Summary
وقد وضعت رواية الأسلوب التطور الموجه محددة لمجال الهندسة صمود للحرارة وبالتالي التحقق من صحة لالإنزيمات للجراثيم. فقط بعد جولة واحدة من الطفرات العشوائية، وهو الانزيم تطورت للجراثيم، PlyC 29C3، عرض أكبر من النشاط المتبقية مرتين بالمقارنة مع البروتين من النوع البري بعد مرور فترة الحضانة درجة حرارة مرتفعة.
Abstract
ويعرف التطور الموجه كوسيلة لتسخير الانتقاء الطبيعي من أجل هندسة البروتينات للحصول على خصائص خاصة التي لا ترتبط مع البروتين في الطبيعة. وقد وفرت الأدب أمثلة عديدة فيما يتعلق بتنفيذ التطور الموجه لتغيير بنجاح خصوصية الجزيئية والحفز 1. والميزة الرئيسية لاستخدام التطور الموجه بدلا من اتباع نهج أكثر عقلانية على أساس الهندسة الجزيئية لليتصل حجم وتنوع المتغيرات التي يمكن فحص 2. طلب واحد ممكن من التطور الموجه ينطوي تحسين الاستقرار الهيكلي للجراثيم من الإنزيمات، مثل endolysins. عاثية ترميز والتعبير عن endolysins لهيدروليزي السندات التساهمية الحرجة في ببتيدوغليكان (أي جدار الخلية) من البكتيريا، مما يؤدي إلى تحلل الخلايا المضيفة والتحرر من virions ذرية. والجدير بالذكر أن هذه الانزيمات تمتلك القدرة على إحداث تحلل خارجيا لsusceptوقد تم التحقق من صحة البكتيريا ible في غياب بالعاثية وعلاوة على ذلك سواء في التجارب المختبرية والحية لقدرتها العلاجية 3-5. موضوع دراستنا التطور الموجه ينطوي على حالة جوانية PlyC، التي تتألف من الوحدات الصغرى وPlyCA PlyCB 6. بعد تنقيته وأضاف خارجيا، وعميم الإنزيم PlyC lyses مجموعة العقديات A (GAS) وكذلك الجماعات العقدية الأخرى في غضون ثوان، وعلاوة على ذلك تم التحقق من صحة في الجسم الحي ضد GAS 7. بشكل كبير، ورصد حركية إنزيم المتبقية بعد مرور فترة الحضانة درجة حرارة مرتفعة يقدم دليلا المتميزة التي PlyC يفقد النشاط التحللي فجأة في C ° 45، مما يشير إلى مدة الصلاحية القصيرة العلاجية، والتي قد تحد من التنمية إضافية من هذا الانزيم. مزيد من الدراسات تكشف لوحظ فقط عدم وجود الاستقرار الحراري للالوحيدات PlyCA، في حين أن الوحيدات PlyCB مستقرة تصل إلى ~ 90 ° C (المراقبة غير منشورة). بالإضافة إلى PlyC، وهناك لياليeveral الأمثلة في الأدب التي تصف طبيعة بالحرارة من endolysins. على سبيل المثال، المكورات العنقودية الذهبية حالة جوانية LysK والعقدية الرئوية endolysins العريف-1 ويفقد بال النشاط بصورة عفوية في 42 ° C، 43.5 ° C و 50.2 ° C، على التوالي 8-10. وفقا للمعادلة أرينيوس، والتي تتعلق في سرعة التفاعل الكيميائي حتى الوقت الحاضر درجة الحرارة في نظام معين، وزيادة في صمود للحرارة ترتبط بزيادة في متوسط العمر الافتراضي 11. ولتحقيق هذه الغاية، وقد تبين التطور الموجه ليكون أداة مفيدة لتغيير النشاط الحراري للجزيئات مختلفة في الطبيعة، ولكن لم يحدث قط أن هذه التكنولوجيا قد نجح في استغلال خاصة لدراسة الإنزيمات للجراثيم. وبالمثل، حسابات الناجح لتتقدم على الاستقرار الهيكلي من هذه فئة معينة من مضادات الميكروبات هي تماما غير موجود. في هذا الفيديو، ونحن توظيف منهجية الرواية التي تستخدم خطأ للعلاقات العامة1 البلمرة DNA يليها عملية الفرز الأمثل باستخدام لوحة عيار مكروي أن 96 جيد التنسيق لتحديد الطفرات إلى الوحيدات PlyCA من حالة جوانية العقدية التي ترتبط PlyC إلى زيادة الاستقرار الحركي انزيم (الشكل 1). نتائج الجولة بعد واحد فقط من الطفرات العشوائية تشير إلى منهجية تولد المتغيرات التي تحتفظ PlyC أكثر من ضعف النشاط المتبقية بالمقارنة مع PlyC (WT) من النوع البري بعد العلاج درجة حرارة مرتفعة.
