Summary
생산하기위한 방법
Abstract
잎 primordium의 개시 후, 바이오 매스 축적은 주로 세포 증식과 잎 1 확장에 의해 제어됩니다. 그러나, Arabidopsis 잎은 다양한 세포 유형과 여러 구조로 구성 복잡한 기관이다. 동시에 성장하는 잎은 확장을 중단하고 노화 1 받아야 할 첫 번째되는 잎자루에서 먼 세포로, 개발의 여러 단계에서 세포를 포함하고 있습니다. 잎 내의 다른 세포는 따라서 나누어 elongating 또는 구별되며, 적극적인 스트레스 나 죽어, 및 / 또는 한 번에 자신의 세포 유형의 하위 세트의 자극에 반응. 이것은 잎 도전의 게놈 연구를합니다 : 예를 들어 서로 다른 세포 반응 영역 또는 셀 유형에서 작동 유전자 네트워크에서 전체 잎, 신호의 표현 데이터를 분석 할 때 실마리를 못 찾고됩니다 생성 된 부정확 한 프로필에서 결과.
이 문제를 해결하려면, Several 방법은 세포 특정 유전자 발현 연구를 활성화하는 설명되어 있습니다. 이러한 레이저 캡처 microdissection (LCM) 2 또는 원형질 생성 및 후속 형광 활성화 셀 정렬 (FACS) 3,4, 핵 강수량 5 polysomes 6 immunoprecipitation의 최근 설명 그대로 시스템에 사용되는 GFP 표현 식물이 포함되어 있습니다.
FACS이 성공적으로 루트 팁에서 셀 정체성과 거리가 유전자 3,7 다수의 표현의 프로필에 큰 효과가 있다는 표시 등의 연구 숫자에 사용되었습니다. GFP 라인의 FACS는 루트 질소 반응 및 측면 루트 개발 8, 소금 스트레스 루트 10 9 옥신 분포 동안 세포 특정 전사 조절을 설명하고 Arabidopsis 촬영 꼭대기 분열 조직 (11)의 유전자 발현지도를 생성하는 데 사용되었습니다. 이기는하지만FACS는 이전에 autofluorescence 12,13에 따라 Arabidopsis 잎 파생 protoplasts을 정렬하는 데 사용되었습니다 잎에 GFP를 표현 Arabidopsis 줄에 FACS의 지금까지 사용 4 매우 제한된있다. 다음과 같은 프로토콜에서 우리는 원형질 생성 정권의 영향을 최소화하면서 FACS와 호환되는 Arabidopsis 잎 protoplasts를 획득하는 방법을 설명합니다. 우리는 혈관 조직 14 TP382 Arabidopsis 라인에 명시 GFP는 두 GFP를 표현 adaxial 표피 14 KC274 라인에 명시 GFP가의 핵 지방화 신호에 연결된 개념 KC464 Arabidopsis 라인을 사용하는 방법을 보여줍니다 경비 세포 (데이터 표시되지 않습니다, 그림 2). 현재 노화의 여러 단계에서 두 세포 유형의 개발과 스트레스 기간 동안 특정 표현뿐만 아니라 이기종 셀 인구를 공부하기 위해이 방법을 사용하는.
Protocol
1. 원형질 세대
- 면도날과 1mm 폭 스트립 (그림 1)에 수확 잎 자료와 컷. 최대 15 잎에 하나의 잎보다 더 많은을 포함하는 샘플은 쉽게 절단하기 전에 스택 할 수 있습니다.
- 즉시 20 ML 솔루션을 포함 9cm 원형 페트리 접시에 잎 조각을 전송 (400 MM 마니 톨, 20 MM MES 하이드레이트, 20 MM KCl, 10 MM CaCl 2, 2 MM MgCl 2, 0.1 % BSA와 2.5 MM β-메르 캅토 에탄올, protoplasting 효소 (1.2 % 셀룰로오스 R-10, 0.6 % 셀룰로오스 RS와 0.4 % macerozyme R-10)와 RNase와 전사 억제제 (1 × ProtectRNA 10 μg / ML Actinomycin D) 등의 pH를 5.7)는, 부드럽게 잎 스트립을 분리하고 2 × 5 분에 침투 해를 진공 청소기.
- 궤도 셰이커에 장소 페트리 접시 3-4 시간을위한 공간 온도와 원형질 90 RPM으로 설정합니다.
- 부화 동안 잎 스트립은 사용하여 서로 구분되어야합니다이분의 일 매시간 간격으로, 평면 핀셋으로 설정합니다.
