Summary
एक उपन्यास निर्देशित विकास thermostability इंजीनियरिंग के क्षेत्र के लिए विशिष्ट विधि विकसित किया गया था और फलस्वरूप जीवाणुलयनी एंजाइमों के लिए मान्य है. बाद केवल एक यादृच्छिक mutagenesis के दौर, एक विकसित जीवाणुलयनी एंजाइम, PlyC 29C3, दो बार अवशिष्ट गतिविधि से अधिक ऊंचा तापमान ऊष्मायन के बाद जंगली प्रकार के प्रोटीन की तुलना में प्रदर्शित.
Protocol
1. इष्टतम ताप स्थितियां का निर्धारण
सबसे पहले, एक प्रयोगात्मक इष्टतम ऊष्मायन तापमान और परख में हीटिंग कदम के लिए उपयोग करने के लिए समय निर्धारित करना चाहिए. हमारे PlyC मॉडल के लिए, यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि ई. अलग अभिव्यक्ति plasmids पर plyCA और plyCB जीन के साथ सह तब्दील कोलाई एक पूरी तरह कार्यात्मक PlyC holoenzyme 6 फार्म दिखाया गया है. 96 अच्छी तरह microtiter थाली के रूप में सेल के विकास की स्थिति और बाद प्रतिकृति चढ़ाना तकनीक के रूप में अच्छी तरह से तैयारी 12-16 साहित्य में दिए गए उदाहरणों से रूपांतरित किया गया. 30 मिनट की एक ऊष्मायन समय इस परख के लिए उपयुक्त हो सकता है पिछले थर्मल निष्क्रियता प्रयोगों से परिणाम के रूप में शारीरिक तापमान (अप्रकाशित अवलोकन) से बाहर के वातावरण में अल्पकालिक ऊष्मायन के दौरान एक गतिविधि में तेजी से नुकसान हुक्म चलाना होगा. PlyC लिए इष्टतम ऊष्मायन तापमान निम्नलिखित कदम से elucidated था:
- ट्रॅनसक्षम ई. में plyCA (एएमपी r): अभिव्यक्ति का निर्माण pBAD24 sform plyCB (सेमी r): कोलाई DH5α pBAD33 तनाव.
- एक Luria Bertani (पौंड) अगर एम्पीसिलीन (100 ग्राम / एमएल) और chloramphenicol (35 ग्राम / एमएल) के साथ पूरक प्लेट पर transformants प्लेट. प्लेटें 37 पर रातोंरात सेते डिग्री सेल्सियस
- एक बाँझ दन्तखुदनी के साथ, कुओं (2a चित्रा) की प्रत्येक पंक्ति में एक बाँझ, स्पष्ट, फ्लैट तली अच्छी तरह से 96 में एक व्यक्ति कॉलोनी टीका लगाना, microtiter प्लेट कि एम्पीसिलीन और chloramphenicol साथ पूरक लेग के 200 μl शामिल lidded.
- सुरक्षित 37 पर एक साथ 96 microtiter प्लेट जगह ° C इनक्यूबेटर मिलाते और बैक्टीरिया 300 rpm पर रातोंरात विकसित.
- 37 से 96 अच्छी तरह microtiter प्लेट पुनः प्राप्त डिग्री सेल्सियस से एक नया 96 अच्छी तरह से microtiter प्लेट मिलाते इनक्यूबेटर और प्रतिकृति थाली के रूप में इस प्रकार है:
- पौंड के 180 μl एम्पीसिलीन और chloramphenicol साथ पूरक जोड़ेंप्रतिकृति की थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से.
- मूल की थाली से प्रतिकृति थाली में इसी कुओं के लिए बैक्टीरिया की 20 μl स्थानांतरण. यह एक प्रारंभिक आयुध डिपो ~ की 600 0.5 में परिणाम चाहिए.
- सुरक्षित 37 पर प्रतिकृति थाली जगह ° सी इनक्यूबेटर मिलाते हुए और 300 rpm पर 1 घंटे के लिए थाली सेते हैं, तो inductant जोड़ने. , PBAD अभिव्यक्ति सिस्टम के मामले में inductant 0.25% arabinose है. अन्य अभिव्यक्ति सिस्टम अलग inductants की आवश्यकता हो सकती है. थाली 37 पर जगह वापस ° C इनक्यूबेटर और शेक प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए अनुमति देने के लिए एक अतिरिक्त 4 घंटा के लिए 300 rpm पर मिलाते हुए. अभिव्यक्ति के स्तर आमतौर पर PlyC की 10-20 ग्राम के बीच सीमा होती है.
- एक बार प्रोटीन अभिव्यक्ति निष्कर्ष निकाला है, एक प्रशीतित अपकेंद्रित्र है कि है कि 96 अच्छी तरह प्लेटें microtiter फिट एक झूलते बाल्टी रोटर में 96 अच्छी तरह microtiter थाली रखने के द्वारा प्रतिकृति थाली और बैक्टीरिया गोली निकालते. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 3,000 rpm पर अपकेंद्रित्र.
