Summary
שיטת אבולוציה מכוונת רומן ספציפית לתחום הנדסת thermostability פותחה וכתוצאה מכך תוקפת לאנזימי bacteriolytic. לאחר סיבוב אחד בלבד של mutagenesis האקראי, אנזים bacteriolytic התפתח, PlyC 29C3, מוצג יותר מכפולה מפעילות שיורית בהשוואה לחלבון פרא מהסוג לאחר דגירת טמפרטורה גבוהה.
Abstract
אבולוציה מכוונת מוגדרת כשיטה לרתום ברירה טבעית כדי להנדס חלבונים לרכישת נכסים מסוימים שאינם משויכים לחלבון בטבע. ספרות ספקה דוגמאות רבות לעניין ביצוע האבולוציה מכוונת לשנות הסגולי וקטליזה 1 מולקולרי בהצלחה. היתרון העיקרי של ניצול אבולוציה מכוונת במקום גישות רציונאליות מבוססות יותר להנדסה מולקולרית מתייחס להיקף והמגוון של זנים שונים שיכול להיות מוקרן 2. יישום אפשרי אחת של אבולוציה מכוונת כרוך בשיפור יציבות מבנית של אנזימי bacteriolytic, כגון endolysins. Bacteriophage לקודד ולהביע endolysins לhydrolyze קשר קוולנטי קריטי בpeptidoglycan (כלומר תא קיר) של חיידקים, וכתוצאה מתמוגה מארח תא ושחרור נגיפי צאצאים. יש לציין, אנזימים אלה בעלי היכולת extrinsically כדי לגרום לתמס susceptחיידקים ניכרו בו כלל בהעדר phage ויתר על כן אומתו היא במבחנת in vivo לפוטנציאל הטיפולי שלהם 3-5. נושא לימוד האבולוציה המכוונת כרוך endolysin PlyC, אשר מורכב מיחידות משנת PlyCA וPlyCB 6. כאשר מטוהר והוסיף extrinsically, holoenzyme PlyC lyses קבוצה סטרפטוקוקוס (גז), כמו גם קבוצות אחרות סטרפטוקוקלי בעניין של שניות ויתר על כן אומת in vivo נגד 7 גז. באופן משמעותי, ניטור קינטיקה אנזים שיורית לאחר דגירת טמפרטורה גבוהה מספק ראיות ברורות שPlyC מאבד פעילות מס בפתאומיות ב 45 מעלות צלזיוס, מה שמרמז חיים קצרים טיפוליים מדף, שעשוי להגביל את פיתוח נוסף של אנזים זה. מחקרים נוספים מגלים חוסר יציבות תרמית נצפה רק למקטע PlyCA, ואילו מקטע PlyCB יציב עד ~ 90 ° C (תצפית לא פורסם). בנוסף לPlyC, יש יםדוגמאות everal בספרות המתארות את האופי של thermolabile endolysins. לדוגמה, Staphylococcus aureus endolysin LysK וStreptococcus pneumoniae endolysins רב"ט-1 ופאל מאבדים פעילות ספונטנית בגיל 42 מעלות צלזיוס, 43.5 מעלות צלזיוס ו50.2 ° C, בהתאמה 8-10. לפי משוואת ארהניוס, המספר את קצב תגובה כימית להווה הטמפרטורה במערכת המסוימת, עלייה בthermostability תהיה לתאם עם עלייה בתוחלת חיי מדף 11. לשם כך, אבולוציה מכוונת הוכחה להיות כלי שימושי לשינוי פעילות התרמית של מולקולות שונות בטבע, אך מעולם לא בטכנולוגיה המסוימת הזה נוצלה בהצלחה לחקר אנזימי bacteriolytic. כמו כן, חשבונות המוצלחים של התקדמות היציבות המבנית של הסוג המסוים הזה של antimicrobials לחלוטין אינם קיימים. בסרטון הזה, אנו מעסיקים מתודולוגיה חדשנית המשתמשת שגיאות יחסי ציבורDNA פולימראז אחד ואחרי תהליך סינון אופטימיזציה באמצעות פורמט צלחת microtiter גם 96 לזיהוי מוטציות למקטע PlyCA של endolysin סטרפטוקוקלי PlyC שתואמים לעלייה ביציבות הקינטית אנזים (איור 1). תוצאות לאחר רק סיבוב אחד של mutagenesis האקראי מציעות מתודולוגיה היא יצירת גרסות PlyC ששומרות יותר מפעמי פעילות שיורית בהשוואה לפרא מסוג (WT) PlyC לאחר טיפול טמפרטורה גבוהה.
