Summary
製造方法
Abstract
葉の原基の開始後、バイオマス蓄積は主に細胞増殖や葉1の拡大によって制御されます。しかし、 シロイヌナズナの葉は、多くの異なる細胞型といくつかの構造で構成された複雑な器官である。同時に、成長して葉が拡大停止と老化1を受けることが第一である葉柄から最も遠いセルと、開発のさまざまな段階で細胞が含まれています。リーフ内の異なる細胞が故に伸長または分化、分裂している、アクティブ、ストレスやデッド、および/または任意の一時点で、携帯型のサブ組での刺激に応答します。これはやりがいの葉のゲノム研究を行います。たとえば全体の葉から発現データを解析する際に、異なる細胞応答ゾーンまたは細胞型で動作遺伝子ネットワークからの信号が生成される不正確なプロファイルになり、混乱します。
この問題に対処するために、Sエベラル方法は細胞特異的遺伝子発現の研究を可能が記載されている。これらは、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）2またはプロトプラストの生成とそれに続く蛍光活性化細胞選別（FACS）3,4、原子力降水5とポリソーム6の免疫沈降のための最近記載そのままシステムに使用されるGFP発現植物が含まれる。
FACSを成功裏に根端からセルの識別情報との距離が遺伝子3,7の多数の発現プロファイルに有意な効果を持っていたことを示すなど、多くの研究が、使用されてきました。 GFPの行のFACSもroot窒素応答と側根の発達8、塩ストレスルート10の9オーキシン分布の間に細胞特異的転写調節を実証し、 シロイヌナズナの茎頂分裂組織11の遺伝子発現マップを作成するために使用されている。しかしFACSが以前自家蛍光12,13に基づくシロイヌナズナ葉由来プロトプラストをソートするために使用されてきたが、葉にGFPを発現シロイヌナズナライン上のFACSのこれまでの利用は4非常に限られてきました。以下のプロトコルでは、プロトプラストの生成レジームの影響を最小限に抑えながら、FACSと互換性のあるシロイヌナズナの葉のプロトプラストを得るための方法について説明します。我々は、向軸表皮14にKC274線、血管組織14とダブルGFPは内核局在化シグナルにリンクされている構築物を発現TP382 シロイヌナズナライン入力で GFPを発現するが、KC464 シロイヌナズナラインを使用する方法を実証しているGFPを発現する孔辺細胞（データは示されていない、 図2）。我々は現在、老化のさまざまな段階で、両方の細胞型の開発とストレス時の具体的な表現だけでなく、不均一な細胞集団を研究するためにこのメソッドを使用している。
Protocol
1。プロトプラストの生成
- かみそりの刃で1ミリメートル幅のストリップ（ 図1）への収穫葉材料とカット。のために最大15葉に単一のリーフ以上を含有するサンプルを簡単にカットする前に積み重ねることができます。
- 直ちに20mlの溶液 （400mMのマンニトール、20mMのMES水和物は、20mMのKCl、10mMのCaCl 2、2mMのMgCl 2、0.1％BSAおよび2.5mMのβ-メルカプトエタノールを含む9センチメートルラウンドペトリ皿に葉片を転送protoplasting酵素を含むpHは5.7）（1.2％セルロース、R-10、0.6％セルロースRSと0.4パーセントmacerozyme R-10）とRNase及び転写酵素阻害薬（1×ProtectRNAおよび10μg/ mlのアクチノマイシンD）;優しく独立した葉片と真空度は2×5分間浸透させる。
- 3〜4時間室温およびプロトプラストを90 rpmに設定オービタルシェーカー上にシャーレを置きます。
- インキュベーションの間葉片は、使用することによって、互いに分離されるべきである30分ごとの間隔で、フラットピンセットのセットです。
- 50 mlチューブで70μmのセルストレーナー（フィッシャーサイエンティフィック）を置き、そっとを通じてprotoplastingソリューションをフィルタリングします。これは、プロトプラストが通過できるようにしながらふるいによって保持される葉片を、削除されます。
- ゆっくりとフィルター同じ篩4 mlの溶液を用いて葉片を洗浄します。
- 丸底チューブにプロトプラストを転送し、ペレットプロトプラスト〜5分間300 xgでプロトプラスト溶液を遠心分離します。
- 穏やかにプロトプラストを乱すことなく、できるだけ多くの上清を可能な限りを吸引。
- 、遠心分離機で5分間300 xgで5 mlの溶液を用いてプロトプラストを洗浄します。上清を除去
- パスツールピペットやカットオフP1000チップを使用して、 ソリューションの適切な音量でプロトプラストを懸濁する。
2。葉プロトプラストのFACS
- RNAを抽出元となるプロトプラストをソートする場合、プロトプラストを還元剤（ 例えば 、β-メルカプトエタノール）を含む溶解緩衝液の少なくとも4つのボリュームに直接ソートする必要があります。また、単一試料のソート時間は、20〜30分であり、いずれかの時点で処理二から三のサンプルの最大値に制限されるべきである。
- ソートされたプロトプラストの可視化のために、プロトプラスト溶液の少なくとも8巻、その後プロトプラストを集中させる遠心分離によって収集に直接ソートする必要があります。
3。代表的な結果