- 50 ML 튜브에 70 μm 셀 스트레이너 (피셔 과학)를 놓고 살짝 통해 protoplasting 솔루션을 필터링합니다. 이 protoplasts이 통과 할 수 있도록하면서 체에 의해 유지 될 잎 스트립을 제거합니다.
- 4 ML 솔루션 같은 체를 통해 조심스럽게 필터와 잎 스트립을 씻는다.
- 둥근 바닥 튜브에 protoplasts를 전송하고 펠릿 protoplasts 5 분 300 XG에서 원형질 솔루션을 원심 분리기.
- 부드럽게 protoplasts을 방해하지 않으면 서 많은 표면에 뜨는의 최대한을 대기음.
- 5 분 300 XG에서 5 ML 솔루션 및 원심 분리기로 protoplasts을 씻는다. 표면에 뜨는 제거
- 파스퇴르 피펫 또는 컷 - 오프 P1000 팁을 사용하여 솔루션의 적절한 볼륨에 protoplasts을 Resuspend.
2. 리프 Protoplasts의 FACS
- RNA가 추출됩니다있는 protoplasts를 정렬 할 때 protoplasts은 환원제를 포함하는 용해 버퍼의 최소 4 볼륨 (예 : β-메르 캅토 에탄올)에 직접 정렬해야합니다. 또한, 단일 샘플의 정렬 시간이 20-30 분,하고 한 번에 처리 2-3 샘플 최대로 제한해야합니다.
- 정렬 protoplasts의 시각화를 들어, protoplasts는 솔루션의 최소한 8 권과 이후 protoplasts을 집중 원심 분리에 의해 수집에 직접 정렬해야합니다.
3. 대표 결과
이 프로토콜은 형광 활성화 세포 정렬 (그림 1)에 사용되는 Arabidopsis 잎에서 protoplasts을 얻기위한 방법을 설명합니다. RNase와 전사 억제제의 존재의 원형질를 생성 세포 (F)를 방지ROM이 전사 응답을 장착. 이 autofluorescence의 중요한 수준이 많이 죽었 죽어 protoplasts에 상승을주는의 결과가 않습니다. 이 방법으로 준비 protoplasts을 정렬 할 때이 정렬에 사용되는 580 nm의 대 530 나노 미터 형광 그래프의 여러 별개의 인구를 참조하는 것이 매우 일반적입니다. 함께이 프로토콜에서 사용되는 정렬 게이트와 함께의 예는 그림 3에 표시됩니다.
Protoplasts는 솔루션의 8 권으로 정렬하여 농축을 확인하는 시각화를 위해 수집. 그림 2G는 경비 세포에 GFP를 표현 TP382 줄을 사용하여이의 예를 보여줍니다 할 수 있습니다.
이전과 증폭 후 모두이 방법을 사용하여 얻을 수 수율의 예는 표 1에 표시됩니다. 얻은 금액은 박수 피코 WTA 시스템 (500 PG-50 NG), 따라서 S를 사용하여 증폭에 충분한qPCR에 의해 ubsequent 분석 (그림 4), 차세대 시퀀싱 또는 microarray.
그림 1. 실험 전체 워크 플로우. 1) 수확은 Arabidopsis 라인을 표현 GFP에서 관심을 출발합니다. 2) 신속하게 ~ 1mm 폭 스트립에 잘라 즉시 protoplasting 솔루션과 진공 침투에 다음을 전송할 수 있습니다. 3) 3-4 시간에 품다. 4) 70 μm의 체를 통해 조심스럽게 여과 원형질 솔루션, 원심 분리하여 아래쪽 튜브 및 펠릿의 protoplasts 반올림하기 위해 전송할 수 있습니다. 5) 바로 정렬하기 전에, 50 μm를 통해 resuspend protoplasts 및 정렬 튜브로 전송 필터입니다. 6) 정렬 GFP 긍정적 GFP 부정적인 가능한 protoplasts. 7) Protoplasts 지금은 어느 시각적 분석 또는 qPCR, 차세대 시퀀싱이나 microarray 등의 기술을 사용 할 수 있습니다.