Protocol
1. קביעת תנאים אופטימליים הסקה
ראשית, יש לקבוע באופן ניסיוני את טמפרטורת הדגירה האופטימלית וזמן לשימוש עבור שלב החימום בבדיקה. עבור דגם PlyC, חשוב לציין כי ה coli שיתוף שינה-עם גני plyCB plyCA ועל פלסמידים ביטוי נפרדים הוכח בצורת holoenzyme PlyC מתפקד במלואה 6. הכנת 96 גם microtiter הצלחת כמו גם בתנאי צמיחת תא וטכניקת ציפוי ההעתק לאחר הותאמה מדוגמאות הניתנות בספרות 12-16. זמן דגירה של 30 דקות יהיה מתאים לבדיקה זו כתוצאות מניסויים קודמים איון תרמיים להכתיב אובדן מהיר בפעילות במהלך דגירה קצרת טווח בסביבות עולות טמפרטורה פיזיולוגית (תצפית לא פורסם). הטמפרטורה האופטימלית לדגירת PlyC הובהרה על ידי השלבים הבאים:
- טראןsform ביטוי מבנה pBAD24: plyCA (Amp r) לתוך ה המוסמכת coli להתאמץ DH5α pBAD33: plyCB (CM r).
- פלייט את transformants על צלחת וריא-Bertani (LB) אגר השלימה עם אמפיצילין (100 מיקרוגרם / מ"ל) וchloramphenicol (35 מיקרוגרם / מ"ל). דגירת צלחות הלילה בשעת 37 ° C.
- עם קיסם סטרילי, לחסן מושבת פרט לכל שורה של בארות (איור 2a) ב96 סטרילי, ברור, עם תחתית שטוחה היטב, התנסחויות צלחת microtiter המכילה 200 μl של LB בתוספת עם אמפיצילין וchloramphenicol.
- מקום מאובטח לוחית microtiter 96 גם על 37 מעלות צלזיוס רועדת חממה ולגדל את חיידקי לילה ב300 סל"ד.
- תחזר את צלחת microtiter 96 גם מ37 מעלות צלזיוס חממה רועדת וצלחת העתק לצלחת microtiter חדשה 96 גם באופן בא:
- הוסף 180 μl של LB בתוספת עם אמפיצילין וchloramphenicolלכל אחד גם מצלחת ההעתק.
- להעביר 20 μl של חיידקים מהצלחת המקורית לבארות המתאימות בצלחת ההעתק. זה אמור לגרום OD 600 ראשוניים של ~ 0.5.
- מקום מאובטח לוחית ההעתק על 37 מעלות צלזיוס חממה רועדת ודגירת הצלחת לשעה 1 ב300 סל"ד, ואז מוסיף את inductant. במקרה של מערכות ביטוי pBAD, inductant הוא arabinose 0.25%. מערכות ביטוי אחרות עשויות לדרוש inductants שונה. הנח את הצלחת אל 37 מעלות צלזיוס חממה רועדת ורעידות ב 300 סל"ד עבור 4 שעות נוספות כדי לאפשר לביטוי חלבון. רמות ביטוי בדרך כלל בטווח שבין 10-20 מיקרוגרם של PlyC.
- ברגע שביטוי החלבון הגיע למסקנה, לשלוף את צלחת ההעתק וגלול את החיידקים על ידי צבת צלחת microtiter 96 גם בצנטריפוגה בקירור שמכילה הרוטור נדנוד דלי שמתאים 96 צלחות microtiter כן. צנטריפוגה בסל"ד 3000 למשך 10 דקות בטמפרטורת חדר.
- הסר את supernatant התקשורת על ידי לאט היפוך צלחת microtiter ועדינות decanting התקשורת.
- Lyse התאים על ידי הוספת 50 μl של B-PER מגיב הפקת חלבון בקטריאלי השני לכל באר. דגירה את הצלחת בטמפרטורת חדר למשך 20 דקות.
- הגבר את עוצמת קול בכל באר עד 120 μl ידי הוספת 70 μl של פוספט נאגר המלוח (PBS) pH 7.2.
- גלולת הפסולת התאית המסיסה ידי ספינינג את הצלחת ב3000 סל"ד למשך 10 דקות ב 4 ° C בצנטריפוגה בקירור.
- העברת 110 μl של lysate הגולמי המסיס לבארות המקבילות של צלחת thermocycler 96 כן.
- באמצעות 30 דקות כזמן דגירה הקבועה מראש, לחשוף את lysates המסיס חיים כיום בצלחת גם thermocycler 96 לטווח טמפרטורה רחב המשתרע שיפוע 15-20 ° C. שים לב, המטרה היא לקבוע באיזה טמפרטורת אנזים מסוים מאבד> 95% פעילות קטליטית.
- לאחר דגירה, דגירה 96 גםצלחת thermocycler ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולהעביר 100 μl של lysates המסיס מצלחת thermocycler 96 גם למיקום הטוב המתאים להם ב96 הסופיים גם צלחת microtiter.
- עם multipipettor 12-ערוץ, להוסיף 100 μl של מתח גז D471 לכל באר. שים לב, D471 תאי lyophilized מקור מתרבויות הלילה וresuspended עם PBS pH 7.2 להשיג OD 600 של ~ 2.0.