Protocol
1. تحديد شروط تدفئة الأمثل
أولا، لا بد من تحديد تجريبيا على حرارة الحضانة الأمثل والوقت لاستخدام للخطوة التدفئة في الفحص. لنموذجنا PlyC، من المهم أن نلاحظ أن E. وقد تبين القولونية شارك في تحول الجينات ومع plyCA plyCB على البلازميدات التعبير منفصلة لتشكيل عميم الإنزيم تعمل بكامل طاقتها PlyC 6. تم تكييف ال 96 لوحة جيدا عيار مكروي وكذلك إعداد الشروط نمو الخلايا والطلاء طبق تقنية لاحقة من الأمثلة الواردة في أدبيات 12-16. ووقت 30 دقيقة من الحضانة تكون مناسبة لهذا الاختبار عن نتائج التجارب السابقة من تعطيل الحرارية تملي خسارة سريعة في النشاط خلال المدى القصير الحضانة في بيئات تتجاوز درجة الحرارة الفسيولوجية (المراقبة غير منشورة). تم توضيح درجة الحرارة المثلى لحضانة PlyC من الخطوات التالية:
- ترانsform التعبير بناء pBAD24: plyCA (الأمبير ص) في E. المختصة القولونية سلالة DH5α pBAD33: plyCB (سم ص).
- لوحة للtransformants على لوحة لوريا Bertani-أجار (LB) تستكمل مع الأمبيسلين (100 ميكروغرام / مل) والكلورامفينيكول (35 ميكروغرام / مل). احتضان لوحات ليلة وضحاها في 37 درجة مئوية.
- عيار مكروي وحة بغطاء التي تحتوي على 200 ميكرولتر من LB تستكمل مع الأمبيسلين والكلورامفينيكول مع مسواك العقيمة، تطعيم مستعمرة الفردية في كل صف من الآبار (الشكل 2A) أن 96 في العقيمة، واضحة، ذات قاع مسطح بشكل جيد.
- وضع آمن ال 96 لوحة جيدا عيار مكروي على 37 درجة مئوية وتنمو تهز حاضنة للبكتيريا بين عشية وضحاها في 300 دورة في الدقيقة.
- استرداد ال 96 لوحة جيدا من عيار مكروي 37 ° C تهز الحاضنة والمقلدة لوحة جديدة لوحة 96 عيار مكروي جيدا على النحو التالي:
- اضافة 180 ميكرولتر من LB تستكمل مع الأمبيسلين والكلورامفينيكولإلى كل بئر من لوحة متماثلة.
- نقل 20 ميكرولتر من البكتيريا من لوحة أصلية للآبار المقابلة في لوحة متماثلة. وهذا ينبغي أن يؤدي إلى 600 OD الأولى من ~ 0.5.
- وضع آمن لوحة طبق على 37 درجة مئوية الحاضنة واحتضان تهز لوحة لمدة 1 ساعة في 300 دورة في الدقيقة، ثم يضاف inductant. في حالة الأنظمة التعبير pBAD، وinductant هو أرابينوز 0.25٪. قد نظم التعبير الأخرى تتطلب inductants مختلفة. وضع لوحة على عودة 37 ° C تهز الحاضنة واهتزاز في 300 دورة في الدقيقة لساعة 4 إضافية للسماح للتعبير البروتين. مستويات التعبير عادة ما تتراوح بين 10-20 ميكروغرام من PlyC.
- مرة واحدة بروتين تعبير أبرمت واسترجاعها لوحة المقلدة وبيليه البكتيريا عن طريق وضع لوحة ال 96 عيار مكروي بشكل جيد في أجهزة الطرد المركزي المبردة التي تحتوي على الدوار يتأرجح-96 دلو الذي يناسب وحات microtiter أيضا. أجهزة الطرد المركزي في 3،000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة طاف وسائل الإعلام من قلب ببطء وحة عيار مكروي والصب بلطف وسائل الإعلام.
- ليز الخلايا عن طريق إضافة 50 ميكرولتر من B-PER II الجرثومي بروتين الكاشف لاستخراج كل بئر. احتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
- مخزنة في زيادة حجم كل بئر إلى 120 ميكرولتر من خلال إضافة 70 ميكرولتر من الفوسفات الملحي (PBS) الرقم الهيدروجيني 7.2.
- بيليه الانقاض غير قابلة للذوبان الخلوية من خلال الدوران في لوحة 3،000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية في أجهزة الطرد المركزي المبردة.
- نقل 110 ميكرولتر من الخام القابلة للذوبان المحللة للآبار المقابلة لوحة 96 thermocycler أيضا.
- باستخدام 30 دقيقة وفترة حضانة محددة سلفا، تعرض لست] ذوبان يقيم حاليا في لوحة 96 thermocycler جيدا لمجموعة واسعة تمتد الانحدار درجة حرارة 15-20 ° C. ملاحظة، والهدف من ذلك هو تحديد ما في درجة حرارة انزيم معين يفقد> نشاط الحفاز 95٪.
- بعد الحضانة، احتضان ال 96 جيداthermocycler لوحة في 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق ونقل 100 ميكرولتر من ذوبان لست] من لوحة 96 thermocycler جيدا لموقعها جيدا في المقابلة النهائية ال 96 لوحة جيدا عيار مكروي.
- مع multipipettor 12-قناة، إضافة 100 ميكرولتر من سلالة GAS D471 إلى كل بئر. علما، ومجفف بالتجميد في الأصل D471 الخلايا من الثقافات بين عشية وضحاها ومعلق مع الرقم الهيدروجيني 7.2 إلى PBS الحصول على OD 600 من ~ 2.0.