- धीरे धीरे inverting microtiter प्लेट द्वारा मीडिया तैरनेवाला निकालें और धीरे मीडिया decanting.
- एक अच्छी तरह से बी प्रतिशत द्वितीय बैक्टीरियल प्रोटीन निष्कर्षण अभिकर्मक के 50 μl जोड़कर कोशिकाओं lyse. कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए थाली सेते हैं.
- 120 μl फॉस्फेट की 70 μl जोड़कर प्रत्येक में अच्छी तरह मात्रा बढ़ाएँ buffered खारा (पीबीएस) 7.2 पीएच.
- गोली 3,000 rpm पर 10 मिनट 4 ° प्रशीतित अपकेंद्रित्र में सी के लिए थाली कताई द्वारा अघुलनशील सेलुलर मलबे.
- एक साथ 96 thermocycler प्लेट की इसी कुओं घुलनशील कच्चे lysate की 110 μl स्थानांतरण.
- पूर्व निर्धारित ऊष्मायन समय के रूप में 30 मिनट का उपयोग करना, घुलनशील lysates वर्तमान में अच्छी तरह से 96 thermocycler थाली में एक व्यापक ढाल तापमान 15-20 डिग्री सेल्सियस फैले रेंज रहने वाले बेनकाब नोट, लक्ष्य निर्धारित क्या तापमान एक विशेष एंजाइम> 95% उत्प्रेरक गतिविधि खो देता है.
- ऊष्मायन के बाद अच्छी तरह से 96 सेते हैं4 पर thermocycler प्लेट ° सी 5 मिनट और 96 अच्छी तरह thermocycler प्लेट से उनके अंतिम microtiter प्लेट 96 में इसी अच्छी तरह से स्थान घुलनशील lysates के 100 μl हस्तांतरण के लिए.
- एक multipipettor 12-चैनल के साथ, एक अच्छी तरह से गैस D471 तनाव के 100 μl जोड़ें. ध्यान दें, D471 कोशिकाओं मूल रातोंरात संस्कृतियों से lyophilized कर रहे हैं और साथ पीबीएस पीएच 7.2 resuspended ~ 2.0 का एक 600 आयुध डिपो को प्राप्त है.
- तुरंत microplate स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में 96 अच्छी तरह से थाली जगह और 600 आयुध डिपो में 20 मिनट के लिए हर 15 सेकंड को मापने के द्वारा एंजाइम कैनेटीक्स की निगरानी. सबसे कम तापमान ऊष्मायन कि कुओं कि ऑप्टिकल घनत्व (ΔOD ≤ 0.1) में एक परिवर्तन का अभाव corresponded गैर अनुमोदक तापमान के रूप में परिभाषित किया गया है.
एक व्यापक तापमान स्क्रीन के बाद गैर - अनुमोदक तापमान की पहचान करने के लिए किया जाता है, इसके बाद के संस्करण कदम तापमान की एक अधिक संकीर्ण सीमा (5 ° -10 डिग्री सेल्सियस) स्पष्ट पर दोहराया जा सकता हैब्याज की एंजाइम के लिए सटीक गैर अनुमोदक तापमान. नोट, गैर अनुमोदक इस परख में पहचान तापमान अन्य तरीकों से elucidated पिघलने तापमान की तुलना में अलग मात्रा में मतभेद है, एकाग्रता, आदि की वजह से हो सकता है
2. सृजन उत्परिवर्ती लाइब्रेरी
उत्परिवर्ती जांच की जानी पुस्तकालय के निर्माण बेतरतीब ढंग से एक त्रुटि प्रवण जीन plyCA में न्यूनतम nucleotide पूर्वाग्रह के रूप में निम्नानुसार GeneMorph द्वितीय यादृच्छिक mutagenesis किट का उपयोग करने के साथ डीएनए पोलीमरेज़ द्वारा शामिल म्यूटेशनों शामिल:
- 55-72 डिग्री सेल्सियस के बीच इसी तरह पिघलने (टी मीटर) 5 और 3 'जीन plyCA समाप्त होता है की पसंद के प्रतिबंध साइटों के साथ तापमान के साथ nucleotide प्राइमरों डिजाइन.
- चूंकि वांछित उत्परिवर्तन की दर plyCA प्रति 2-3 nucleotides (1.4 केबी), कम उत्परिवर्तन च के लिए पीसीआर प्रतिक्रिया घटक के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सांद्रता thermocycler निर्माता से सिफारिश की शर्तों का उपयोगrequencies (0-4.5 केबी प्रति).
- अभिव्यक्ति वेक्टर pBAD24 में mutagenized plyCA जीन क्लोन.
- लेग अगर एम्पीसिलीन और chloramphenicol साथ पूरक प्लेटों पर plyCB पृष्ठभूमि और प्लेट transformants: एक pBAD33 DH5α में constructs रूपांतरण.