- מייד למקם את הצלחת גם 96 בספקטרופוטומטר microplate ולנטר את הקינטיקה האנזים על ידי מדידת OD 600 בכל 15 שניות במשך 20 דקות. דגירת הטמפרטורה הנמוכה ביותר שתואמות את הבארות שחסרו שינוי בצפיפות אופטית (ΔOD ≤ 0.1) מוגדרת כטמפרטורה שאינה מתירנית.
לאחר מסך רחב טמפרטורה מבוצע כדי לזהות את טמפרטורת אוסרני, ניתן לחזור על השלבים שלעיל בטווח צר יותר של טמפרטורות (5 ° -10 ° C) להבהירטמפרטורת אוסרני המדויקת לאנזים של עניין. שימו לב, את טמפרטורת אוסרני זוהתה בבדיקה זו עשויה להיות שונה מטמפרטורת ההתכה הובהרה באמצעים אחרים בשל הבדלים בנפח, ריכוז, וכו '
2. יצירת ספריית Mutant
יצירת ספריית המוטציה שיוקרה באופן אקראי כרוכה בשילוב מוטציות ידי DNA פולימראז נוטה לטעות עם הטית נוקלאוטיד מינימאלית בגן plyCA באמצעות ערכת mutagenesis האקראית GeneMorph השנייה כדלקמן:
- עיצוב פריימרים נוקלאוטיד עם טמפרטורות דומות נמסות (T מ ') בין 55-72 המעלות צלזיוס עם אתרי ההגבלה של בחירה ב5' ו 3 'קצוות של גן plyCA.
- הואיל ושיעור המוטציה הרצויה הוא 2-3 נוקלאוטידים לplyCA (1.4 ק"ג), השתמש בריכוזי PCR תגובת הרכיב, כמו גם את תנאי thermocycler המומלצים על ידי היצרן לו מוטציה נמוכהrequencies (0-4.5 לKB).
- לשבט את גני plyCA mutagenized לתוך וקטור הביטוי pBAD24.
- להפוך את המבנים לDH5α pBAD33: רקע plyCB וtransformants צלחת על צלחות אגרו LB עם אמפיצילין ותוספת chloramphenicol.
- בנוסף, ולהפוך את הצלחת DH5α pBAD33: plyCB עם וקטור הביטוי pBAD24 המכיל את גן plyCA WT. מושבות מצלחת זה תשמשנה את הבקרות במהלך הקרנה.
3. הכנת 96 ובכן Microtiter פלייט ותנאי צמיחת תאים
- ממלא כל היטב של צלחת microtiter 96 גם עם 200 μl של LB בתוספת עם אמפיצילין וchloramphenicol.
- בעקבות הצלחת סכמטי microtiter (האיור 2b), בחר בזהירות מושבת פרט מהצלחות אגרו הלילה עם קיסם לעקר ולחסן את החיידקים במיועדים גם של 96 גם microtiter PLAטה. זה חיוני כדי להבטיח רק אחד למושבה גם היא מחוסנת.
- נער את צלחת microtiter גם המעוגנת היטב 96 ב 300 סל"ד הלילה בשעת 37 ° C.
4. ציפוי Replica, אינדוקצית ביטוי חלבון והכנת lysate
- בצע את השלבים 1.5-1.11 מהסעיף שכותרתו "קביעת תנאי החימום האופטימליים" עם שינוי אחד. אחסן את הצלחת המקורית ב 4 ° C לאחר שלב ציפוי ההעתק הגיע למסקנה.
- לאחר השלב 1.11, 110 μl העברת lysate הגולמי המסיס לבארות המקבילות של צלחת thermocycler 96 גם למעט השליטה החיובית הבארות A1-D1. אשר להתפתחות החיובית lysates הבקרה (lysates כלומר שאינם מחוממים), 100 μl העברת lysates לבארות המקבילות בצלחת חדשה 96 גם microtiter שתשמש כצלחת assay הסופית לניסוי והחנות על קרח.
5. טיפול בחום lysate מסיס
- מחמם את השליטה השלילית וlysates המסיס מוטציה מוגבלת כיום בצלחת thermocycler גם 96 בthermocycler למשך 30 דקות בטמפרטורת אוסרני הדגירה האופטימלית קבעה בשלב 1.
- לאחר הדגרה בטמפרטורה שאינה מתירנית, דגירת צלחת thermocycler 96 גם ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
- העברת 100 μl של lysates המסיס מצלחת thermocycler 96 גם כן למקומות שלהם, הזהים בצלחת הסופית 96 גם microtiter assay כבר מכילה את lysates מסיס הבקרה החיובית.
- עם multipipettor 12-ערוץ, להוסיף 100 μl של מתח גז D471 לכל באר. מייד למקם את הצלחת בספקטרופוטומטר microplate.
- פקח את הקינטיקה האנזים על ידי מדידת OD 600 בכל 15 שניות במשך 20 דקות.
- גרסת PlyC עם התנהגות תרמית התקדמה מוגדרת כמבנה שיכול להקטין את הצפיפות האופטית המקורית של 50 אחוזים בפחות מ 900 שניות בטמפרטורת אוסרני. בנוסף, הפקדים החיוביים (כלומר שאינם מחומם, WT PlyC) צריכים להציג את הפעילות הקטליטית של WT (t 1/2 ≤ 100 שניות) והפקדים השליליים (כלומר מחומם, WT PlyC) צריכים להיות נטולי פעילות.