- وضع على الفور وحة 96 بشكل جيد في معمل صفيحة ميكروسكوبية ورصد حركية إنزيم عن طريق قياس OD 600 ثانية كل 20 دقيقة 15 ل. يتم تعريف الحضانة الحرارة الصغرى التي تتوافق مع الآبار التي تفتقر إلى تغير في كثافة بصرية (ΔOD ≤ 0.1) ودرجة حرارة غير متساهل.
بعد يتم تنفيذ شاشة واسعة لتحديد درجة الحرارة درجة الحرارة غير متساهلة، ويمكن تكرار الخطوات المذكورة أعلاه على نطاق وضيق من درجات الحرارة أكثر (5 ° -10 ° C) لتوضيحوغير متساهلة دقيقة درجة الحرارة للانزيم في المصالح. ملاحظة، قد درجة حرارة غير متساهل المحددة في هذا الاختبار أن تكون مختلفة من درجة حرارة انصهار توضيح بوسائل أخرى بسبب الاختلافات في الحجم، التركيز، الخ.
2. توليد مكتبة المسخ
إنشاء مكتبة متحولة ليتم عرضه بشكل عشوائي ينطوي على دمج الطفرات من قبل البلمرة DNA عرضة للخطأ مع الحد الأدنى من التحيز النوكليوتيدات في الجينات باستخدام plyCA II GeneMorph كيت الطفرات عشوائية على النحو التالي:
- تصميم الاشعال النوكليوتيدات مع درجات حرارة انصهار مماثل (T م) بين 55-72 درجة مئوية مع مواقع تقييد الاختيار في 5 'و 3' نهايات الجين plyCA.
- منذ الطفرة المرجوة معدل النيوكليوتيدات هي 2-3 في plyCA (1.4 KB)، استخدم عنصر تفاعل PCR تركيزات فضلا عن الظروف thermocycler موصى بها من قبل الشركة المصنعة لو طفرة منخفضةrequencies (0-4،5 في KB).
- استنساخ الجينات mutagenized plyCA في ناقلات التعبير pBAD24.
- تحويل إلى بنيات DH5α pBAD33: plyCB الخلفية وtransformants على لوحات أجار لوحة LB تستكمل مع الأمبيسلين والكلورامفينيكول.
- بالإضافة إلى ذلك، وتحويل لوحة DH5α pBAD33: plyCB مع ناقلات التعبير pBAD24 التي تحتوي على الجينات plyCA WT. سوف المستعمرات من هذه اللوحة بمثابة الضوابط أثناء الفرز.
3. 96 لوحة عيار مكروي حسنا إعداد وشروط نمو الخلايا
- ملء كل بئر من لوحة 96 عيار مكروي جيدا مع 200 ميكرولتر من LB تستكمل مع الأمبيسلين والكلورامفينيكول.
- بعد التخطيطي لوحة عيار مكروي (الشكل 2B)، حدد بعناية مستعمرة فردية من لوحات أجار بين عشية وضحاها مع مسواك تعقيم وتطعيم البكتيريا في جيش التحرير الشعبى الصينى المعين جيدا ال 96 عيار مكروي جيداالشركة المصرية للاتصالات. لا بد من ضمان واحد فقط مستعمرة لكل بئر يتم تلقيح.
- يهز آمن الراسية 96 لوحة جيدا عيار مكروي في 300 دورة في الدقيقة ليلة وضحاها في 37 درجة مئوية.
4. تصفيح طبق الاصل، البروتين الحث التعبير وإعداد المحللة
- اتبع الخطوات من 1،5-1،11 من الجزء الموجود بعنوان "تحديد الظروف المثلى التدفئة" مع واحد التعديل. تخزين لوحة أصلية في 4 درجات مئوية بعد خطوة الطلاء طبق الاصل وقد خلص.
- بعد الخطوة 1.11، نقل 110 ميكرولتر من الخام القابلة للذوبان المحللة للآبار المقابلة لوحة 96 thermocycler جيدا باستثناء لمراقبة الآبار إيجابية A1-D1. وفيما يتعلق لست] مراقبة إيجابية (أي لست] التي لم يتم تسخينها)، ونقل 100 ميكرولتر من الآبار لست] إلى المقابلة في 96 الجديدة لوحة عيار مكروي جيدا أن سيكون بمثابة لوحة الفحص النهائي للتجربة ومتجر على الجليد.
5. المعالجة الحرارية للذوبان المحللة
- تسخين السيطرة السلبية وقابل للذوبان متحولة لست] محصورة حاليا في thermocycler وحة 96 بشكل جيد في thermocycler لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الحضانة الأمثل غير متساهل تحديده في الخطوة 1.
- بعد مرور فترة الحضانة درجة الحرارة غير متساهل، احتضان ال 96 لوحة جيدا في thermocycler C ° 4 لمدة 5 دقائق.
- نقل 100 ميكرولتر من ذوبان لست] من لوحة 96 thermocycler جيدا إلى مواقعها جيدا متطابقة في ال 96 جيدا النهائي عيار مكروي وحة الفحص التي تحتوي بالفعل لست] مراقبة إيجابية للذوبان.
- مع multipipettor 12-قناة، إضافة 100 ميكرولتر من سلالة GAS D471 إلى كل بئر. وضع لوحة على الفور في معمل صفيحة ميكروسكوبية.