- इसके अतिरिक्त, बदलना, और pBAD33 DH5α प्लेट: अभिव्यक्ति वेक्टर pBAD24 WT plyCA जीन युक्त के साथ plyCB. इस थाली से कालोनियों स्क्रीनिंग के दौरान नियंत्रण के रूप में काम करेंगे.
3. 96 खैर microtiter प्लेट तैयारी और सेल के विकास की स्थिति
- एम्पीसिलीन और chloramphenicol साथ पूरक लेग के 200 μl के साथ एक साथ 96 microtiter प्लेट के प्रत्येक अच्छी तरह से भरें.
- Microtiter प्लेट योजनाबद्ध (चित्रा 2b) के बाद, ध्यान से रातोंरात अगर प्लेटों से एक निष्फल दंर्तखोदनी के साथ एक व्यक्ति कॉलोनी का चयन करें और अच्छी तरह से 96 के बारे में अच्छी तरह से नामित microtiter पीएलए में बैक्टीरिया को टीका लगानाते. यह आवश्यक है करने के लिए सुनिश्चित करें कॉलोनी प्रति एक ही अच्छी तरह से inoculated है.
- 300 रातोंरात rpm पर 37 में सुरक्षित anchored साथ 96 microtiter प्लेट हिला ° सी.
4. प्रतिकृति चढ़ाना, प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रेरण और lysate तैयारी
- "एक संशोधन के साथ इष्टतम हीटिंग की स्थिति निर्धारण" शीर्षक अनुभाग 1.5-1.11 चरणों का पालन करें. 4 में मूल थाली स्टोर प्रतिकृति चढ़ाना कदम डिग्री सेल्सियस के बाद निष्कर्ष निकाला है.
- बाद 1.11 कदम, घुलनशील कच्चे तेल सकारात्मक नियंत्रण कुओं A1-D1 के लिए छोड़कर एक साथ 96 thermocycler प्लेट की इसी कुओं lysate हस्तांतरण के 110 μl. सकारात्मक नियंत्रण lysates (यानी lysates है कि गर्म नहीं कर रहे हैं), एक नया 96 अच्छी तरह से microtiter प्लेट कि अंतिम परख और बर्फ पर प्रयोग की दुकान के लिए थाली के रूप में काम करेंगे में इसी कुओं lysates के 100 μl हस्तांतरण के संबंध के साथ.
5. घुलनशील lysate हीट ट्रीटमेंट
- गर्मी नकारात्मक नियंत्रण और उत्परिवर्ती lysates अनुकूलित गैर अनुमोदक ऊष्मायन चरण 1 में निर्धारित तापमान पर 30 मिनट के लिए thermocycler में 96 अच्छी तरह thermocycler थाली में घुलनशील वर्तमान सीमित.
- गैर अनुमोदक तापमान ऊष्मायन के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 96 अच्छी तरह thermocycler थाली सेते हैं.
- 96 अच्छी तरह thermocycler प्लेट से अंतिम 96 में अच्छी तरह से microtiter परख पहले से ही सकारात्मक नियंत्रण घुलनशील lysates युक्त थाली में उनके समान ही स्थानों के लिए घुलनशील lysates के 100 μl स्थानांतरण.
- एक multipipettor 12-चैनल के साथ, एक अच्छी तरह से गैस D471 तनाव के 100 μl जोड़ें. तुरंत microplate स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में थाली जगह है.
- 20 मिनट के लिए 600 आयुध डिपो में हर 15 सेकंड को मापने के द्वारा एंजाइम कैनेटीक्स मॉनिटर.
- प्रगति की थर्मल व्यवहार के साथ एक PlyC variant एक निर्माण कि 50 प्रतिशत से कम से कम 900 सेकंड में मूल ऑप्टिकल घनत्व में कमी कर सकते हैं के रूप में परिभाषित किया गया हैतापमान गैर अनुमोदक. इसके अतिरिक्त, सकारात्मक नियंत्रण (यानी गैर गर्म, WT PlyC) WT उत्प्रेरक गतिविधि प्रदर्शित करने की जरूरत है (टी 1/2 ≤ 100 सेकंड) और नकारात्मक नियंत्रण (यानी गरम, WT PlyC) गतिविधि से रहित होना चाहिए.
- एक बार के साथ एक PlyC variant प्रगति की थर्मल व्यवहार की पहचान की है, मूल 4 डिग्री सेल्सियस और अच्छी तरह से ताजा लेग एम्पीसिलीन और chloramphenicol साथ पूरक मीडिया में ब्याज की उत्परिवर्ती विशिष्ट व्यक्ति से टीका लगाना बैक्टीरिया में संग्रहीत प्लेट को पुनः प्राप्त. Inoculum 37 पर रातोंरात विकसित ° सी.
- निकालें और प्लास्मिड डीएनए शुद्ध संस्कृति से और फिर क्रम में nucleotide म्यूटेशनों कि PlyCA के लिए बढ़ाया थर्मल व्यवहार अनुमान है की पहचान अनुक्रमण के लिए सबमिट करें. इसके अतिरिक्त, 10% ग्लिसरॉल और -80 पर दुकान ° आगे उपयोग के लिए सी के साथ रातोंरात संस्कृति से एक छोटे अशेष भाजक के पूरक हैं.
Representative Results
यादृच्छिक mutagenesis के पहले दौर के समापन पर, 6,000 से अधिक PlyC म्यूटेंट की जांच किया गया और संभावित वृद्धि हुई थर्मल व्यवहार के साथ 35 म्यूटेंट के एक कुल की पहचान थे, चयनित और अनुक्रम. जीनोमिक विश्लेषण, मैं तालिका में संक्षेप में, यह पता चलता है कि 35 उम्मीदवारों, 7 अनुवाद, झूठी सकारात्मक परख द्वारा की पहचान करने के लिए इसी के स्तर पर WT PlyCA दृश्यों निहित constructs के. शेष 28 प्रत्याशियों में उत्परिवर्तन श्रृंखला 1 से प्रति plyCA जीन है, जो 2-3 nucleotide उत्परिवर्तन हम लक्षित कर रहे थे रेंज में था 2.75 nucleotides के एक औसत उत्परिवर्तन की दर के साथ 6 nucleotide परिवर्तन करने के लिए किया गया था. Translational स्तर पर इस विशेष nucleotide उत्परिवर्तन रेंज और आवृत्ति पॉलीपेप्टाइड PlyCA प्रति 1.9 एमिनो एसिड म्यूटेशनों के एक औसत उत्परिवर्तन की दर के साथ 1 से 5 एमिनो एसिड की एक एमिनो एसिड उत्परिवर्तन रेंज, झुकेंगे.
कम से कम एक एमिनो एसिड mutat के साथ 28 प्रत्याशियों मेंआयन, चार इन उत्परिवर्ती constructs के बेतरतीब ढंग से आगे के लिए मान्य है कि निर्देशित विकास पद्धति की व्यापक स्क्रीनिंग प्रक्रिया वास्तव में ठीक से कार्य कर रहा था लक्षण वर्णन के लिए चुने गए हैं. उत्परिवर्ती PlyC एंजाइमों> 95% एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण पहले 6-7 के रूप में वर्णित के आधार पर एकरूपता शुद्ध थे. WT PlyC और चार PlyC म्यूटेंट के प्रत्येक के एंजाइम कैनेटीक्स बराबर दाढ़ सांद्रता में विभिन्न ऊंचा तापमान पर शुद्ध एंजाइमों incubating के बाद विशेषता थे. गतिविधि 600 एनएम हर 15 सेकंड में 20 मिनट के लिए ऑप्टिकल घनत्व को मापने के द्वारा D471 गैस के अलावा के बाद नजर रखी थी. गतिविधि अवशिष्ट गर्मी ऊष्मायन के बाद एंजाइम की अधिकतम गति के रूप में परिभाषित किया गया था. बेतरतीब ढंग से आगे लक्षण वर्णन के लिए चार चयनित उम्मीदवारों, उत्परिवर्ती 29C3 सबसे बढ़ाया थर्मल व्यवहार दिखाया. WT PlyC और 29C3 थर्मल व्यवहार अलग तापमान पर जांच की गई, जबकि incubating और पीबीएस पीएच 7.2 में गतिविधि के लिए परख करने की क्रिया80 एनएम और 40 एनएम सांद्रता, क्रमशः. 45-50 डिग्री सेल्सियस ऊष्मायन प्रयोगों (3 चित्रा) एक thermocycler जहां नमूने एक पतली दीवारों 96 120 μl की कुल मात्रा में अच्छी तरह से thermocycler थाली में incubated रहे थे में प्रदर्शन किया गया. 35 डिग्री सेल्सियस, 40 डिग्री सेल्सियस और 45 डिग्री सेल्सियस ऊष्मायन प्रयोगों (4 और 5 चित्रा) जहां नमूने एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में 1.3 मिलीलीटर की कुल मात्रा में incubated रहे थे एक गर्मी ब्लॉक में प्रदर्शन किया गया. सभी प्रयोगों triplicates में प्रदर्शन किया गया.
कमरे के तापमान (25 डिग्री सेल्सियस) के रूप में चित्रा 3 में सलाखों के पहले सेट में दर्शाया. WT PlyC और 29C3 कोई गतिज स्थिरता में महत्वपूर्ण अंतर दिखाया हालांकि, 45-50 से लेकर तापमान डिग्री सेल्सियस से 30 मिनट के लिए एक के बाद अल्पकालिक ऊष्मायन 29C3 की गतिविधि प्रत्येक तापमान बिंदु पर निर्माण WT विशिष्ट गतिविधि की तुलना में काफी अधिक था. उदाहरण के लिए, WT PlyC 45.2 में एक गतिविधि में 44% नुकसान प्रदर्शितडिग्री सेल्सियस जबकि 29C3 केवल उसी के तापमान पर एक गतिविधि में 2% नुकसान दिखाया.
लंबी अवधि के ऊष्मायन दोनों WT PlyC और 29C3 के अवशिष्ट गतिविधि की तुलना अध्ययन के अतिरिक्त 35 में प्रदर्शन किया गया डिग्री सेल्सियस और 40 डिग्री सेल्सियस के 24 और 48 घंटा समय बिंदुओं पर अवशिष्ट गतिविधि के माप शामिल हैं. 35 डिग्री सेल्सियस, 29C3 41% प्रदर्शित और 24 पर WT PlyC और 48 घंटा ऊष्मायन समय अंक, क्रमशः (4a चित्रा) से 176% अधिक गतिविधि. 40 डिग्री सेल्सियस, 29C3 28% प्रदर्शित और 24 पर WT PlyC और 48 घंटा ऊष्मायन समय अंक, क्रमशः (4b चित्रा) से 107% अधिक गतिविधि.
WT PlyC और 29C3 के अवशिष्ट गतिविधि भी 45 से कम हर 20 मिनट 3 घंटा की एक कुल के लिए निगरानी की गई डिग्री सेल्सियस WT PlyC केवल इस तापमान पर 3 घंटा ऊष्मायन के बाद 21% की गतिविधि को बनाए रखने जबकि 29C3 के लिए 46% की गतिविधि को बनाए रखने में सक्षम था करने में सक्षम था. आधा जीवन WT PlyC और 29C3 (टी 1/2) 67 और 147 मिनट थे, क्रमशः सुझाव देते हैं, आईएनजी कि 29C3 2.2 45 डिग्री सेल्सियस (5 चित्रा) में गतिज स्थिरता में गुना वृद्धि हुई है.
| कुल दौर 1 उम्मीदवारों | 35 |
| WT PlyCA अनुक्रम के साथ उम्मीदवार | 7 |
| ≥ 1 एमिनो एसिड उत्परिवर्तन के साथ उम्मीदवार | 28 |
| औसत Nucleotide उत्परिवर्तन दर (/ NT plyCA) | 2.75 |
| Nucleotide उत्परिवर्तन रेंज (NT) | 1-6 |
| - औसत एमिनो एसिड उत्परिवर्तन दर (ए.ए. / PlyCA) | 1.9 |
| एमिनो एसिड उत्परिवर्तन रेंज (एए) | 1-5 |
टेबल उम्मीदवार 1 पूल जीनोमिक विश्लेषण.
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चित्रा 1. निर्देशित विकास परख पद्धति निर्देशित विकास में, एक प्रमुख एंजाइम, जो WT PlyC पहले दौर के लिए होगा के साथ शुरू होता है. त्रुटि - प्रवण एक डीएनए पोलीमरेज़ द्वारा PlyC plyCA जीन यादृच्छिक निष्पक्ष nucleotide म्यूटेशनों युक्त म्यूटेंट के एक पुस्तकालय तो निर्माण किया है, अभिव्यक्ति pBAD24 वेक्टर में क्लोन और ई. में तब्दील कोलाई DH5α पहले से ही तनाव युक्त pBAD33:. plyCB व्यक्तिगत transformants उनके एक साथ 96 microtiter प्लेट की अपनी ही विशिष्ट में inoculated हैं. एक व्यापक स्क्रीनिंग प्रक्रिया के माध्यम से, व्यक्तिगत PlyC म्यूटेंट है कि एक गैर अनुमेय तापमान पर ऊष्मायन के बाद catalytically सक्रिय हैं बढ़ाया गतिज स्थिरता के साथ म्यूटेंट के रूप में वर्गीकृत किया जाता है. सबसे प्रगति की थर्मल व्यवहार फलस्वरूप यादृच्छिक mutagenesis के अगले दौर के लिए नेतृत्व एंजाइम हो जाता है प्रदर्शित Theconstruct. कुल मिलाकर, वहाँ Rando के तीन पूर्ण राउंड हैंमीटर mutagenesis डीएनए विकसित थर्मल व्यवहार के साथ एक जीवाणुलयनी अणु में जिसके परिणामस्वरूप फेरबदल द्वारा पीछा किया. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 2. 96 अच्छी तरह से निर्देशित विकास परख के लिए microtiter प्लेट टेम्पलेट्स microtiter प्लेट इष्टतम हीटिंग शर्तों के निर्धारण के दौरान योजनाबद्ध (2a चित्रा) microtiter प्लेट की प्रत्येक पंक्ति में एक एकल माता पिता WT PlyC क्लोन inoculating के होते हैं. microtiter प्लेट योजनाबद्ध उत्परिवर्ती स्क्रीनिंग (चित्रा 2b) के दौरान 1 कॉलम में एक अद्वितीय पैतृक WT PlyC क्लोन के साथ प्रत्येक अच्छी तरह के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक अलग PlyC उत्परिवर्ती क्लोन के साथ 2-12 स्तंभों में एक अच्छी तरह से inoculating inoculating के होते हैं. वेल्स A1-D1 सकारात्मक माता पिता का नियंत्रण है, जो सह के लिए नामित कर रहे हैंWT PlyC की nsist गैर अनुमेय तापमान ऊष्मायन उजागर नहीं constructs. E1-H1 वेल्स नकारात्मक माता पिता का नियंत्रण जो WT PlyC constructs कि गैर अनुमेय तापमान ऊष्मायन को उजागर कर रहे हैं से मिलकर के लिए नामित कर रहे हैं.
चित्रा 3. अवशिष्ट गतिविधि गतिज WT PlyC और 29C3 तुलना विश्लेषण. एंजाइमों एकरूपता शुद्ध थे और एक thermocycler में 30 मिनट के लिए या तो कमरे के तापमान पर या एक तापमान 45-50 डिग्री सेल्सियस से लेकर ढाल पर बराबर दाढ़ सांद्रता में incubated Enzymatic गतिविधि अधिकतम विशिष्ट तापमान ऊष्मायन के बाद प्रदर्शित वेग के साथ संबद्ध है. 25 डिग्री सेल्सियस और 47.7 के अपवाद के साथ डिग्री सेल्सियस, प्रत्येक एक <0.05 पी मूल्य सहसंबद्ध तापमान में WT और 29C3 के बीच गतिविधि में भिन्नता. सभी डेटा ± मतलब तीन स्वतंत्र प्रयोगों के SEM के रूप में रिपोर्ट कर रहे हैं. 
चित्रा 4. अवशिष्ट गतिविधि गतिज 29C3 से 35 WT PlyC तुलना विश्लेषण डिग्री सेल्सियस और 40 डिग्री सेल्सियस शुद्ध WT PlyC और 29C3 के समान दाढ़ सांद्रता एक गर्मी ब्लॉक में 35 डिग्री सेल्सियस (4a चित्रा) या 40 डिग्री सेल्सियस (4b चित्रा) में incubated रहे थे. अवशिष्ट एंजाइम गतिविधि 24 और 48 घंटा समय बिंदुओं पर मापा गया था. प्रत्येक का निर्माण द्वारा प्रदर्शित गतिविधि अधिकतम समय बिंदु शून्य पर प्रदर्शित वेग सामान्यीकृत था. प्रत्येक तापमान और समय बिंदु पर WT और 29C3 के बीच गतिविधि में परिवर्तन के लिए एक पी मूल्य <0.05 सहसंबद्ध. सभी डेटा ± मतलब तीन स्वतंत्र प्रयोगों के SEM के रूप में रिपोर्ट कर रहे हैं.
चित्रा 5. अवशिष्ट गतिविधि गतिज तुलना विश्लेषणWT 29C3 45 PlyC ° सी. शुद्ध WT PlyC और 29C3 के बराबर दाढ़ सांद्रता एक गर्मी ब्लॉक में 45 डिग्री सेल्सियस और अवशिष्ट एंजाइम गतिविधि को 3 घंटे के लिए हर 20 मिनट में मापा गया था incubated रहे थे. प्रत्येक का निर्माण द्वारा प्रदर्शित गतिविधि अधिकतम समय बिंदु शून्य पर प्रदर्शित वेग सामान्यीकृत था. 20 मिनट में डेटा बिंदुओं की अपवाद के साथ, हर समय बिंदु पर एक पी मूल्य <0.05 WT और 29C3 के बीच गतिविधि में भिन्नता को सहसंबद्ध. सभी डेटा ± मतलब तीन स्वतंत्र प्रयोगों के SEM के रूप में रिपोर्ट कर रहे हैं.
Discussion
यह प्रोटोकॉल, चित्रा 1 में उल्लिखित है, एक साथ 96 microtiter प्लेट पद्धति है कि एक निर्देशित विकास का उपयोग करने के लिए किसी जीवाणुलयनी एंजाइम की thermostability में वृद्धि करने की अनुमति देता है प्रस्तुत करता है. त्रुटि - प्रवण एक डीएनए पोलीमरेज़ का उपयोग के माध्यम से, एक यादृच्छिक म्यूटेशनों कि अनुवाद ब्याज की जीवाणुलयनी अणु है, जो आम तौर पर आणविक electrostatic बढ़ाने की मिलकर reorganizations के कारण समग्र गतिज स्थिरता को बढ़ाने के लिए लागू कर सकते हैं, Disulphide पुल और hydrophobic बातचीत है कि सुधार उत्पन्न करने के लिए आणविक पैकिंग, सतह के प्रभारी नेटवर्क या एक उच्च oligomerization 17-18 राज्य के सुदृढीकरण की बढ़ी संशोधनों. Nucleotide म्यूटेशनों की शुरूआत के बाद, एक व्यापक स्क्रीनिंग प्रक्रिया तो लिए म्यूटेशनों कि thermally फायदेमंद होते हैं की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. प्रतिनिधि यहाँ प्रस्तुत परिणाम यादृच्छिक mutagenesis के एक दौर पर आधारित थे. वास्तव में, यह सुझाव दिया गया है कियादृच्छिक mutagenesis के कम से कम तीन लगातार राउंड, नेतृत्व एंजाइम, डीएनए की उथल के रूप में सबसे मजबूत उत्परिवर्ती प्रत्येक निर्देशित विकास थर्मल व्यवहार के अध्ययन के इन प्रकार 2 के लिए उपयुक्त है.