- ברגע שגרסת PlyC עם התקדמה התנהגות תרמית מזוהית, לשלוף את הצלחת המקורית מאוחסנת ב 4 ° C וחיידקים לחסן מהפרט היטב הספציפי למוטציה של עניין לתקשורת LB הטריה בתוספת עם אמפיצילין וchloramphenicol. לגדול בידוד לילה בשעת 37 ° C.
- חלץ ולטהר DNA פלסמיד מהתרבות ולאחר מכן להגיש עבור סידור על מנת לזהות את מוטציות שנוקלאוטיד להסיק התנהגות תרמית משופרת לPlyCA. בנוסף, להשלים aliquot קטן מתרבות הלילה עם גליצרול 10% ולאחסן ב -80 ° C לשימוש נוסף.
Representative Results
בסיומו של הסיבוב הראשון של mutagenesis האקראי, למעלה מ -6,000 מוטציות PlyC הוקרנו וסך של 35 מוטנטים עם התנהגות תרמית גדלה פוטנציאל זוהו, נבחר ורוצף. ניתוח גנומי, המסוכם בטבלה אני, עולה כי מתוך 35 מועמדים, 7 מהמבנים הכלולים רצפי WT PlyCA ברמת תרגום, מקביל לחיוביים שגויות שזוהה על ידי השמאי. מתוך 28 מועמדים שנותרו, מגוון המוטציה היה 1-6 מוטציות נוקלאוטיד עם שיעור מוטציות ממוצעת של 2.75 נוקלאוטידים לplyCA גן, שהיה בטווח המוטציה נוקלאוטיד 2-3 היינו מיקוד. ברמת translational, טווח זה בפרט נוקלאוטיד מוטציה ותדירות הניבו מגוון מוטצית חומצת אמינו של 1 עד 5 חומצות אמינו, בשיעור ממוצע של 1.9 מוטצית מוטציות חומצת אמינו לPlyCA פוליפפטיד.
מתוך 28 מועמדים בעלי mutat חומצה אמינית אחת לפחותיון, ארבעת מבנים מוטנטים אלה נבחרו באופן אקראי לאפיון נוסף כדי לאמת שתהליך המיון הנרחב של מתודולוגיה האבולוציה המכוונת אכן מתפקד כראוי. אנזימי PlyC המוטציה טוהרו ל> הומוגניות 95% המבוססת על ניתוח SDS-PAGE כפי שתואר לעיל 6-7. קינטיקה של אנזימי WT PlyC וכל אחד מארבעת מוטנטים PlyC התאפיינו בריכוזים טוחנים שווים לאחר דגירת האנזימים המטוהרים בטמפרטורות גבוהות שונות. פעילות הייתה פיקוח לאחר התוספת של D471 גז על ידי מדידת הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר כל 15 שניות במשך 20 דקות. פעילות הוגדרה כמהירות המרבית השייר של האנזים לאחר דגירת חום. מתוך ארבעה מועמדים שנבחרו באקראי לאפיון נוסף, המוטציה 29C3 הראה התנהגות התרמית המשופרת ביותר. התנהגות התרמית של WT PlyC ו29C3 נחקרה בטמפרטורות שונות תוך דוגרת וassaying לפעילות ב PBS pH 7.2 ב80 ננומטר ו40 ריכוזים ננומטר, בהתאמה. את 45-50 מעלות ניסויי דגירת C (איור 3) בוצעו בthermocycler בי הדגימות הודגרו בצלחת דקת דופן גם 96 thermocycler בהיקף כולל של 120 μl. 35 ° C, 40 ° C ו 45 ° C ניסויי דגירה (איור 4 ו 5) בוצעו בגוש חום שבו הדגימות הודגרו בצינור microcentrifuge מ"ל 1.5 בנפח כולל של 1.3 מ"ל. כל הניסויים בוצעו בtriplicates.
WT PlyC ו29C3 לא הראו הבדל משמעותי ביציבות הקינטית בטמפרטורת חדר (25 מעלות צלזיוס) כפי שהוא מתואר במערכה הראשונה של ברים באיור 3. עם זאת, לאחר דגירה קצרת טווח למשך 30 דקות מטמפרטורות הנעות 45-50 ° C, פעילות 29C3 הייתה משמעותי יותר מהפעילות הספציפית לWT לבנות בכל נקודת טמפרטורה. לדוגמה, WT PlyC מוצג אובדן 44% בפעילות ב45.2מעלות צלזיוס ואילו 29C3 הראה רק ירידה של 2% בפעילות באותה הטמפרטורה.