- رصد حركية إنزيم عن طريق قياس ال 600 OD كل ثانية 15 ل20 دقيقة.
- يتم تعريف متغير PlyC مع السلوك الحراري تقدم بوصفها بناء التي يمكن أن تقلل من كثافة الأصلي البصرية بنسبة 50 في المئة في أقل من 900 ثانية فيغير متساهل درجة الحرارة. بالإضافة إلى ذلك، والضوابط الإيجابية (أي غير مدفأ، WT PlyC) تحتاج إلى عرض نشاط الحفاز WT (ر 1/2 ≤ 100 ثانية) والضوابط السلبية (أي تسخين، WT PlyC) يجب أن تكون خالية من النشاط.
- مرة واحدة في متغير PlyC مع تقدم يتم تعريف السلوك الحراري واسترجاعها لوحة الأصلي المخزنة عند 4 ° C البكتيريا وتطعيم من شخص معين بشكل جيد للمتحولة من الاهتمام إلى وسائل الإعلام LB تستكمل مع الأمبيسلين الطازجة والكلورامفينيكول. نمو اللقاح بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
- استخراج وتنقية DNA البلازميد من الثقافة و من ثم النقر على التسلسل من أجل تحديد الطفرات النوكليوتيدات أن نستنتج السلوك الحراري لتعزيز PlyCA. بالإضافة إلى ذلك، لتكملة قسامة صغيرة من الجلسرين مع الثقافة بين عشية وضحاها 10٪ وتخزينها في -80 درجة مئوية لاستخدامها مرة أخرى.
Representative Results
في ختام الجولة الأولى من الطفرات العشوائية، تم فحص أكثر من 6،000 طفرات PlyC وتم تحديد ما مجموعه 35 المسوخ مع احتمال تزايد السلوك الحراري، وتحديد التسلسل. التحليل الجيني، لخصت في الجدول الأول، يشير إلى أن المرشحين 35، 7 من بنيات الواردة WT تسلسل PlyCA على مستوى الترجمة، الموافق ايجابيات كاذبة حددها الفحص. 28 من المرشحين الباقين، وكان نطاق الطفرة 1 حتي 6 الطفرات النوكليوتيدات بمعدل متوسط قدره 2.75 الطفرة النيوكليوتيدات في الجينات plyCA، والذي كان في حدود 2-3 طفرة النوكليوتيدات كنا الاستهداف. على المستوى متعدية، أسفرت هذه الطفرة النوكليوتيدات مجموعة خاصة وتردد على نطاق طفرة الأحماض الأمينية من 1 إلى 5 الأحماض الأمينية، وبمعدل يصل إلى 1.9 طفرة الطفرات الأحماض الأمينية في PlyCA ببتيد.
من 28 مرشحا واحد على الأقل mutat الأحماض الأمينيةايون، تم اختيارها عشوائيا أربعة من هذه التركيبات متحولة لتوصيف مزيد من التحقق من أن عملية الفرز واسعة من منهجية التطور الموجه كان يعمل في الواقع بشكل صحيح. وتنقيته من الانزيمات متحولة إلى التجانس PlyC> 95٪ على أساس تحليل SDS-PAGE كما هو موضح سابقا 6-7. وتميزت حركية إنزيم من PlyC WT وكل من المسوخ 4 PlyC بتركيزات متساوية المولي بعد احتضان تنقية الإنزيمات المختلفة في درجات حرارة مرتفعة. تم رصد نشاط بعد إضافة D471 GAS عن طريق قياس الكثافة البصرية في 600 نانومتر كل ثانية 15 ل20 دقيقة. كما تم تعريف النشاط سرعة القصوى المتبقية للانزيم بعد مرور فترة الحضانة الحرارة. من المرشحين الأربعة تم اختيارها عشوائيا لتوصيف أخرى، أظهرت متحولة 29C3 سلوك معظم تعزيز الحرارية. وكان التحقيق في السلوك الحراري للPlyC WT و29C3 عند درجات حرارة مختلفة في حين يحتضنها ويعاير للنشاط في الرقم الهيدروجيني 7،2 في PBS80 نانومتر ونانومتر تركيزات 40، على التوالي. أجريت في 45-50 C ° الحضانة التجارب (الشكل 3) في thermocycler حيث حضنت العينات في رقيقة الجدران 96 لوحة thermocycler بشكل جيد في حجم مجموعه 120 ميكرولتر. و35 ° C، 40 ° C و 45 ° C وأجريت التجارب الحضانة (الشكل 4 و 5) في كتلة الحرارة حيث حضنت العينات في أنبوب مل 1.5 في ميكروسنتريفوج وإجمالي قدره 1.3 مل. أجريت جميع التجارب في ثلاث مكرارت.
وأظهرت WT PlyC و29C3 هناك اختلاف كبير في استقرار الحركية في درجة حرارة الغرفة (25 ° C) كما هو مبين في المجموعة الاولى من الحانات في الشكل 3. ومع ذلك، بعد حضانة قصيرة الأجل لمدة 30 دقيقة من درجات حرارة تتراوح 45 حتي 50 درجة مئوية، وكان نشاط 29C3 أكبر بكثير من نشاط معين لبناء WT في كل نقطة درجة الحرارة. على سبيل المثال، عرض WT PlyC خسارة 44٪ في النشاط عند 45.2وأظهرت ° C بينما 29C3 فقط خسارة 2٪ في النشاط في نفس درجة الحرارة.
