.

Hipotalamik Fare Beyin Dilimleri GFP etiketli Nöronlar in Görüntüleme Kalsiyum Cevapları
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schauer, C., Leinders-Zufall, T.More

Schauer, C., Leinders-Zufall, T. Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices. J. Vis. Exp. (66), e4213, doi:10.3791/4213 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter