Summary
Способ получения
Protocol
1. Протопластов поколения
- Урожай материала листьев и нарезать шириной 1 мм полосы (рис. 1) с лезвием бритвы. Для образцов, содержащих более одного листа до 15 листьев может быть легко сложены перед нарезкой.
- Немедленно передать листа полос, на 9 см круглой чашки Петри, содержащую 20 мл раствора (400 мМ маннит, 20 мМ MES гидрат, 20 мМ KCl, 10 мМ CaCl 2, 2 мМ MgCl 2, 0,1% BSA и 2,5 мМ β-меркаптоэтанол, рН 5,7) в том числе protoplasting ферментов (1,2% целлюлозы R-10, 0,6% целлюлозы RS и 0,4% macerozyme R-10) и РНКазы и транскрипционной ингибиторов (1 × ProtectRNA и 10 мкг / мл актиномицина D); аккуратно отделить листья полосы и вакуум проникают в течение 2 × 5 мин.
- Место чашку Петри на орбитальном шейкере установлена на 90 мин при комнатной температуре и протопластов в течение 3-4 часов.
- Во время инкубации листьев полоски должны быть отделены друг от друга, путем использованияНабор плоский пинцет, через каждые полчаса.
- Поместите 70 мкм ячейки фильтра (Fisher Scientific) в 50 мл трубки и осторожно фильтрации раствора через protoplasting. Это позволит удалить листья полосы, которая будет храниться в сито, позволяя протопластов, чтобы пройти.
- Промойте листья полос с 4 мл раствора и осторожно процедить через сито же.
- Передача протопластов в круглых труб дно и центрифуги протопластов решение при 300 мкг в течение 5 мин для осаждения протопластов.
- Аккуратно аспирации от, как большая часть супернатанта насколько это возможно без нарушения протопластов.
- Вымойте протопластов с 5 мл раствора и центрифуги при 300 мкг в течение 5 мин. Удалить супернатант
- Ресуспендируют протопластов в соответствующий объем раствора с помощью пипетки Пастера или отсечения P1000 чаевых.
2. FACS из листьев Протопласты
- При сортировке протопласты, из которых РНК будут извлечены, протопласты должны быть отсортированы непосредственно в меньшей мере, 4 объемов лизис буфера, содержащего восстановитель (например, β-меркаптоэтанол). Кроме того, сорт время одного образца должно быть ограничено 20-30 мин, а максимальный от двух до трех образцов обрабатываются в любой момент времени.
- Для визуализации отсортированы протопластов, протопласты должны быть отсортированы непосредственно в меньшей мере, 8 объемы раствора, а затем собирают центрифугированием сосредоточиться протопластов.
3. Представитель Результаты
Этот протокол описывает метод получения протопластов из листьев Arabidopsis, которые используются для флуоресценции активирован сортировки клеток (рис. 1). Протопластов поколения в присутствии РНКазы и транскрипционной ингибиторов предотвращает клетки FROM монтажа транскрипционный ответ. Это имеет следствием породив множество мертвых и умирающих протопласты, которые имеют значительный уровень автофлуоресценции. При сортировке протопластов подготовлен с помощью этого метода поэтому очень часто можно увидеть несколько различных популяций в графиках 580 нм против 530 нм флуоресценции используется для сортировки. Примеры этого, вместе с сортировкой ворота, используемые в настоящем протоколе показано на рисунке 3.
Протопласты могут быть отсортированы в 8 томах решения и собрали для визуализации проверить обогащения. Рис 2G показан пример использования этой TP382 линии, которая выражает GFP в замыкающих клеток.
Примеры выходы, полученные с помощью этого метода, как до, так и после усиления, приведены в таблице 1. Суммы, полученные достаточным для амплификации с использованием Ovation Pico WTA системы (500 PG-50 нг) и, следовательно, сubsequent анализа либо КПЦР (рис. 4), следующая последовательность поколения или микрочипов.