यह समझना महत्वपूर्ण है कि जबकि इस प्रोटोकॉल म्यूटेशनों कि गतिज स्थिरता बढ़ाने को दिखाता है, इन वेरिएंट जरूरी नहीं thermostability करते वृद्धि हुई है. एक अणु थर्मास्टाइबल माना जाता है जब यह करने के लिए एक उच्च तापमान पर इसकी संरचना को बनाए रखने की क्षमता है. हालांकि, प्रस्तुत परख में, उत्परिवर्ती lysates के अवशिष्ट गतिविधि कि वे शुरू में गर्मी उपचार चरण के दौरान रहे थे पर incubated और इस प्रकार एक परिवर्तन है कि बजाय बढ़ाया thermostability 19 refolding को बढ़ावा देने के लिए चयन किया जा सकता है एक ही तापमान में नहीं हैं assayed. जबकि हम थर्मल स्थिरता का एक संकेत के रूप में extrapolating थर्मल व्यवहार कर रहे हैं, सच थर्मल स्थिरता Biophys empirically मापा चाहिएपरिपत्र dichroism (सीडी), अंतर स्कैनिंग calorimetry (डीएससी) और अंतर स्कैनिंग fluorimetry (DSF) के रूप में राजनैतिक तरीके. सीडी और DSF प्रयोगों से प्रारंभिक आंकड़े बताते हैं कि प्रस्तुत पद्धति से कई की पहचान उम्मीदवारों वास्तव में प्रगति की thermostability (नहीं दिखाया डेटा) प्रदर्शित करते हैं.
हालांकि यहाँ प्रस्तुत पद्धति लिए PlyC के बढ़ थर्मल व्यवहार को लागू करने के लिए विशिष्ट है, यह एक ही पद्धति अतिरिक्त buffers, उत्परिवर्तन दर, हीटिंग की स्थिति और अभिव्यक्ति सिस्टम के रूप में चर के लिए कुछ मामूली परिवर्तन के साथ अन्य जीवाणुलयनी एंजाइमों को थर्मल गतिविधि बढ़ाने के लिए नियोजित किया जा सकता है. एक महत्वपूर्ण चर इस परख के साथ जुड़े त्रुटि प्रवण डीएनए पोलीमरेज़ nucleotide उत्परिवर्तन की दर से संबंधित है. हम हमारे निर्देशित विकास परख में प्रयोगात्मक सबूत के लिए सुझाव है इस विशेष एंजाइम के साथ पूर्वाग्रह के कम से कम राशि प्रदर्शित करता कारण त्रुटि प्रवण Mutazyme डीएनए पोलीमरेज़ द्वितीय का उपयोग करने के लिए चुनाnucleotides जो संबंध अनियमित ब्याज की जीन में शामिल कर रहे हैं जब अन्य hydroxylamine, mutator ई. के उपयोग के रूप में यादृच्छिक mutagenesis तकनीक की तुलना में कोलाई उपभेदों और अन्य त्रुटि प्रवण डीएनए 20 polyermases. सामान्य में, कम उत्परिवर्तन दरों दो कारणों के लिए अधिक वांछनीय हो जाते हैं. पहले, इंजीनियरिंग thermostability प्रोटीन के लिए आम तौर पर अपेक्षाकृत कुछ एमिनो एसिड substitutions के होते हैं. उच्च उत्परिवर्तन दरों विशेष अणु कि निर्णायक संरचनात्मक misfolding और कार्यात्मक विसंगतियों में परिणाम कर सकते हैं नाटकीय संरचनात्मक परिवर्तन हो सकता है. उदाहरण के लिए, ग्लाइसिन और प्रोलाइन अवशेषों के समावेश अल्फा पेचदार माध्यमिक संरचनाओं 21 को बाधित कर सकते हैं. दूसरा, उच्च nucleotide उत्परिवर्तन दरों समय से पहले रोकने के codons को शामिल करने की संभावना बढ़ाने के लिए, छोटा कर दिया अणुओं है कि biologically निष्क्रिय कर रहे हैं जिसके परिणामस्वरूप. सामान्य में, कम उत्परिवर्तन दरों पसंद कर रहे हैं क्योंकि accumul में कम त्रुटि दर परिणामअनुकूली म्यूटेशनों की समझना जबकि उच्च उत्परिवर्तन दरों तटस्थ या हानिकारक म्यूटेशनों उत्पन्न करने के लिए 22.