מחקרי דגירה ארוך טווח המשווים את הפעילות שיורית של שניהם WT PlyC ו29C3 בוצעו בנוסף על 35 ° C ו 40 ° C מעורב המדידה של פעילות שיורית לאחר 24 ו 48 נקודתי זמן hr. בגיל 35 מעלות צלזיוס, 29C3 מוצג 41% ופעילות 176% יותר מאשר WT PlyC ב24 ו 48 נקודתי hr דגירת זמן, בהתאמה (איור 4 א). בגיל 40 מעלות צלזיוס, 29C3 מוצג 28% ופעילות 107% גבוהה יותר מאשר WT PlyC ב24 ו 48 נקודתי hr דגירת זמן, בהתאמה (איור 4 ב).
פעילות השייר של WT PlyC ו29C3 גם השגיחה על כל 20 דקות עבור סכום כולל של 3 שעות ב 45 ° C. WT PlyC, הצליח לשמור על פעילות 21% לאחר דגירת 3 שעות בטמפרטורה זו ואילו 29C3, הצליח לשמור על פעילות 46% בלבד. זמן מחצית החיים (t 1/2) לWT PlyC ו29C3 היו 67 ו147 דקות, בהתאמה, מציע ing ש29C3 יש גידול של פי 2.2 ביציבות הקינטית ב45 ° C (איור 5).
| 1 מועמדים עגולים סך | 35 |
| מועמדים בעלי רצף PlyCA WT | 7 |
| מועמדים בעלי ≥ מוטצית חומצת אמינו 1 | 28 |
| - ריבית ממוצעת מוטצית נוקלאוטיד (NT / plyCA) | 2.75 |
| - טווח מוטצית נוקלאוטיד (NT) | 1-6 |
| - ריבית הממוצעת מוטצית חומצת אמינו (AA / PlyCA) | 1.9 |
| - טווח מוטצית חומצת אמינו (AA) | 1-5 |
טבלת 1. ניתוח הגנום מאגר מועמדים.
pload/4216/4216fig1highres.jpg "/>
איור 1. המתודולוגיה assay אבולוציה מכוונת. באבולוציה מכוונת, אחד מתחילה עם אנזים העופרת, שיהיה PlyC WT לסיבוב הראשון. ספרייה של מוטציות המכילות מוטציות PlyC נוקלאוטיד משוחדות אקראיות לגן plyCA אז נבנה על ידי DNA פולימראז נוטה לטעות, משובטת לתוך וקטור הביטוי pBAD24 והפכה לE. coli להתאמץ DH5α כבר מכיל pBAD33:. plyCB transformants הבודד מחוסן לתוך ספציפי שלהם גם מצלחת microtiter 96 כן. דרך תהליך מיון מקיף, מוטנטים PlyC בודדים שcatalytically פעילים לאחר דגירה בטמפרטורה שאינה מותרת מסווגים כמוטנטים עם יציבות הקינטית משופרת. Theconstruct מציג התנהגות התרמית התקדמה ביותר וכתוצאה מכך הופכת את האנזים להוביל לסיבוב הבא של mutagenesis האקראי. בסך הכל, יש שלושה סיבובים מלאים של randoמ 'mutagenesis אחרי דשדוש DNA וכתוצאה ממולקולת bacteriolytic עם התנהגות תרמית התפתחה. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 2. 96 תבניות גם microtiter צלחת assay אבולוציה מכוונת. סכמטי צלחת microtiter במהלך קביעת תנאי החימום האופטימליים (איור 2a) מורכבת מinoculating שיבוט PlyC אחד הורי WT לכל שורה של צלחת microtiter. סכמטי צלחת microtiter במהלך הקרנת מוטציה (האיור 2b) מורכב מכל inoculating גם בעמודה 1 עם שיבוט WT הורי ייחודי PlyC כמו גם inoculating כל באר בעמודות 2-12 עם שיבוט מוטצית PlyC מובהק. הוולס A1-D1 מיועד לבקרה ההורית החיובית, אשר שיתוףnsist של WT PlyC בונה אינה חשוף לדגירת טמפרטורה שאינה מותרת. ולס E1-H1 מיועד לבקרה ההורית השלילית, שמורכבת ממבני WT PlyC כי הם חשופים לטמפרטורת דגירה שאינה מותרת.
איור 3. ניתוח שיורי פעילות הקינטית השוואת WT PlyC ו29C3. אנזימים טוהרו להומוגניות ודגר למשך 30 דקות בthermocycler בריכוזים טוחנים שווים בשתי טמפרטורת חדר או בשיפוע טמפרטורה הנע 45-50 ° C. פעילות האנזימטית בקורלציה עם המהירות המרבית מוצגת לאחר דגירת טמפרטורה מסוימת. למעט 25 מעלות צלזיוס ו47.7 מעלות צלזיוס, השינוי בפעילות בין WT ו29C3 בכל טמפרטורה המתואמת p-value <0.05. כל הנתונים מדווחים כממוצע ± SEM של שלושה ניסויים עצמאיים. 
