Summary
的制造方法
Abstract
叶原基开始后，生物量积累主要由控制在叶片1的细胞的增殖和扩展。然而， 拟南芥叶片是由许多不同的细胞类型和几种结构的一个复杂的器官。同时在不同的发展阶段，越来越多的叶所含的细胞，细胞的最远的从叶柄第一个停止膨胀，并接受衰老1。因此，不同的细胞内叶划分，延长或差分活跃，压力或死亡和/或刺激的子集，它们的细胞类型在任何一个时间。这使得人类基因组研究的叶具有挑战性的：例如，当从全叶，信号从遗传网络操作在不同的细胞反应区或细胞类型表达数据分析将被混淆，导致所产生的一个不准确的更新。
为了解决这个问题，S已经描述了许多研究的方法，使细胞特异性基因表达的研究。这些包括激光捕获显微切割（LCM）2或表达GFP的植物用于原生质体的产生和随后的荧光激活细胞分选术（FACS）3,4，最近描述INTACT系统的核沉淀5和免疫沉淀的多聚核糖体6。
FACS已成功地使用了一些研究，包括示出小区标识和从根端部的距离，有一个显着的效果的大量的基因3,7上的表达谱。 FACS的GFP线也被用来证明在根氮反应和侧根发育8，盐胁迫9生长素在根10中分布的细胞特异性转录调控和创建的的拟南芥茎端分生组织11的基因表达的地图。虽然FACS以前被用来排序拟南芥叶片原生质体培养的自体荧光12,13，到目前为止，使用流式细胞仪在叶片中表达绿色荧光蛋白基因株系已经非常有限。4。在下面的协议中，我们描述了一种方法用于获得拟南芥叶片原生质体，用FACS兼容的原生质体生成机制的影响，同时最大限度地减少。我们证明了使用KC464的拟南芥线，其中表达GFP的表皮14，KC274线，在血管组织14和的TP382 拟南芥线，其中表达GFP表达双GFP构建体链接到一个核定位信号的方法保卫细胞（数据未示出， 图2）。目前，我们正在用这种方法来研究在不同阶段的衰老的细胞类型特异性表达在开发过程中的压力，以及异质细胞群。
Protocol
1。原生质体生成
- 收获叶材料和切成1毫米宽的条带（ 图1）用剃刀刀片。对于含有较多的比单叶到15叶的样品可以容易地在切割之前层叠。
- 马上转移叶条到一个9厘米的圆形培养皿中含有20毫升溶液（400mM甘露醇，20mM的MES水合物，20 mM KCl中的10mM的CaCl 2，2毫摩尔MgCl 2，0.1％BSA和2.5mMβ-巯基乙醇， pH 5.7）中，包括原生质体的酶（1.2％纤维素酶R-10，0.6％纤维素RS和0.4％离析酶R-10）和RNase和转录抑制剂（1×ProtectRNA和10微克/毫升放线菌素D），轻轻分开叶条和真空渗透为2×5分钟。
- 广场上的陪替氏培养皿轨道摇床设置到第90转每分钟，在室温下和原生质体为3-4小时。
- 在温育的叶条应彼此分开的，通过使用一个平镊子，在半小时的时间间隔。
- 放置一个70μm的细胞过滤网（Fisher Scientific）的在50毫升的试管中，并轻轻的原生质体溶液通过过滤。这将删除的叶条，将保留筛，同时使原生质体去。
- 叶洗净条用4毫升溶液A，轻轻地通过相同的筛过滤。
- 将原生质体转移到圆底管和离心处理，以使在300×g离心5分钟以沉淀的原生质体的原生质体溶液。
- 轻轻抽吸作为不干扰的原生质体的情况下尽可能多的上清液。
- 洗净的原生质体，用5毫升溶液A，在300×g离心5分钟离心。除去上清液
- 重悬的原生质体在适当体积的溶液A中 ，使用巴斯德吸管或一个截止P1000小费的。
2。 FACS的叶片原生质体
- 进行排序时，从该RNA将被提取的原生质体，原生质体应直接分拣到至少4倍体积的含有还原剂（ 如 β-巯基乙醇）的裂解缓冲液。此外，对单个样品的排序时间应限制在20-30分钟，并在任何一个时间内处理的和最多两至三个样本。
- 用于可视化排序的原生质体，将原生质体应直接排序条件到至少8体积的溶液A和其后通过离心收集集中的原生质体。
3。代表性的成果
此协议描述了一种用于获得用于荧光激活细胞分选（ 图1），这是用来从拟南芥叶原生质体的方法。的存在下的原生质体产生的核糖核酸酶和转录抑制剂防止细胞fROM安装转录反应。这确实有许多死亡和垂死的原生质体，它有一个显着的自体荧光引致的后果。进行排序时，用这种方法制备的原生质体，因此，它是非常普遍地看到在580纳米 - 530 nm荧光曲线用于排序的图形的几个不同的种群。这方面的例子，连同在该协议中使用的分配门，在图3中所示。
