Summary
En roman rettet evolusjon metode spesifikk til feltet av thermostability engineering ble utviklet og følgelig validert for bacteriolytic enzymer. Etter bare en runde av tilfeldig mutagenese, en utviklet bacteriolytic enzym, PlyC 29C3, vises større enn to ganger restaktivitet når sammenlignet med villtype-protein etter forhøyet temperatur inkubasjon.
Abstract
Rettet evolusjon er definert som en metode for å utnytte naturlig seleksjon for å konstruere proteiner å erverve bestemte egenskaper som ikke er forbundet med proteinet i naturen. Litteratur har gitt mange eksempler om gjennomføringen av rettet evolusjon for å kunne endre molekylær spesifisitet og katalyse en. Den primære fordelen med å benytte rettet evolusjon i stedet for mer rasjonell tilnærminger for molekylær teknikk knyttet til volum og mangfold av varianter som kan bli vist to. En mulig anvendelse av rettet evolusjon innebærer bedre strukturell stabilitet av bacteriolytic enzymene, som endolysins. Bakteriofag kode og uttrykke endolysins å hydrolysere en kritisk kovalent binding i peptidoglykan (dvs. celleveggen) av bakterier, noe som resulterer i host cellelyse og frigjøring av avkom virioner. Spesielt, disse enzymene har evnen til extrinsically indusere lysis å susceptvertible bakterier i fravær av phage og dessuten har blitt validert både in vitro og in vivo for deres terapeutiske potensial 3-5. Gjenstand for vår rettet evolusjon studie involverer PlyC endolysin, som er sammensatt av PlyCA og PlyCB subenheter 6. Når renset og lagt extrinsically, lyserer PlyC holoenzyme gruppe A streptokokker (GAS) samt andre streptokokker grupper i løpet av sekunder og videre har blitt validert in vivo mot GAS 7. Betydelig, overvåking restoljen enzymkinetikk etter forhøyet temperatur inkubering gir distinkte bevis for at PlyC mister lytisk aktivitet brått ved 45 ° C, noe som tyder på en kort terapeutisk holdbarhet, noe som kan begrense ytterligere utvikling av dette enzymet. Videre studier avdekke mangel på termisk stabilitet er kun observert for PlyCA subenheten, mens PlyCB subenheten er stabil opp til ~ 90 ° C (upublisert observasjon). I tillegg til PlyC, Det er several eksempler i litteraturen som beskriver termolabile natur endolysins. For eksempel, den Staphylococcus aureus endolysin LysK og Streptococcus pneumoniae endolysins Cpl-1 og Pal miste aktiviteten spontant ved 42 ° C, 43,5 ° C og 50,2 ° C, henholdsvis 8-10. Ifølge Arrhenius ligningen, som vedrører hastigheten til en kjemisk reaksjon på temperaturen til stede i enkelte system, vil en økning i thermostability korrelerer med en økning i sokkel levealder 11. Mot denne enden, har rettet evolusjon blitt vist å være et nyttig hjelpemiddel for å endre den termiske aktivitet av forskjellige molekyler i naturen, men har aldri dette bestemt teknologi blitt utnyttes for studiet av bacteriolytic enzymer. Likeledes vellykkede beretninger framdrift strukturell stabilitet av denne spesielle klasse av antimikrobielle midler helt er ikke-eksisterende. I denne videoen, ansetter vi en ny metode som bruker en feil pren DNA polymerase etterfulgt av en optimalisert screening ved bruk av en 96 brønn mikrotiterplate format å identifisere mutasjoner til PlyCA subenhet av PlyC streptokokk endolysin som korrelerer til en økning i enzym kinetiske stabiliteten (figur 1). Resultater etter bare én runde med tilfeldig mutagenese foreslår metodikken genererer PlyC varianter som beholder mer enn det dobbelte av gjenværende aktivitet sammenlignet med villtype (WT) PlyC etter forhøyet temperatur behandling.
Protocol
1. Bestemme optimal Varme betingelser
Først må man eksperimentelt bestemme optimal inkubasjonstemperatur og tid som skal brukes for oppvarming trinnet i analysen. For vår PlyC modell, er det viktig å merke seg at E. coli co-transformert med plyCA og plyCB gener på separate ekspresjonsvektorer plasmider er vist å danne en fullt funksjonell PlyC holoenzyme 6. Den 96 brønn mikrotiterplate forberedelse samt celle vekstbetingelser og påfølgende replika plating teknikk var tilpasset fra eksemplene i litteraturen 12-16. En inkubasjonstid på 30 minutter vil være egnet for denne analysen som resultater fra tidligere varmeinaktiveringen eksperimenter diktere en rask tap i aktivitet under kortsiktig inkubasjon i miljøer overskrider fysiologiske temperatur (upublisert observasjon). Den optimale inkubasjonstemperatur for PlyC ble belyst ved følgende trinn:
- Transform uttrykket konstruere pBAD24: plyCA (Amp r) i vedkommende E. coli stamme DH5α pBAD33: plyCB (Cm r).