بالإضافة إلى ذلك أجريت دراسات حضانة طويلة الأجل مقارنة النشاط المتبقية من PlyC WT كل و29C3 في 35 ° C و 40 ° C تنطوي على قياس النشاط المتبقية في 24 و 48 نقطة الوقت ساعة. في 35 ° C، 41٪ 29C3 عرض و. النشاط 176٪ أعلى من PlyC WT في 24 و 48 نقطة الحضانة الوقت ساعة على التوالي (الشكل 4A) في 40 ° C، 28٪ 29C3 عرض و. النشاط 107٪ أعلى من PlyC WT في 24 و 48 نقطة الحضانة الوقت ساعة على التوالي (الشكل 4B)
كما تم رصد نشاط المتبقية من PlyC WT و29C3 كل 20 دقيقة ليصبح المجموع 3 ساعة في 45 ° C. كان WT PlyC فقط قادرة على الاحتفاظ النشاط 21٪ بعد ساعة 3 في حضانة درجة الحرارة هذه في حين كان 29C3 قادرة على الاحتفاظ النشاط 46٪. فترة نصف العمر (T 1/2) لPlyC WT وكانت 29C3 67 و دقيقة 147، على التوالي، تشير جي ان لديه 29C3 الثاني بنسبة 2.2 أضعاف في استقرار الحركية في 45 ° C (الشكل 5).
| مجموع المرشحين الدور 1 | 35 |
| مع تسلسل المرشحين PlyCA WT | 7 |
| المرشحين مع 1 ≥ الطفرة الأحماض الأمينية | 28 |
| - متوسط معدل الطفرة النيوكليوتيدات (NT / plyCA) | 2.75 |
| - متوسط الطفرة النيوكليوتيدات (NT) | 1-6 |
| - متوسط قيم الطفرة الأحماض الأمينية (AA / PlyCA) | 1.9 |
| - حمض أميني متوسط الطفرة (AA) | 1-5 |
طاولة بلياردو المرشح 1. تحليل الجينوم.
pload/4216/4216fig1highres.jpg "/>
الشكل 1. توجه منهجية الفحص التطور. في التطور الموجه، واحد يبدأ مع انزيم الرصاص، والتي ستكون WT PlyC للجولة الأولى. ثم يتم إنشاء مكتبة تحتوي على PlyC من المسوخ عشوائية الطفرات النوكليوتيدات منحازة لهذا الجين plyCA من قبل البلمرة DNA عرضة للخطأ، المستنسخة في ناقلات التعبير pBAD24 وتحويلها إلى E. القولونية سلالة DH5α تحتوي بالفعل pBAD33: يتم تلقيح plyCB transformants فردية محددة في أسهمها لوحة 96 عيار مكروي جيدا. من خلال عملية الفحص واسعة النطاق، وتصنف المسوخ PlyC الفردية التي تنشط حفاز بعد الحضانة في درجة حرارة غير المسموح بها والمسوخ مع استقرار الحركية المحسنة. Theconstruct عرض السلوك الأكثر تقدما سوف يصبح بالتالي الحرارية الانزيم الرصاص للجولة القادمة من الطفرات العشوائية. وعموما، هناك ثلاث جولات كاملة من randoيتبع م الطفرات بواسطة خلط الحمض النووي مما أدى إلى جزيء للجراثيم مع تطور السلوك الحراري. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
الشكل 2. 96 لوحة جيدا عيار مكروي نماذج لفحص التطور الموجه. والتخطيطي لوحة عيار مكروي خلال تحديد شروط التدفئة الأمثل (الشكل 2A) ويتكون من بتلقيح واحد الوالدين استنساخ PlyC WT في كل صف من لوحة عيار مكروي. التخطيطي لوحة عيار مكروي أثناء الفرز متحولة (الشكل 2B) ويتكون من بتلقيح كل بئر في العمود 1 مع نسخة فريدة من نوعها PlyC WT الوالدين وكذلك تحصين كل بئر في الأعمدة 2-12 مع استنساخ متميزة متحولة PlyC. وتتم تسمية آبار A1-D1 لضوابط الوالدين الإيجابية، التي شاركيبني لا يتعرض nsist من PlyC WT لدرجة حرارة الحضانة غير جائز. وتتم تسمية آبار E1-H1 للضوابط الوالدين السلبية، والتي تتكون من بنيات PlyC WT التي تتعرض لدرجة حرارة الحضانة غير جائز.
الشكل 3. تحليل النشاط الحركي المتبقية مقارنة WT PlyC و29C3. وتنقيته الانزيمات إلى التجانس وحضنت لمدة 30 دقيقة في thermocycler بتركيزات المولي متساوية في درجة حرارة الغرفة أو في درجة حرارة تتراوح الانحدار 45-50 ° C. النشاط الأنزيمي يرتبط أقصى سرعة عرض بعد مرور فترة الحضانة درجة حرارة معينة. باستثناء C ° 25 ° C و 47.7، والتفاوت في النشاط بين WT و29C3 في كل درجة حرارة ترتبط إلى قيمة ف <0.05. تم الإبلاغ عن جميع البيانات في الوسط ± SEM من ثلاث تجارب مستقلة. 