यादृच्छिक mutagenesis के प्रत्येक दौर के लिए एक और महत्वपूर्ण चर है कि एक अनुकूलन करना चाहिए ऊष्मायन स्क्रीनिंग प्रक्रिया के दौरान इस्तेमाल तापमान शामिल है. प्रयोगात्मक गैर अनुमोदक तापमान का चयन अपेक्षाकृत चुनौतीपूर्ण है. हम शुरू में एक ऊष्मायन तापमान है कि 10 साल का था ° C गैर अनुमोदक PlyC के तापमान की तुलना में अधिक है, लेकिन 3000 म्यूटेंट स्क्रीनिंग के बाद, हम किसी भी लाभप्रद म्यूटेशन की पहचान करने में असमर्थ थे. ध्यान में रखते हुए निर्देशित विकास के तरीके में क्रमिक रूप से लाभप्रद एमिनो एसिड substitutions कि additive प्रभाव की पहचान करने के मिलकर बनता है, यह निर्धारित किया गया था कि एक कम कठोर तापमान स्क्रीनिंग प्रक्रिया के दौरान इस्तेमाल किया जाना चाहिए, भले ही यह झूठी सकारात्मक पैदा करने का मौका वृद्धि हुई है. जैसे, हम एक ऊष्मायन तापमान था कि केवल गैर permiss ऊपर कुछ डिग्री का इस्तेमाल किया हैive तापमान और rescreened चयनित उम्मीदवारों को शासन करने के लिए झूठी सकारात्मक.
हम एक ऊष्मायन तापमान कि भी समशीतोष्ण नहीं था का उपयोग करने का फैसला किया है (1 ≤ ° C गैर अनुमोदक सबसे कम तापमान से अधिक) और इसके विपरीत भी कठोर नहीं (5 ≥ ° C गैर अनुमोदक सबसे कम तापमान की तुलना में अधिक). आदर्श तापमान हम इस विशेष परख में उपयोग करने का फैसला किया था एक उदारवादी 2 ° C प्रयोगात्मक निर्धारित गैर अनुमोदक तापमान की तुलना में अधिक है. एक तापमान है कि बहुत हल्के है चुनना एक बहुत उच्च झूठी ~ 20% हम मनाया (मैं टेबल) से सकारात्मक पहचान दर में परिणाम जब एक उदारवादी ऊष्मायन तापमान का उपयोग किया जाएगा. इसके अलावा, एक ऊष्मायन तापमान है कि बहुत कठोर है अंततः काफी बढ़ाया थर्मल व्यवहार के साथ म्यूटेंट की पहचान करने में असमर्थता में हो सकता है. उदाहरण के लिए, 5 ≥ के एक ऊष्मायन तापमान डिग्री सेल्सियस में असमर्थता परिणामस्वरूप होता है करने के लिए की पहचान29C3 के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अन्य स्क्रीनिंग के पहले दौर के दौरान चयनित उम्मीदवारों के बहुमत उत्परिवर्ती का वादा.
जोड़ में, हम इंजीनियरिंग जीवाणुलयनी एंजाइमों बढ़ाया गतिज स्थिरता प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. इसके अलावा, हीटिंग कदम के बिना यह एक ही परख,, म्यूटेशनों कि उत्प्रेरक गतिविधि को बढ़ाने के लिए स्क्रीन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. दोनों उत्प्रेरक गतिविधि और thermostability बढ़ाने में विकास की एक महत्वपूर्ण बाधा किसी भी चिकित्सकीय एंजाइम का सामना करना पड़ रहा है. जबकि इस प्रोटोकॉल का विवरण विशेष रूप से endolysin PlyC के लिए कर रहे हैं, केवल कुछ परिवर्तन के साथ कार्यप्रणाली किसी जीवाणुलयनी एंजाइम के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. हम केवल mutagenesis के पहले दौर है कि परख की कि कार्यक्षमता पुष्टि की है, कार्यान्वयन और म्यूटेशनों कि महत्वपूर्ण परिमाण के आणविक thermostability में एक वृद्धि उत्पन्न की पहचान में जिसके परिणामस्वरूप से प्रारंभिक परिणाम प्रस्तुत किए.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
लेखकों के लिए तकनीकी सहायता के लिए Emilija Renke और जेनेट यू का शुक्रिया अदा करना चाहता हूँ. DCN संयुक्त राज्य अमेरिका के रक्षा विभाग (DR080205, DM102823, OR09055, और OR090059) से अनुदान द्वारा समर्थित है. RDH मैरीलैंड कृषि प्रयोग स्टेशन और सेल और आण्विक जीवविज्ञान में एक NIH प्रशिक्षण अनुदान से एक अनुदान द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B-PER II Bacterial Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 78260 | |
| GeneMorph II Random Mutagenesis Kit | Agilent Technologies | 200500 | |
| Clear 96 Well, Flat-bottomed Microtiter Plate With Lid | BD Vacutainer Labware Medical | 353072 | |
| 96 Well Nonskirted PCR Plates | Fisher Scientific | 14-230-232 | |
| Swing-bucket Rotor | Eppendorf | A-2-DWP | |
| Ampicillin Sodium Salt | Fisher Scientific | BP1760 | |
| Chloramphenicol | Fisher Scientific | BP904 | |
| Arabinose | Fisher Scientific | BP2504 | |
| pBAD24 Expression Vector | ATCC | 87399 | |
| pBAD33 Expression Vector | ATCC | 87402 |
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