このプロトコルは、蛍光活性化細胞選別（ 図1）のために使用されるシロイヌナズナの葉からプロトプラストを得るための方法を説明します。 RNaseおよび転写阻害剤の存在下におけるプロトプラストの生成は細胞fを防ぎromは転写応答をマウントする。これは、自家蛍光の有意水準を持っている多くの死者と瀕死プロトプラストを生じさせるの結果を持っていません。この方法を用いて調製したプロトプラストをソートする場合には、ソートに使用される580nmの対530nmの蛍光のグラフにはいくつかの異なる集団を参照することが非常に一般的です。このプロトコルに使用されるソートゲートと一緒にこのような例は、 図3に示します。
プロトプラスト溶液の8巻にソートされ、濃縮を確認するために可視化のために収集することができます。 図2Gは、これは孔辺細胞にGFPを発現TP382ラインを使用しての例を示しています。
増幅前と後の両方で、この方法を用いて得られた収量の例は、 表1に示されている。算定された金額は、オベーションピコWTAのシステム（500 PG-50 ng）を、したがって、sを用いて増幅するために十分である定量PCR（ 図4）は、次世代シーケンシングやマイクロアレイのいずれかの方法でubsequent分析。
図1実験の全体的なワークフロー。 1）収穫はシロイヌナズナラインをGFP発現から関心のある葉。 2）迅速に約1mm幅のストリップに切断し、直ちにprotoplasting溶液及び真空浸透させるにこれらを転送します。 3）3〜4時間インキュベートする。 4）70μmのふるいを通してゆっくりと濾過プロトプラスト溶液を遠心分離により底チューブ、ペレットプロトプラストを丸める移す。 5）すぐに選別、再懸濁するプロトプラストおよびフィルタは50μmを通じて選別チューブに移す前に。 6）並べGFP陽性およびGFP陰性の実行可能なプロトプラスト。 7）プロトプラストは今どちらか視覚的に分析したり、そのような定量PCR、次世代シーケンシングやマイクロアレイなどの技術を使用して設定できます。
図2本研究で使用したKC464、KC274とTP382行。向軸表皮にGFPの発現を示すKC464葉のA）の横断面。 B）のプロトプラストはKC464葉由来。血管系にGFPの発現を示すKC274葉のC）の横断面。 D KC274葉由来）プロトプラスト。孔辺細胞におけるGFPの発現を示すE）TP382の葉。 F）のプロトプラストは、TP382の葉に由来する。 TP382葉由来プロトプラストの高い530/low 580集団からプロトプラストを含むGFPを示し、葉の細胞の複雑な背景に孔辺細胞をGFP発現のFACSによって得られた濃縮のG）の例。 AF：共焦点顕微鏡画像、G：蛍光顕微鏡画像。画像内のスケールバーは50μmである。
図3 30分の580 nmの（オレンジ）対40分の530 nm（緑）バンドパスフィルタ（BDの流入のセルソーター）からの出力の典型的なFACS買収ドットプロット。示さソートゲートは通常、ソート時に使用されたものである。単一の低530/low 580人口を示す阻害剤の非存在下でprotoplasted COL-4葉由来プロトプラスト、、のA）ドットプロット。阻害剤によるストレスや着色のために580蛍光のシフトを示す阻害剤の存在下でprotoplasted重量COL-4葉由来プロトプラスト、AからB）ドットプロット。高530/low 580集団で集団を含むGFPを示す阻害剤の存在下でprotoplastedそれぞれKC74、KC464とTP382ライン、、、から葉由来プロトプラストからCE）のドットプロット。 GFP（高530/low 580）集団内のイベントのパーセンテージが与えられている。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
図4：図3に示すように、代表的なゲーテッド人口画分におけるGFP発現。複製し2つの生物学は、その後行われたGFP特異的プライマー（ 表2）を用いてオベーションピコWTAのシステムと定量PCRを用いて増幅し、各分画の種類が得られた。示された値は、最も高い（赤）、最低（緑）と平均相対値である。高580人口はこのケースでは2、低530/low 580と単一の生物学的replicateは、単一の値のみが表示されているので、使用されていたため高530/low 580に分割されました。 ACT2（At3g18780）は、すべてのサンプルのための標準として用いた。葉：葉全体。未ソート：ソートされていないプロトプラスト。 GFP1：高530/low 580とRest1：低530/low 580、GFP2：高530/high 580とRest2： 図3とインサートで説明したように、低530/high 580、。結果は、検証Oアールソートされた画分（ 例えば、 図2G）におけるGFP細胞含量のf光学評価。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
| サンプル | 葉数 | 細胞数 | RNAの収量 （NG） | RNAの収量 （増幅; NG） |
| 全体の葉 全葉B | 1 1 | - - | 8001 10525 | 4623 *** 4572 *** |
| ソートされていないプロトプラスト ソートされていないプロトプラストのB | 5 5 | - - | 2433 2625 | 1152年*** 3321 *** |
| GFP1 Rest1 | 15 | 6039（0.39％*） 55389（6.40％*） | - ** - ** | 861 489 |
| GFP1 B Rest1 B | 15 | 10783（0.63％*） 57040（7.49％*） | - ** - ** | 537 420 |