原生质体可以排序成8倍体积的溶液A和收集用于可视化验证的富集。 图2G示出了一个这样的例子，使用的的TP382行，在保卫细胞中表达的GFP。
使用这种方法，两个前和扩增后的产率的实施例，示于表1。得到的金额是足够的Ovation微微WTA系统（500 PG-50毫微克），因此小号扩增ubsequent由任定量PCR分析（ 图4），：下一代测序或微阵列。
图1为实验的整体工作流程。 1）收获GFP的表达拟南芥叶兴趣。 2）快速切入〜1毫米宽的长条，并立即转移到原生质体的解决方案和真空渗透。 3）孵育3-4小时。 4）轻轻滤液原生质体解决方案，通过70筛，转移到圆底离心管和球团原生质体。 5）选前立即，重悬原生质体转移到排序管通过50微米的过滤器。 6）排序GFP阳性和的GFP负可行的原生质体。 7）原生质体现在可以进行分析，无论是视觉上或使用，如定量PCR技术，新一代测序或芯片。
图2。KC464，KC274和TP382本研究中所用的线。 A）的横截面的KC464叶的GFP表达在表皮。 B）原生质体衍生从KC464叶。 C）的横截面的KC274叶的GFP表达在血管。 D）原生质体来自KC274叶。 E）TP382叶保卫细胞中的GFP表达。 F）原生质体衍生从TP382叶。 G）例通过流式细胞仪的GFP表达的复杂背景下的叶细胞，保卫细胞中GFP含有原生质体的高530/low 580人口的从TP382叶原生质体衍生的富集。 AF：共焦显微镜图像; G：荧光显微镜图像。图像内的比例尺是50微米。
图3。典型的的FACS收购点图的输出从580/30纳米（橙色） -四十零分之五百三十nm（绿色）带通滤波器（BD涌入细胞分选仪）。的排序是那些通常用于在排序的门。 A）的点图上校-4叶衍生的原生质体，抑制剂的情况下，在原生质体，示出一个单一的低530/low 580人口。 B）的点图（重量）衍生上校-4叶原生质体，原生质体的抑制剂的存在下，示出了在580荧光移位由于压力和着色抑制剂。 CE）点图从叶派生原生质体KC74 KC464和TP382线，分别，抑制剂的存在下，在原生质体，示出了GFP包含在高530/low 580种群的种群。的事件在GFP（高530/low 580）人口的百分比。 点击这里查看大图 。
图4代表，如在图3中所示的门控人口馏分中的GFP表达。两个生物复制得到的各馏分的类型，使用GFP特异的引物（ 表2），然后进行使用的的Ovation微微WTA系统和qPCR扩增。所给出的值是最高的（红色），最低（绿色）和平均相对值。在这种情况下，高580人口一分为二，低530/low 580和高530/low的580，一个单一的生物复制使用只有单一的价值。 ACT2（At3g18780）使用所有的样品作为标准。叶：全叶。未分类的：未排序的原生质体。 GFP1：580和高530/low Rest1：低530/low 580，GFP2的：高530/high 580和Rest2：低530/high 580，如在图3和插入描述。结果是验证ØF光学评估GFP单元格内容的的排序分数（ 例如， 图2G）。 点击此处查看大图 。
| 样品 | 叶片数 | 细胞的数目 | RNA产量 （NG） | RNA产量 （放大;纳克） |
| 全叶甲 整个叶片B | 1 1 | - - | 8001 10525 | 4623 *** 4572 *** |
| 未分类的原生质体阿 未分类的原生质体乙 | 5 5 | - - | 2433 2625 | 1152 *** 3321 *** |
| GFP1一个 Rest1一个 | 15 | 6039（0.39％*） 55389（6.40％*） | - ** - ** | 861 489 |
| GFP1乙 Rest1乙 | 15 | 10783（0.63％*） 57040（7.49％*） | - ** - ** | 537 420 |
| GFP2 Rest2 | 15 | 18337（1.49％*） 62405（73.49％*） | - ** - ** | 360 411 |