الشكل 4. تحليل النشاط الحركي المتبقية مقارنة WT PlyC ل29C3 في 35 ° C حضنت و 40 ° C. تركيزات المولي المساواة في تنقية WT PlyC و29C3 في كتلة الحرارة على 35 ° C (الشكل 4A) أو 40 ° C (الشكل 4B). تم قياس نشاط انزيم المتبقية في 24 و 48 نقطة الوقت ساعة. تم تطبيع النشاط عرض كل بناء إلى أقصى سرعة في عرض نقطة الصفر مرة. الاختلاف في النشاط بين WT و29C3 في كل نقطة درجة الحرارة والوقت ربطها 0.05 <P القيمة. تم الإبلاغ عن جميع البيانات في الوسط ± SEM من ثلاث تجارب مستقلة.
الشكل 5. تحليل النشاط الحركي المتبقية مقارنةوحضنت WT PlyC ل29C3 في 45 ° C. تركيزات المولي المساواة في تنقية WT PlyC و29C3 في كتلة الحرارة في C ° 45 و تم قياس نشاط انزيم المتبقية كل 20 دقيقة لمدة 3 ساعة. تم تطبيع النشاط عرض كل بناء إلى أقصى سرعة في عرض نقطة الصفر مرة. مع استثناء من نقاط البيانات في 20 دقيقة، والتباين في النشاط بين WT و29C3 في كل نقطة مرة ربطها 0.05 <P القيمة. تم الإبلاغ عن جميع البيانات في الوسط ± SEM من ثلاث تجارب مستقلة.
Discussion
هذا البروتوكول، المبينة في الشكل 1، ويعرض أن 96 لوحة جيدا عيار مكروي المنهجية التي يسمح احد للاستفادة من التطور الموجه لزيادة صمود للحرارة من أي جراثيم الانزيم. من خلال استخدام الحمض النووي لبوليميراز عرضة للخطأ، يمكن للمرء أن أعرض الطفرات العشوائية التي تزيد من الاستقرار العام الحركية للجزيء للجراثيم مترجمة من الفائدة، وهو عادة بسبب عمليات إعادة التنظيم الجزيئي التي تتكون من زيادة كهرباء، ثاني كبريتيد الجسر والتفاعلات التي تولد مسعور تحسين الجزيئية التعبئة، وتعزيز شبكات التعديلات الشحنة السطحية أو تعزيز حالة ارتفاع oligomerization 17-18. بعد إدخال طفرات النوكليوتيدات، ثم تم استخدام إجراء فحص واسعة النطاق لتحديد الطفرات التي تعود بالفائدة حراريا. واستندت النتائج على ممثل المقدمة هنا جولة واحدة من الطفرات العشوائية. في الواقع، وقد اقترح أنعلى الأقل ثلاث جولات متتالية من الطفرات العشوائية، باستخدام كل متحولة أقوى والانزيم الرصاص، تليها خلط الحمض النووي هو مناسبة لهذه الأنواع من الدراسات الموجهة تطور السلوك الحراري 2.
من المهم أن نفهم أنه في حين أن هذا البروتوكول يحدد الطفرات التي تزيد الاستقرار الحركي، لا هذه المتغيرات بالضرورة زادت صمود للحرارة. ويعتبر جزيء بالحرارة عندما يكون لديه القدرة على الاحتفاظ هيكلها عند درجة حرارة عالية. ومع ذلك، في مقايسة المقدمة، لا يعاير النشاط المتبقية لللست] متحولة في نفس درجة الحرارة التي حضنت في البداية أنها في أثناء العلاج الحرارة خطوة وبالتالي يمكن للمرء أن يكون اختيار الطفرات التي لتعزيز صمود للحرارة طوي ثانية بدلا من تعزيز 19. بينما نحن استقراء السلوك الحراري مؤشرا على الاستقرار الحراري، يجب أن تقاس الاستقرار الحراري صحيح تجريبيا بواسطة biophysطرق كال مثل ازدواج اللون دائرية (CD)، الفرق الكالوري المسح الضوئي (DSC) والفرق fluorimetry المسح (DSF). البيانات الأولية من التجارب CD مهرجان دبي للتسوق وتشير إلى أن العديد من المرشحين من تحديد المنهجية المقدمة لا تقدم عرض الواقع صمود للحرارة (لا تظهر البيانات).