Рисунок 1. Общий рабочий процесс для эксперимента. 1) урожай листьев интерес GFP выражение Arabidopsis линии. 2) быстро разрезать на ~ 1 мм шириной полосы и немедленно передать их в protoplasting решения и вакуумные инфильтрата. 3) инкубируют в течение 3-4 часов. 4) Аккуратно фильтрата протопластов раствор через сито 70 мкм, трансфер в круглое дно трубы и гранул протопластов путем центрифугирования. 5) Непосредственно перед сортировкой, ресуспендируют протопластов и передачи сортировки трубку, через 50 мкм фильтр. 6) Сортировка GFP положительные и отрицательные GFP жизнеспособных протопластов. 7) Протопласты теперь могут быть проанализированы визуально или с использованием таких методов, как КПЦР, следующего поколения секвенирования или микрочипов.
Рисунок 2. KC464, KC274 и TP382 линии, используемые в этом исследовании. A) Поперечное сечение KC464 листа показывает GFP выражение в адаксиальной эпидермиса. B) протопластов, полученных от KC464 листьев. C) Поперечное сечение KC274 листа показывает GFP выражение в сосудах. D) протопластов, полученных от KC274 листьев. E) TP382 листа показывает GFP выражение в замыкающих клеток. F) протопластов получены из TP382 листьев. G) Пример обогащения получено FACS из GFP выражение замыкающих клеток в сложном фоне листьев клетки, показывая, содержащих GFP протопластов с высокой 530/low 580 населения протопласты, полученные из TP382 листьев. AF: конфокальной микроскопии изображений; G: флуоресцентный микроскоп изображение. Шкала баров в пределах изображения 50 мкм.
Рисунок 3. Типичная приобретение FACS точка участков выходом из 580/30 нм (оранжевый) по сравнению с 530/40 нм (зеленый) полосового фильтра (BD приток клетки сортировщика). Сортировка ворота указаны те, которые обычно используются во время сортировки. A) Dot участок Col-4 листа, полученные протопласты, protoplasted в отсутствие ингибиторов, показывая одну низкую 530/low 580 населения. B) Dot участке от мас Col-4 листа, полученные протопласты, protoplasted в присутствии ингибиторов, показывая сдвиг в 580 флуоресценции из-за стресса и окрашивания ингибиторов. CE) Dot участков из листьев, полученные из протопластов KC74, KC464 и TP382 линий, соответственно, protoplasted в присутствии ингибиторов, показывая GFP содержащих населения в высоком 530/low 580 населения. Проценты от событий в GFP (высокая 530/low 580) населению даны. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Рисунок 4. GFP выражение в закрытом представитель фракции населения, как показано на рисунке 3. Два биологических повторяет были получены для каждой фракции типа, усиливается использование Ovation Pico WTA системы и КПЦР использованием GFP-специфических праймеров (табл. 2) Затем был проведен. Значения показали самый высокий (красный), низкий (зеленый) и средние относительные значения. Высокая 580 населения в этом случае разделен на две части, низкий 530/low 580 и высокой 530/low 580, для которого одного биологического повторных была использована таким образом, только одно значение показано на рисунке. ACT2 (At3g18780) был использован в качестве стандарта для всех образцов. Лист: весь лист. Разное: Unsorted протопластов. GFP1: высокая 530/low 580 и Rest1: низкая 530/low 580, GFP2: высокая 530/high 580 и Rest2: низкая 530/high 580, как указано на рисунке 3 и вставки. Результаты проверки оF оптических оценки GFP содержимого ячейки в отсортированном фракций (например, 2G рисунок). Нажмите, чтобы увеличить показатель .