איור 4. ניתוח הקינטית פעילות שיורי השוואת WT PlyC ל29C3 ב 35 ° C ו 40 ° ריכוזים טוחנים שוויון ג המטוהרים WT PlyC ו29C3 הודגרו בחום בבלוק 35 ° C (איור 4 א) או 40 ° C (איור 4 ב). פעילות אנזים השיורים נמדדה ב 24 ו 48 נקודתי זמן hr. הפעילות מוצגת על ידי כל מבנה הייתה מנורמלת למהירות המרבית מוצגת בנקודת אפס זמן. הווריאציה בפעילות בין WT ו29C3 בכל נקודת זמן וטמפרטורה מתואמת p-value <0.05. כל הנתונים מדווחים כממוצע ± SEM של שלושה ניסויים עצמאיים.
איור 5. ניתוח הקינטית פעילות שיורי השוואהWT PlyC ל29C3 ב 45 ° ריכוזים טוחנים שוויון ג המטוהרים WT PlyC ו29C3 הודגרו בחום בבלוק 45 ° C ופעילות אנזים השיורים נמדדה כל 20 דקות במשך 3 שעות. הפעילות מוצגת על ידי כל מבנה הייתה מנורמלת למהירות המרבית מוצגת בנקודת אפס זמן. למעט נקודתי הנתונים ב20 דקות, הווריאציה בפעילות בין WT ו29C3 בכל נקודת זמן בקורלציה לp-value <0.05. כל הנתונים מדווחים כממוצע ± SEM של שלושה ניסויים עצמאיים.
Discussion
פרוטוקול זה, שמתואר באיור 1, מציג מתודולוגיה 96 גם microtiter צלחת שמאפשרת לנצל את האבולוציה מכוונת כדי להגדיל את thermostability של כל אנזים bacteriolytic. באמצעות השימוש בDNA פולימראז נוטה לטעות, אפשר להציג מוטציות אקראיות המגבירות את היציבות הקינטית הכוללת של המולקולה תורגמה bacteriolytic של עניין, שהוא בדרך כלל עקב ארגון מחדש מולקולרי המורכבים של הגדלה אלקטרוסטטית, גשר disulphide והידרופובי אינטראקציות שיוצרות השתפר אריזה מולקולרית, שינויים משופרים של רשתות או חיזוקה של מדינת oligomerization גבוהה 17-18 מטען על פני שטח. לאחר המבוא של מוטציות נוקליאוטידים, הליך מיון נרחב היה אז בשימוש לזיהוי מוטציות התרמית מועילות. התוצאות המייצגות מובאות בפרק זה מבוסס על אחד מסיבובי mutagenesis האקראי. במציאות, זה הוצע כילפחות שלושה סיבובים רצופים של mutagenesis האקראי, כל אחד באמצעות מוטציה החזקה ביותר כאנזים עופרת, ואחריו ה-DNA הדשדוש מתאים לסוגים אלה של מחקרי התנהגות תרמית מכוונת אבולוציה 2.
חשוב להבין כי בעוד פרוטוקול זה מזהה מוטציות שלהגדיל יציבות קינטית, גרסות אלו אינן בהכרח הגדילו thermostability. מולקולה נחשבת thermostable כאשר יש לו את היכולת לשמור על המבנה שלו בטמפרטורה גבוהה. עם זאת, בבדיקה שהוצגה, הפעילות שיורית של lysates המוטציה אינה assayed באותה הטמפרטורה שהודגרו בתחילה בבמהלך שלב הטיפול בחום ובכך ניתן תהיה בחירה למוטציות שמקדמות refolding במקום thermostability המשופר 19. בעוד אנו חיוץ התנהגות תרמית כאינדיקציה ליציבות תרמית, יציבות תרמית אמיתית יש למדוד באופן אמפירי על ידי biophysשיטות פורמאליות, כגון החוזר dichroism (CD), calorimetry סריקת ההפרש (DSC) וfluorimetry סריקת ההפרש (DSF). נתונים ראשוניים מניסויי CD וDSF מראים כי מספר מועמדים שזוהו מהמתודולוגיה שהוצגה אכן להציג thermostability התקדם (מידע לא מוצג).
למרות שהמתודולוגיה הוצגה כאן היא ספציפית ליישום התנהגות תרמית עלתה ל PlyC, אותה מתודולוגיה זו יכולה בנוסף להיות מועסקת על מנת לשפר את פעילות תרמית לאנזימי bacteriolytic אחרים עם כמה שינויים קלים למשתנים כגון מאגרים, שיעורי מוטציה, תנאי חימום ומערכות ביטוי. משתנה קריטי אחת קשור assay זה מתייחס לשיעור מוטציות נוקלאוטיד של DNA פולימראז המועדת לטעויות. אנחנו בחרנו להשתמש DNA פולימראז נוטה לטעות Mutazyme השני בassay האבולוציה המכוונת בשל ראיות ניסיוניות מציעות אנזים המסוים הזה מציג את הכמות המינימאלית של הטיה עםלגבי שנוקלאוטידים משולבים באופן אקראי לגן של עניין בהשוואה לטכניקות mutagenesis אקראיות אחרות, כגון שימוש בhydroxylamine, המוטטורי E. זני coli ו-DNA לשגיאות אחרות polyermases 20. באופן כללי, שיעורי מוטציה נוטים להיות נמוכים רצוי יותר משתי סיבות. ראשית, thermostability הנדסה לחלבונים בדרך כלל מורכב ממספר קטנות יחסית של חומצת אמינו החלפות. שיעורי מוטציה גבוהות עלולים לגרום לשינויים מבניים דרמטיים למולקולות מסוימות שיכול בודאות לגרום misfolding המבני ופערים פונקציונליים. לדוגמה, שילוב של גליצין ושאריות פרולין יכול לשבש את מבנים משניים אלפא סליל 21. שנית, שיעורים גבוהים נוקלאוטיד מוטציה להגדיל את הסיכוי של שילוב פגי קודונים ההפסקה, וכתוצאה מכך מולקולות חתוכות שפעילים מבחינה ביולוגית. באופן כללי, שיעורי מוטציה נמוכות עדיפים בגלל תוצאה נמוכה בשיעורי שגיאות accumulation של מוטציות מסתגלות תוך שיעורי מוטציה גבוהות יותר לייצר מוטציות ניטראליות או מזיקות 22.