| GFP2 Rest2 | 15 | 18337（1.49％*） 62405（73.49パーセント*） | - ** - ** | 360 411 |
表1サンプルは、FACSを用いて収集し、ライブGFP発現プロトプラストを含有する画分を決定するために、定量PCRで分析した。またオベーションピコWTAシステム（NuGen）で増幅前後NGの総RNAの収量は、この表に含まれています。 GFP1、GFP2、Rest1とRest2画分を、 図4中の挿入で表示されます。総細胞ソート実行の細胞の*割合は分数のセルの数の横に括弧で与えられます。これらのパーセンテージはに相関していない収集レスト細胞のはるかに大きい数のためのGFP画分よりも早く停止したFACSの並べ替えなど、各サンプルのお互いが '休息'分数のために実行されます。製造元のプロトコールに従って増幅反応への入力として使用** 50 NG、。
| プライマー | シーケンス |
| mGFP5-ER.fw | GCCTGAGGGATACGTGCAGGAGA |
| mGFP5-ER.rv | TGGCGGGTCTTGAAGTTGGCT |
| ACT2.fw | GCCATCCAAGCTGTTCTCTC |
| ACT2.rv | GCCATCCAAGCTGTTCTCTC |
表2定量PCRプライマー。
Discussion
我々は、プロトプラストの生成およびFACSを使用して後続の細胞選別のための葉にGFPを発現するシロイヌナズナ植物の使用を可能にする方法を説明してきました。この方法は、定量PCRやマイクロアレイのどちらかによって増幅、したがってその後の分析に使用するRNAの十分な量が得られます。ソートされた画分を、高度として定量PCR（ 図2）によって実証GFP含有細胞が濃縮されています。
葉片が阻害剤含有プロトプラスト溶液を真空に潜入されるまで生きてプロトプラストの高い収率を達成するには、手順の最初のステップの間に急速に働くことが重要です。また、1ミリメートルの葉片を生成するときに、これは過度の損傷、したがって低いプロトプラスト収量につながるとして、葉ではなく 'チョップ'やマッシュにスライスまたはカットすることが非常に重要です。
ここで説明した方法と他publisheの決定的な違いdの方法はRNase阻害剤や転写阻害剤の使用です。ほとんどのメソッドは、プロトプラストをより簡単に生成することができ、そこからシロイヌナズナの根のために開発されています。しかし、肉を除いて、葉を扱うとき、それはプロトプラストの生成時間を増加させる必要がある。したがってプロトプラストの生成処理自体（データは示していない）の結果として、遺伝子発現の変化から守るために、これらの阻害剤を含めることが重要です。しかし、阻害剤の存在は、ストレスに対抗すると可塑性の喪失にこのリード線などのプロトプラストが受けやすくなる可能性のあるもの、オンまたはオフの遺伝子を切り替えることにより、どちらかの、転写応答をマウントすることができないことにつながる手順をprotoplasting。
我々はGFP発現シロイヌナズナライン数で正常ここで説明した方法を使用している。重要なのは、我々はどちらかに強くGFPを発現するGFPの行でこのメソッドを使用している核、またははるかに弱くnon-localized/diffuse細胞質方法では、ここで使用されてKC464とKC274線の場合と同様です。回線の両方の型は、メソッドと互換性があり、GFP発現プロトプラスト（ 図2および3）の高濃縮画分を得ることができます。フルオロフォアは、生きた細胞を選択する能力を維持するために死んだ/死細胞の自家蛍光とは著しく異なる蛍光を選択しなければなりませんが、方法は簡単、他のフルオロフォアに適合させることができる。
Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
細胞型と発達段階特有のプロファイリングにブキャナン-ウォラストンラボでの作業は、欧州委員会の第 6次フレームワークProgammeにおけるアグロ-OMICSプロジェクト（グラント＃LSHG-CT-2006から037704）によってサポートされています。細胞型に特異的なプロファイリングのギフォード·ラボでの作業はBBSRC新治験助成（BB/H019502/1）によってサポートされています。
KC274とKC464 シロイヌナズナラインはAAR·ウェッブ（ケンブリッジ大学）から得た。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cellulase R-10 | Melford | C8001 | |
| Cellulase RS | Melford | C8003 | |
| Macerozyme R-10 | Melford | M8002 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3912 | |
| ProtectRNA | Sigma-Aldrich | R7397 | |
| Actinomycin D | Sigma-Aldrich | A1410 | |
| 70 μm cell strainer | Fisher | FB35181 | |
| 50 μm filcon cup-type filters | BD Biosciences | 340630 |
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