على الرغم من أن المنهجية المقدمة هنا هي محددة لتنفيذ السلوك الحراري لزيادة PlyC يمكن، بالإضافة إلى ذلك نفس هذه المنهجية أن تستخدم لتعزيز نشاط الانزيمات الحرارية لجراثيم أخرى مع بعض التعديلات الطفيفة على متغيرات مثل المخازن المؤقتة، ومعدلات الطفرات، والظروف أنظمة التدفئة والتعبير. متغير واحد الحرجة المرتبطة بهذا الفحص يتصل معدل الطفرة النوكليوتيدات من البلمرة DNA عرضة للخطأ. اخترنا لاستخدام عرضة للخطأ DNA بوليميراز الثاني Mutazyme في مقايسة لدينا التطور الموجه بسبب الأدلة التجريبية تشير هذا الانزيم خاص يعرض أقل قدر من التحيز معوتدرج بشكل عشوائي يتعلق النيوكليوتيدات التي في الجينات ذات الاهتمام بالمقارنة مع غيرها من تقنيات الطفرات العشوائية مثل استخدام هيدروكسيل، mutator E. سلالات القولونية وغيرها من DNA عرضة للخطأ polyermases 20. بشكل عام، وانخفاض معدلات طفرة تميل إلى أن تكون أكثر من المرغوب فيه لسببين. أولا، صمود للحرارة الهندسية للبروتينات تتكون عادة من عدد قليل نسبيا من بدائل الأحماض الأمينية. يمكن أن يسبب ارتفاع معدلات طفرة هائلة التغييرات الهيكلية لجزيئات معينة التي يمكن أن تؤدي بشكل قاطع في misfolding التناقضات الهيكلية والوظيفية. على سبيل المثال، يمكن دمج جليكاين وبقايا البرولين تعطيل هياكل حلزونية ألفا الثانوية 21. ، وارتفاع معدلات الطفرة النوكليوتيدات الثاني يزيد من فرص دمج المبكرة الكودونات توقف، مما أدى إلى اقتطاع الجزيئات التي هي غير نشطة بيولوجيا. بشكل عام، ويفضل انخفاض أسعار طفرة بسبب انخفاض معدلات نتيجة خطأ في بطاريات لأوجه من الطفرات على التكيف مع ارتفاع معدلات توليد الطفرات طفرة محايدة أو ضارة 22.
لكل جولة من الطفرات العشوائية، وآخر متغير الحرجة التي يجب على المرء أن تحسين ينطوي على درجة حرارة الحضانة المستخدمة أثناء عملية الفرز. اختيار درجة الحرارة غير متساهلة نسبيا التجريبية يمثل تحديا. كنا في البداية درجة حرارة الحضانة التي كانت 10 ° C أعلى من درجة حرارة غير متساهل من PlyC، ولكن بعد فحص 3000 المسوخ، لم نتمكن من تحديد أي الطفرات المفيدة. مع الأخذ في الاعتبار منهجيات التطور الموجه تتكون من تحديد بدائل مفيدة بشكل تسلسلي الأحماض الأمينية التي لها آثار المضافة، تقرر أنه ينبغي استخدام درجة حرارة أقل صرامة خلال عملية الفرز حتى لو كان زيادة الفرصة لتوليد ايجابيات كاذبة. على هذا النحو، استخدمنا درجة حرارة الحضانة الذي كان فقط بضع درجات فوق permiss غيرإيف درجة الحرارة والمرشحين المختارين rescreened استبعاد ايجابيات كاذبة.
قررنا استخدام درجة حرارة الحضانة لم يكن المعتدلة جدا (≤ 1 ° C أدنى درجة حرارة أعلى من غير متساهل) والعكس ليس قاسيا جدا (≥ 5 ° C أدنى درجة حرارة أعلى من غير متساهل). كانت درجة الحرارة المثالية قررنا استخدامها في هذا الاختبار خاص (أ) 2 ° C معتدل درجة الحرارة أعلى من غير متساهل تحديد تجريبيا. واختيار درجة الحرارة التي هي خفيفة جدا يؤدي إلى معدل أعلى بكثير كاذبة تحديد إيجابية من 20٪ ~ احظنا (الجدول الأول) عند استخدام درجة حرارة معتدلة الحضانة. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام درجة حرارة الحضانة التي هي قاسية جدا تؤدي في نهاية المطاف عدم القدرة على تحديد الطفرات مع السلوك الحراري المعزز بشكل ملحوظ. على سبيل المثال، باستخدام درجة حرارة حضانة ≥ 5 ° C قد أدت في عدم القدرة على تحديدوعد متحولة 29C3 فضلا عن غالبية المرشحين الآخرين المحددة أثناء الجولة الأولى من الفرز.
في الجمع، ونحن نقدم بروتوكول للجراثيم الانزيمات الهندسة للحصول على الاستقرار الحركية المحسنة. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام هذا الاختبار نفسه، دون الخطوات التدفئة، للكشف عن الطفرات التي تزيد نشاط الحفاز. زيادة كل من صمود للحرارة ونشاط الحفاز يشكل عقبة هامة التنموية التي تواجه أي انزيم العلاجية. في حين أن تفاصيل هذا البروتوكول هي محددة إلى حالة جوانية PlyC، يمكن تكييف منهجية لأي إنزيم للجراثيم مع بعض التعديلات قليلة فقط. قدمنا النتائج الأولية من الجولة الأولى فقط من الطفرات من صحة هذه الوظيفة من الفحص، مما أدى إلى تنفيذ وتحديد الطفرات التي تولد زيادة في حجم الجزيئي للصمود للحرارة كبيرة.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
الكتاب أود أن أشكر Emilija Renke وجانيت يو للمساعدة التقنية. ويدعم DCN من المنح المقدمة من وزارة دفاع الولايات المتحدة (DR080205، DM102823، OR09055، وOR090059). ويدعم RDH بمنحة من التجربة ميريلاند محطة الزراعة ومنحة المعاهد الوطنية للصحة في التدريب الخلية والبيولوجيا الجزيئية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B-PER II Bacterial Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 78260 | |
| GeneMorph II Random Mutagenesis Kit | Agilent Technologies | 200500 | |
| Clear 96 Well, Flat-bottomed Microtiter Plate With Lid | BD Vacutainer Labware Medical | 353072 | |
| 96 Well Nonskirted PCR Plates | Fisher Scientific | 14-230-232 | |
| Swing-bucket Rotor | Eppendorf | A-2-DWP | |
| Ampicillin Sodium Salt | Fisher Scientific | BP1760 | |
| Chloramphenicol | Fisher Scientific | BP904 | |
| Arabinose | Fisher Scientific | BP2504 | |
| pBAD24 Expression Vector | ATCC | 87399 | |
| pBAD33 Expression Vector | ATCC | 87402 |
References
- Jackel, C., Kast, P., Hilvert, D. Protein design by directed evolution. Annual review of biophysics. 37, 153-173 (2008).