לכל סיבוב של mutagenesis האקראי, אחר משתנה קריטי שצריך לייעל כרוך טמפרטורת הדגירה המשמשת בתהליך המיון. בחירת הטמפרטורה הניסיונית אוסרני יחסית מאתגרת. בתחילה השתמשתי בטמפרטורת דגירה שהייתה 10 מעלות צלזיוס גבוהה יותר מאשר הטמפרטורה שאינה מתירנית של PlyC, אולם לאחר הקרנת 3000 מוטציות, לא הצליח לזהות את כל מוטציות יתרון. תזכור מתודולוגיות אבולוציה מכוונת מורכבות מזיהוי החלפות של חומצות אמיניות מועילות שיש השפעות תוסף ברצף, בו נקבע כי טמפרטורה פחות מחמירה צריכה לשמש במהלך תהליך המיון גם אם זה גדל סיכוי ליצירה מדומה חיוביים. ככזה, הייתי טמפרטורת דגירה שהייתה רק כמה מעלות מעל אינן permissטמפרטורת ive ומועמדים נבחרים rescreened כדי לשלול את השקר-החיובית.
אנחנו החלטנו לנצל טמפרטורת דגירה שלא הייתה ממוזג מדי (≤ 1 ° C גבוה מהטמפרטורה הנמוכה ביותר שאינן מתירנית) ולהפך לא קשה מדי (≥ 5 ° C גבוה מטמפרטורה הנמוכה ביותר שאינן מתירנית). הטמפרטורה האידיאלית החלטנו להשתמש בבדיקה מסוימת זה הייתה 2 מתונים ° C הגבוה יותר מאשר טמפרטורת אוסרני קבע בניסוי. בחירת טמפרטורה כי הוא קל מדי תגרום לשיעור גבוה בהרבה מזיהוי חיובי כוזב ~ 20% שנצפינו (טבלת I) בעת שימוש בטמפרטורת דגירה מתונה. יתר על כן, שימוש בטמפרטורת דגירה שהיא חריף מדי יכול סופו של דבר לגרום לחוסר היכולת לזהות מוטציות עם התנהגות תרמית משופרת באופן משמעותי. לדוגמה, שימוש בטמפרטורת דגירה של ≥ 5 ° C היה מביא לחוסר היכולת לזהות אתמבטיח מוטצית 29C3 כמו גם רוב המועמדים האחרים שנבחרו בסיבוב הראשון של הקרנה.
לסיכום, אנו מספקים פרוטוקול לאנזימי bacteriolytic הנדסיים לרכישת יציבות הקינטית משופרת. יתר על כן, אותו assay זה, בלי צעדי החימום, יכול לשמש מסך למוטציות שמגבירות את הפעילות הקטליטית. משלים גם פעילות וthermostability הקטליטי היא משוכה ההתפתחותי חשובה מול כל אנזים טיפולי. אמנם את הפרטים של פרוטוקול זה הם ספציפיים לendolysin PlyC, המתודולוגיה יכולה להיות מותאמת לכל אנזים bacteriolytic עם רק כמה שינויים. הצגנו תוצאות ראשוניות מרק הסיבוב הראשון של mutagenesis שמאמת את הפונקציונליות של assay, וכתוצאה מהיישום וזיהוי של מוטציות שיוצרות גידול בthermostability המולקולרי בסדר גודל משמעותי.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות לEmilija Renke וג'נט יו לקבלת סיוע טכני. DcN נתמך על ידי מענקים מארצות הברית מחלקת הביטחון (DR080205, DM102823, OR09055, וOR090059). RDH נתמך על ידי מענק מתחנת מרילנד חקלאות הניסוי וגרנט הדרכת NIH בתא וביולוגיה מולקולרית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B-PER II Bacterial Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 78260 | |
| GeneMorph II Random Mutagenesis Kit | Agilent Technologies | 200500 | |
| Clear 96 Well, Flat-bottomed Microtiter Plate With Lid | BD Vacutainer Labware Medical | 353072 | |
| 96 Well Nonskirted PCR Plates | Fisher Scientific | 14-230-232 | |
| Swing-bucket Rotor | Eppendorf | A-2-DWP | |
| Ampicillin Sodium Salt | Fisher Scientific | BP1760 | |
| Chloramphenicol | Fisher Scientific | BP904 | |
| Arabinose | Fisher Scientific | BP2504 | |
| pBAD24 Expression Vector | ATCC | 87399 | |
| pBAD33 Expression Vector | ATCC | 87402 |
References
- Jackel, C., Kast, P., Hilvert, D. Protein design by directed evolution. Annual review of biophysics. 37, 153-173 (2008).