表1。样品收集，使用流式细胞仪和定量PCR，以确定哪部分包含现场表达GFP的原生质体进行分析。还包括本表中的总RNA产量，吴前和扩增后，采用Ovation微微WTA系统（NuGen）的。所有的馏分GFP1，GFP2的，Rest1和Rest2如在图4中所示的插入件。 *百分比细胞的总细胞排序运行的是，给定的括号中旁边的馏分中的细胞数。这些百分比是不相关的每个样品彼此的FACS排序运行“休息”部分早于由于更大数量的休息细胞的绿色荧光蛋白组分。 * 50纳克作为输入用于扩增反应，为制造商的协议。
| 入门 | 序列 |
| mGFP5-ER.fw | GCCTGAGGGATACGTGCAGGAGA |
| mGFP5-ER.rv | TGGCGGGTCTTGAAGTTGGCT |
| ACT2.fw | GCCATCCAAGCTGTTCTCTC |
| ACT2.rv | GCCATCCAAGCTGTTCTCTC |
表2中。qPCR检测。
Discussion
我们已经介绍了一种方法，使拟南芥的植物表达GFP的叶片原生质体生成和随后的细胞分选，使用流式细胞仪的使用。此方法产生足够量的RNA扩增，因此，随后的分析可用于定量PCR或芯片。排序的馏分高度富集含GFP-细胞，如通过qPCR证明（ 图2）。
为了达到高收率的活原生质体，它是至关重要的快速工作的程序的初始步骤期间，直到叶子条已经与含抑制剂的原生质体溶液真空渗入。此外，当生成1毫米叶条带，这是非常重要的切片或切叶而不是'印章'或捣烂他们，因为这会导致过多的损害和因此使用较低的原生质体产率。
一个关键的区别的方法描述在这里和其他Publishe公司ð方法是使用的RNase抑制剂和转录抑制剂。大多数方法拟南芥根系发达，从原生质体可以更容易地生成。然而，当工作用树叶，除了叶肉，它是必要增加的原生质体生成时间。因此，重要的是要防止基因表达的变化，作为结果的原生质体生成治疗本身（数据未示出），包括这些抑制剂。然而，抑制剂的存在下，会导致无法装入一个转录反应，或者通过切换，因为这会导致损失的可塑性，用以对付的应力影响的基因开启或关闭，这是有可能使原生质体更容易受到原生质体的过程。
我们已经使用这里描述的方法成功地与一些表达GFP的拟南芥线。更重要的是，我们已经使用了这种方法与GFP表达GFP，无论是强烈核，或更弱在一个non-localized/diffuse胞浆的方式，是与这里所使用的KC464和KC274线的的情况下。这两种类型的行是兼容的方法和得到的高度富集的馏分表达GFP的原生质体（ 图2和3）。该方法可以很容易地适合于其它荧光基团的荧光团，虽然必须选择是显着不同的死/死亡的细胞，以保存的能力来选择活细胞的自发荧光的荧光。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
，由AGRON组学项目（拨款＃LSHG-CT-2006-037704），欧盟委员会在的框架化计划“的第 6，细胞类型和发展阶段的具体分析在布坎南沃拉斯顿实验室的工作是支持的。工作的吉福德实验室中细胞类型的具体分析是支持的的BBSRC研究者补助金（BB/H019502/1）的。
的KC274和KC464 拟南芥的线条得到了从AAR韦伯（剑桥大学）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cellulase R-10 | Melford | C8001 | |
| Cellulase RS | Melford | C8003 | |
| Macerozyme R-10 | Melford | M8002 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3912 | |
| ProtectRNA | Sigma-Aldrich | R7397 | |
| Actinomycin D | Sigma-Aldrich | A1410 | |
| 70 μm cell strainer | Fisher | FB35181 | |
| 50 μm filcon cup-type filters | BD Biosciences | 340630 |
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