| Образец | Количество листьев | Количество клеток | РНК выход (НГ) | РНК выход (С усилителем; нг) |
| Всего листа Всего B листьев | 1 1 | - - | 8001 10525 | 4623 *** 4572 *** |
| Unsorted протопласты Unsorted B протопласты | 5 5 | - - | 2433 2625 | 1152 *** 3321 *** |
| GFP1 Rest1 | 15 | 6039 (0.39% *) 55389 (6.40% *) | - ** - ** | 861 489 |
| GFP1 B Rest1 B | 15 | 10 783 (0,63% *) 57 040 (7,49% *) | - ** - ** | 537 420 |
| GFP2 Rest2 | 15 | 18 337 (1,49% *) 62 405 (73,49% *) | - ** - ** | 360 411 |
Таблица 1. Пробы, взятые использованием FACS и проанализированы с КПЦР чтобы определить, какая фракция содержала живые GFP-экспрессирующих протопластов. Кроме того, в этой таблице является общим выходом РНК в нг до и после усиления с Ovation Pico WTA System (NuGen). GFP1, GFP2, Rest1 и Rest2 фракции, как показано на вставке на рисунке 4. * Процент клеток от общей операции сортировки ячейки в скобках возле числа клеток во фракции. Эти показатели не коррелируют сдруг с другом для каждого образца, как рода FACS работает для фракции "отдых" были остановлены раньше, чем для GFP фракции из-за гораздо большего числа клеток, собранных отдыха. ** 50 нг использоваться как входные данные для реакции амплификации, в соответствии с протоколом производителя.
| Грунтовка | Последовательность |
| mGFP5-ER.fw | GCCTGAGGGATACGTGCAGGAGA |
| mGFP5-ER.rv | TGGCGGGTCTTGAAGTTGGCT |
| ACT2.fw | GCCATCCAAGCTGTTCTCTC |
| ACT2.rv | GCCATCCAAGCTGTTCTCTC |
Таблица 2. КПЦР праймеров.
Discussion
Мы описали метод, который позволяет использовать Arabidopsis растений, экспрессирующих GFP в листьях для генерации протопластов и последующей сортировки клеток с использованием FACS. Этот метод дает достаточного количества РНК, которые будут использоваться для усиления и поэтому последующий анализ либо КПЦР или микрочипов. Фракции отсортированы высоко обогащенные для GFP-содержащие клетки, как показали КПЦР (рис. 2).
Для достижения высоких урожаев живой протопластов важно работать быстро в течение первых шагов процедуры, пока листья полосы были вакуум проникли с ингибитором содержащих протопластов решение. Кроме того, при создании 1 полосы мм листа очень важно, чтобы нарезать или вырезать листья, а не «отбивную» или пюре из них, так как это приводит к чрезмерному повреждению и, следовательно, более низкую доходность протопластов.
Существенная разница между методом, описанным здесь и другие publisheг методов является использование ингибитора РНКазы и транскрипционной ингибиторов. Большинство методов разработаны для Arabidopsis корней, от которых протопласты могут быть получены более легко. Тем не менее, при работе с листьями, за исключением мезофилла, необходимо увеличить время протопластов поколения. Поэтому важно, чтобы включить эти ингибиторы для защиты от изменения в экспрессии генов в результате лечения протопластов поколение само по себе (данные не представлены). Тем не менее, наличие ингибиторов приводит к невозможности установить транскрипции ответа, либо путем переключения генов или выключить, которая, вероятно, чтобы сделать протопластов более уязвимы, так как это приводит к потере пластичности, с которыми по борьбе с напряжениями protoplasting процедуры.
Мы использовали метод, описанный здесь успешно число GFP-экспрессирующих Arabidopsis линий. Важно отметить, что мы использовали этот метод с GFP линий, экспрессирующих GFP либо сильно вядро, или гораздо более слабо в non-localized/diffuse цитозольного образом, как и в случае с KC464 и KC274 линии, используемые здесь. Оба типа линий совместимы с методом и получением обогащенного доли GFP-экспрессирующих протопластов (рис. 2 и 3). Этот метод может быть легко адаптирована к другим флуорофоры, хотя флуорофора должны быть выбраны для флуоресценции, что существенно отличается от аутофлюоресценции мертвых / умирающие клетки для того, чтобы сохранить возможность выбора живых клеток.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Работа в Бьюкенен-Волластон лаборатории по камерного типа и стадии развития конкретных профилей при поддержке Агрон-омик проекта (грант № LSHG-CT-2006-037704) в 6-й Рамочной Progamme Европейской комиссии. Работа в лаборатории Гиффорд по камерного типа конкретных профилей поддерживается BBSRC новый следователь гранта (BB/H019502/1).