그림 2. 본 연구에 사용 된 KC464, KC274 및 TP382 라인. adaxial 표피에 GFP 표현을 보여주는 KC464 잎 A) 가로 절을 참조하십시오. B) Protoplasts는 KC464 잎에서 파생. vasculature에 GFP 표현을 보여주는 KC274 잎 C) 가로 절을 참조하십시오. D KC274 잎에서 파생) Protoplasts. E) TP382 잎은 경비 세포에 GFP 식을 보여주고 있습니다. F) Protoplasts는 TP382 잎에서 파생. TP382 잎에서 파생 protoplasts의 높은 530/low 580 인구에서 protoplasts을 포함 GFP를 보여주는 잎 세포의 복잡한 배경에서 가드 셀을 표현 GFP의 FACS하여 얻은 농축의 G) 예. AF : 공 촛점 현미경 이미지, G : 형광 현미경 이미지입니다. 이미지 내의 스케일 바는 50 μm이다.
그림 3. 30분의 580 나노 미터 (오렌지) 대 40분의 530 나노 미터 (녹색) 대역 통과 필터 (BD의 유입 셀 정렬)에서 출력의 일반 FACS 수집 도트 플롯. 표시된 정렬 문은 일반적으로 정렬하는 동안 사용되는 수 있습니다. 하나의 낮은 530/low 580 인구를 보여주는 억제제의 부재에 protoplasted 콜-4 잎 유래 protoplasts,의 A) 점 플롯. 때문에 에페드린에 의한 스트레스와 색채에 580 형광의 변화를 보여주는 억제제의 존재에 protoplasted 중량 콜-4 잎 유래 protoplasts,에서 B) 점 플롯. 높은 530/low 580 인구의 인구를 포함하는 GFP를 보여주는 억제제의 존재에 protoplasted 각각 KC74, KC464 및 TP382 라인,,,의 잎 파생 protoplasts에서 CE) 다트 플롯. GFP (높은 530/low 580) 인구의 이벤트의 비율이 주어집니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 4. 그림 3과 같이 대표 출입을 금지 인구 분수에서 GFP를 표현. 복제 두 생물 그 다음 수행 된 GFP 특정 프리 머 (표 2)를 사용하여 박수 피코 WTA 시스템 및 qPCR을 사용하여 증폭, 각 분획 유형에 취득했다. 표시 값은 최고 (빨간색), 낮은 (녹색) 및 평균 상대 값입니다. 높은 580 인구가 두 분할이 경우에 있었고, 낮은 530/low 580과 하나의 생물 복제 만이 하나의 값이 표시 될 수 있도록 사용 된 높은 530/low 580. ACT2 (At3g18780)는 모든 샘플에 대한 표준으로 사용되었다. 잎 : 전체 잎. 정렬되지 않은 : 정렬되지 않은 protoplasts. GFP1 : 높은 530/low 580과 Rest1 : 낮은 530/low 580, GFP2 : 높은 530/high 580과 Rest2 : 그림 3과 삽입에 설명 된 낮은 530/high 580. 결과는 확인 O 아르정렬 분수 (예 : 그림 2G)에 GFP 셀 내용의 F 광학 평가는. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
| 견본 | 잎의 번호 | 셀의 번호 | 수율 RNA (NG) | 수율 RNA (증폭, NG) |
| 전체 잎 전체 잎 B | 1 1 | - - | 8001 10,525 | 4623 *** 4572 *** |
| 정렬되지 않은 protoplasts 정렬되지 않은 protoplasts의 B | 5 5 | - - | 2433 2625 | 1152 *** 3321 *** |
| GFP1 Rest1 | 15 | 6039 (0.39 % *) 55,389 (6.40% *) | - ** - ** | 861 489 |
| GFP1 B Rest1 B | 15 | 10,783 (0.63 % *) 57,040 (7.49 % *) | - ** - ** | 537 420 |
| GFP2 Rest2 | 15 | 18,337 (1.49 % *) 62,405 (73.49 % *) | - ** - ** | 360 411 |
표 1. 샘플 FACS를 사용하여 수집 및 라이브 GFP-표현 protoplasts를 포함하는 분획 결정하는 qPCR으로 분석했다. 또한 박수 피코 WTA 시스템 (NuGen)와 증폭 전후 NG의 총 RNA 수율은이 표에 포함되어 있습니다. GFP1, GFP2, Rest1 및 Rest2 분수가 그림 4의 삽입에 표시됩니다. 전체 셀 정렬 실행의 세포의 *의 비율은 분수에있는 셀의 수를 옆에 괄호에 있습니다. 이 비율은에 상관하지 않습니다FACS 정렬은 '휴식'분수에 대한 실행 각 샘플에 대한 각 다른 하나는 이전 수집 화장실 세포의 훨씬 더 많기 때문에 GFP의 분수에 비해 중지되었습니다. 제조업체의 프로토콜에 따라 증폭 반응에 대한 입력으로 사용 ** 50 NG.
| 뇌관 | 순서 |
| mGFP5 - ER.fw | GCCTGAGGGATACGTGCAGGAGA |
| mGFP5 - ER.rv | TGGCGGGTCTTGAAGTTGGCT |
| ACT2.fw | GCCATCCAAGCTGTTCTCTC |
| ACT2.rv | GCCATCCAAGCTGTTCTCTC |
표 2. qPCR의 프리 머.