- Liu, L., Li, Y., Liotta, D., Lutz, S. Directed evolution of an orthogonal nucleoside analog kinase via fluorescence-activated cell sorting. Nucleic acids research. 37, 4472-4481 (2009).
- Fischetti, V. A. Bacteriophage lysins as effective antibacterials. Curr. Opin. Microbiol. 11, 393-400 (2008).
- Fischetti, V. A., Nelson, D., Schuch, R. Reinventing phage therapy: are the parts greater than the sum. Nat. Biotechnol. 24, 1508-1511 (2006).
- Loessner, M. J. Bacteriophage endolysins--current state of research and applications. Curr. Opin. Microbiol. 8, 480-487 (2005).
- Nelson, D., Schuch, R., Chahales, P., Zhu, S., Fischetti, V. A. PlyC: A multimeric bacteriophage lysin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 10765-10770 (2006).
- Nelson, D., Loomis, L., Fischetti, V. A. Prevention and elimination of upper respiratory colonization of mice by group A streptococci using a bacteriophage lytic enzyme. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 4107-4112 (2001).
- Filatova, L. Y., Becker, S. C., Donovan, D. M., Gladilin, A. K., Klyachko, N. L. LysK, the enzyme lysing Staphylococcus aureus cells: specific kinetic features and approaches towards stabilization. Biochimie. 92, 507-513 (2010).
- Varea, J., et al. Structural and thermodynamic characterization of Pal, a phage natural chimeric lysin active against pneumococci. J. Biol. Chem. 279, 43697-43707 (2004).
- Sanz, J. M., Garcia, J. L., Laynez, J., Usobiaga, P., Menendez, M. Thermal stability and cooperative domains of CPL1 lysozyme and its NH2- and COOH-terminal modules. Dependence on choline binding. J. Biol. Chem. 268, 6125-6130 (1993).
- Anderson, G., Scott, M. Determination of product shelf life and activation energy for five drugs of abuse. Clin. Chem. 37, 398-402 (1991).
- Kim, G. J., Cheon, Y. H., Kim, H. S. Directed evolution of a novel N-carbamylase/D-hydantoinase fusion enzyme for functional expression with enhanced stability. Biotechnol. Bioeng. 68, 211-217 (2000).
- Koutsioulis, D., et al. Directed evolution on the cold adapted properties of TAB5 alkaline phosphatase. Protein Eng. Des. Sel. 21, 319-327 (2008).
- McCarthy, J. K., Uzelac, A., Davis, D. F., Eveleigh, D. E. Improved catalytic efficiency and active site modification of 1,4-beta-D-glucan glucohydrolase A from Thermotoga neapolitana by directed evolution. J. Biol. Chem. 279, 11495-11502 (2004).
- Ren, C., Chen, T., Zhang, J., Liang, L., Lin, Z. An evolved xylose transporter from Zymomonas mobilis enhances sugar transport in Escherichia coli. Microbial cell factories. 8, 66 (2009).
- Tsuzuki, K. Thermostable mutants of the photoprotein aequorin obtained by in vitro evolution. J. Biol. Chem. 280, 34324-34331 (2005).
- Eijsink, V. G., Gaseidnes, S., Borchert, T. V., vanden Burg, B. Directed evolution of enzyme stability. Biomolecular engineering. 22, 21-30 (2005).
- Kumar, S., Nussinov, R. How do thermophilic proteins deal with heat. Cell. Mol. Life Sci. 58, 1216-1233 (2001).
- Hibbert, E. G., Dalby, P. A. Directed evolution strategies for improved enzymatic performance. Microb. Cell Fact. 4, 1475-2859 (2005).
- Rasila, T. S., Pajunen, M. I., Savilahti, H. Critical evaluation of random mutagenesis by error-prone polymerase chain reaction protocols, Escherichia coli mutator strain, and hydroxylamine treatment. Anal. Biochem. 388, 71-80 (2009).
- Wong, T. S., Roccatano, D., Zacharias, M., Schwaneberg, U. A statistical analysis of random mutagenesis methods used for directed protein evolution. J. Mol. Biol. 355, 858-871 (2006).
- Arnold, F. H., Wintrode, P. L., Miyazaki, K., Gershenson, A. How enzymes adapt: lessons from directed evolution. Trends in biochemical sciences. 26, 100-106 (2001).