KC274 и KC464 Arabidopsis линии были получены из AAR Уэбб (Кембриджский университет).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cellulase R-10 | Melford | C8001 | |
| Cellulase RS | Melford | C8003 | |
| Macerozyme R-10 | Melford | M8002 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3912 | |
| ProtectRNA | Sigma-Aldrich | R7397 | |
| Actinomycin D | Sigma-Aldrich | A1410 | |
| 70 μm cell strainer | Fisher | FB35181 | |
| 50 μm filcon cup-type filters | BD Biosciences | 340630 |
References
- Efroni, I., Eshed, Y., Lifschitz, E. Morphogenesis of Simple and Compound Leaves: A Critical Review. Plant Cell. 22, 1019-1032 (2010).
- Kleber, R., Kehr, J. Preparation and Quality Assessment of RNA From Cell-Specific Samples Obtained by Laser Microdissection. Methods Mol. Biol. 323, 367-377 (2006).
- Birnbaum, K., Shasha, D. E., Wang, J. Y., Jung, J. W., Lamberts, G. M., Galbraith, D. W., Benfey, P. N. A Gene Expression Map of the Arabidopsis root. Science. 302, 1956-1960 (2003).
- Warnasooriya, S. N., Montgomery, B. L. Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (39), e1925 (2010).
- Beal, R. B., Henikoff, S. A Simple Method For Gene Expression and Chromatin Profiling of Individual Cell Types Within a Tissue. Dev. Cell. 18, 1030-1040 (2010).
- Mustroph, A., Zanetti, M. E., Jang, C. J. H., Holtan, H. E., Repetti, P. P., Galbraith, D. W., Girke, T., Bailey-Serres, J. Profiling translatomes of discrete cell populations resolves altered cellular priorities during hypoxia in Arabidopsis. PNAS. 106, 18843-18848 (2009).
- Brady, S. M., Orlando, D. A., Lee, J. Y., Wang, J. Y., Koch, J., Dinneny, J. R., Mace, D., Ohler, U., Benfey, P. N. Dominant Root Expression Patterns Revealed in a High-Resolution Spatiotemporal Expression Map. Science. 318, 801-806 (2007).
- Gifford, M. L., Dean, A., Gutierrez, R. A., Coruzzi, G. M., Birnbaum, K. D. Cell-specific nitrogen responses mediate developmental plasticity. PNAS. 105, 803-808 (2008).
- Dinneny, J. R., Long, T. A., Wang, J. Y., Jung, J. W., Mace, D., Pointer, S., Barron, C., Brady, S. M., Schiefelbein, J., Benfey, P. N. Cell identity mediates the response of Arabidopsis roots to abiotic stress. Science. 320, 942-945 (2008).
- Peterson, S. V., Johansson, A. I., Kowalczyk, M., Makoveychuk, A., Wang, J. Y., Moritz, T., Grebe, M., Benfey, P. N., Sandberg, G., Ljung, K. An Auxin Gradient and Maximum in the Arabidopsis Root Apex Shown by High-Resolution Cell-Specific Analysis of IAA Distribution and Synthesis. Plant Cell. 21, 1659-1668 (2009).
- Yadav, R. K., Girke, T., Pasala, S., Xie, M., Reddy, G. V. Gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem stem cell niche. PNAS. 106, 4941-4946 (2009).
- Harkins, K. R., Jefferson, R. A., Kavanagh, T. A., Bevan, M. W., Galbraith, D. W. Expression of photosynthesis-related gene fusions is restricted by cell type in transgenic plants and in transfected protoplasts. PNAS. 87, 816-820 (1990).
- Yang, Y., Costa, A., Leonhardt, N., Siegel, R. S., Schroeder, J. I. Isolation of a strong Arabidopsis guard cell promoter and it's potential as a research tool. Plant Methods. 4, 6 (2008).
- Gardner, M. J., Baker, A. J., Assie, J. -M., Poethig, R. S., Haseloff, J. P., Webb, A. A. R. GAL4 GFP enhancer trap lines for analysis of stomatal guard cell development and gene expression. J. Exp. Bot. 60, 213-226 (2009).