- Liu, L., Li, Y., Liotta, D., Lutz, S. Directed evolution of an orthogonal nucleoside analog kinase via fluorescence-activated cell sorting. Nucleic acids research. 37, 4472-4481 (2009).
- Fischetti, V. A. Bacteriophage lysins as effective antibacterials. Curr. Opin. Microbiol. 11, 393-400 (2008).
- Fischetti, V. A., Nelson, D., Schuch, R. Reinventing phage therapy: are the parts greater than the sum. Nat. Biotechnol. 24, 1508-1511 (2006).
- Loessner, M. J. Bacteriophage endolysins--current state of research and applications. Curr. Opin. Microbiol. 8, 480-487 (2005).
- Nelson, D., Schuch, R., Chahales, P., Zhu, S., Fischetti, V. A. PlyC: A multimeric bacteriophage lysin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 10765-10770 (2006).
- Nelson, D., Loomis, L., Fischetti, V. A. Prevention and elimination of upper respiratory colonization of mice by group A streptococci using a bacteriophage lytic enzyme. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 4107-4112 (2001).
- Filatova, L. Y., Becker, S. C., Donovan, D. M., Gladilin, A. K., Klyachko, N. L. LysK, the enzyme lysing Staphylococcus aureus cells: specific kinetic features and approaches towards stabilization. Biochimie. 92, 507-513 (2010).
- Varea, J., et al. Structural and thermodynamic characterization of Pal, a phage natural chimeric lysin active against pneumococci. J. Biol. Chem. 279, 43697-43707 (2004).
- Sanz, J. M., Garcia, J. L., Laynez, J., Usobiaga, P., Menendez, M. Thermal stability and cooperative domains of CPL1 lysozyme and its NH2- and COOH-terminal modules. Dependence on choline binding. J. Biol. Chem. 268, 6125-6130 (1993).
- Anderson, G., Scott, M. Determination of product shelf life and activation energy for five drugs of abuse. Clin. Chem. 37, 398-402 (1991).
- Kim, G. J., Cheon, Y. H., Kim, H. S. Directed evolution of a novel N-carbamylase/D-hydantoinase fusion enzyme for functional expression with enhanced stability. Biotechnol. Bioeng. 68, 211-217 (2000).
- Koutsioulis, D., et al. Directed evolution on the cold adapted properties of TAB5 alkaline phosphatase. Protein Eng. Des. Sel. 21, 319-327 (2008).
- McCarthy, J. K., Uzelac, A., Davis, D. F., Eveleigh, D. E. Improved catalytic efficiency and active site modification of 1,4-beta-D-glucan glucohydrolase A from Thermotoga neapolitana by directed evolution. J. Biol. Chem. 279, 11495-11502 (2004).
- Ren, C., Chen, T., Zhang, J., Liang, L., Lin, Z. An evolved xylose transporter from Zymomonas mobilis enhances sugar transport in Escherichia coli. Microbial cell factories. 8, 66 (2009).
- Tsuzuki, K. Thermostable mutants of the photoprotein aequorin obtained by in vitro evolution. J. Biol. Chem. 280, 34324-34331 (2005).
- Eijsink, V. G., Gaseidnes, S., Borchert, T. V., vanden Burg, B. Directed evolution of enzyme stability. Biomolecular engineering. 22, 21-30 (2005).
- Kumar, S., Nussinov, R. How do thermophilic proteins deal with heat. Cell. Mol. Life Sci. 58, 1216-1233 (2001).
- Hibbert, E. G., Dalby, P. A. Directed evolution strategies for improved enzymatic performance. Microb. Cell Fact. 4, 1475-2859 (2005).
- Rasila, T. S., Pajunen, M. I., Savilahti, H. Critical evaluation of random mutagenesis by error-prone polymerase chain reaction protocols, Escherichia coli mutator strain, and hydroxylamine treatment. Anal. Biochem. 388, 71-80 (2009).
- Wong, T. S., Roccatano, D., Zacharias, M., Schwaneberg, U. A statistical analysis of random mutagenesis methods used for directed protein evolution. J. Mol. Biol. 355, 858-871 (2006).
- Arnold, F. H., Wintrode, P. L., Miyazaki, K., Gershenson, A. How enzymes adapt: lessons from directed evolution. Trends in biochemical sciences. 26, 100-106 (2001).