Discussion
우리는 원형질 생성 및 FACS를 사용하여 후속 셀 정렬의 잎에 GFP를 표현 Arabidopsis 식물의 사용을 허용하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 qPCR 또는 microarray에 의해 증폭, 따라서 이후의 분석에 사용되는 RNA의 충분한 양을 산출. 정렬 분수가 높은 등의 qPCR (그림 2)에 의해 증명 GFP 함유 세포에 풍부합니다.
잎 스트립 억제제가 함유 원형질 솔루션으로 침투 진공 될 때까지 라이브 protoplasts의 높은 수율을 달성하려면이 프로 시저의 초기 단계에서 신속하게 작동하는 것이 중요합니다. 또한, 1mm의 잎 스트립을 생성 할 때이 과도한 손상되므로 낮은 원형질 수율로 연결로, 잎보다는 '고기'또는 매시업을 갈라하거나 잘라서하는 것이 매우 중요합니다.
방법 사이의 중요한 차이는 여기와 다른 publishe 설명D 방법은 RNase 억제제와 전사 억제제를 사용하는 것입니다. 대부분의 방법은 protoplasts이 더 쉽게 생성 할 수있는 Arabidopsis 뿌리, 개발하고 있습니다. 그러나, mesophyll을 제외한, 잎과 함께 작업 할 때,이 원형질 생성 시간을 증가 할 필요가 있습니다. 따라서 원형질 생성 처리 자체 (데이터가 표시되지 않음)의 결과로 유전자 발현의 변화로부터 보호하기 위해 이러한 억제제를 포함하는 것이 중요합니다. 그러나 억제제의 존재이의 스트레스에 대응하기 위해되는 소성의 손실로 연결로 protoplasts 더 취약해질 가능성이 오프에 유전자 이상을, 전환하여하거나, 전사 반응을 마운트 할 수 없다는로 연결 절차를 protoplasting.
우리는 GFP-표현 Arabidopsis 라인의 번호를 성공적으로 여기에서 설명한 방법을 사용했습니다. 중요한 것은, 우리는 GFP 라인에서 또는 강력 GFP를 표현과 함께이 방법을 사용했습니다핵, 또는 더 약하게 non-localized/diffuse cytosolic 방식으로는 여기를 사용 KC464와 KC274 선 경우가 있습니다. 라인의 두 종류가 방법과 호환하고 GFP-표현 protoplasts의 매우 풍부한 분수 (그림 2, 3)을 얻을 수 있습니다. 형광이 죽은 / 죽어 세포의 autofluorescence 라이브 셀을 선택 할 수있는 능력을 유지하기 위해 크게 다를 수 있습니다 형광 선택해야합니다 있지만 방법은 쉽게 다른 fluorophores에 적용 할 수 있습니다.
Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
세포 유형과 발달 단계에 특정 프로파일에 부케 - Wollaston 실험실에서 작업은 유럽위원회 (European Commission)의 6 번째 프레임 워크 Progamme의 AGRON-OMICS 프로젝트 (부여 # LSHG-CT-2006-037704)에 의해 지원됩니다. 세포 유형 특정 프로파일에 기 포드의 연구소에서 일이 BBSRC 새로운 탐정 보조금 (BB/H019502/1)에 의해 지원됩니다.
KC274와 KC464 Arabidopsis 라인 AAR 웹 (캠브리지 대학)에서 얻었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cellulase R-10 | Melford | C8001 | |
| Cellulase RS | Melford | C8003 | |
| Macerozyme R-10 | Melford | M8002 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3912 | |
| ProtectRNA | Sigma-Aldrich | R7397 | |
| Actinomycin D | Sigma-Aldrich | A1410 | |
| 70 μm cell strainer | Fisher | FB35181 | |
| 50 μm filcon cup-type filters | BD Biosciences | 340630 |
References
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