- Plate transformantene på Luria-Bertani (LB) agarplate supplert med ampicillin (100 ug / ml) og kloramfenikol (35 ug / ml). Inkuber platene over natten ved 37 ° C.
- Med en steril tannpirker, inokuler en individuell koloni i hver rekke av brønner (figur 2a) i en steril, klar, flatbunnet 96 brønner, med lokk mikrotiterplate som inneholder 200 pl LB supplert med ampicillin og kloramfenikol.
- Sikkert plassere 96 brønn mikrotiterplate på en 37 ° C risteinkubator og vokse bakteriene natten ved 300 rpm.
- Hente 96 brønn mikrotiterplate fra 37 ° C risting inkubator og replika plate til en ny 96 brønn mikrotiterplate slik:
- Legg 180 pl LB supplert med ampicillin og kloramfenikoltil hver brønn på replika-plate.
- Overfør 20 pl av bakterier fra den opprinnelige platen til tilsvarende brønner i replika-plate. Dette bør resultere i en innledende OD 600 av ~ 0,5.
- Sikkert plassere kopi plate på 37 ° C risteinkubator og inkuber platen i 1 time ved 300 rpm, deretter legge til inductant. I tilfelle av de pBAD ekspresjonssystemer er inductant 0,25% arabinose. Andre uttrykk systemer kan kreve ulike inductants. Sett platen tilbake på 37 ° C risteinkubator og riste ved 300 opm i en ytterligere 4 timers for å tillate protein uttrykk. Uttrykk nivåer vanligvis varierer mellom 10-20 mikrogram PlyC.
- Når protein ekspresjon har konkludert, hente replika plate og pellet bakteriene ved å plassere 96 brønn mikrotiterplate i en nedkjølt sentrifuge som inneholder en svingende-bøtte rotor som passer 96 godt mikrotiterplater. Sentrifuger ved 3000 rpm i 10 min ved romtemperatur.
- Fjern media supernatanten med sakte snu mikrotiterplate og forsiktig dekantering media.
- Lysere cellene ved å tilsette 50 ul B-PER II bakterieprotein Ekstraksjonsreagens til hver brønn. Inkuber platen ved romtemperatur i 20 min.
- Øke volumet i hver brønn til 120 pl ved tilsetning 70 ul fosfatbufret saltvann (PBS) pH 7,2.
- Pellet det uoppløselige cellulært avfall ved å spinne plate på 3000 opm i 10 min ved 4 ° C i nedkjølt sentrifuge.
- Overfør 110 ul av det oppløselige råolje lysatet til de tilsvarende brønner i en 96 brønn Termocycler plate.
- Bruke 30 min som den forhåndsbestemte inkubasjonstid, utsetter de oppløselige lysates tiden bosatt i 96 godt Termocycler plate til et bredt gradient temperaturområde som spenner 15-20 ° C. Legg merke til, er målet å finne ut ved hvilken temperatur et bestemt enzym taper> 95% katalytisk aktivitet.
- Etter inkubering, inkuber 96 brønnsTermocycler plate ved 4 ° C i 5 min og overfør 100 pl av de oppløselige lysater fra 96 brønn Termocycler plate til deres tilsvarende brønnlokasjonen i den endelige 96 brønn mikrotiterplate.
- Med en 12-kanals multipipettor, tilsett 100 ul GAS stamme D471 til hver brønn. Merk at D471 celler opprinnelig lyofilisert fra overnatter kulturer og resuspendert med PBS pH 7,2 for å få en OD 600 av ~ 2,0.
- Plasser øyeblikkelig 96 brønns plate i mikroplate spektrofotometer og overvåke enzymkinetikk ved å måle OD 600 hver 15 sek i 20 min. Den laveste temperaturen inkubasjon som tilsvarte brønner som manglet en endring i optisk tetthet (ΔOD ≤ 0,1) er definert som ikke-permissive temperaturen.
Etter et stort temperaturområde skjermbildet er utført for å identifisere ikke-permissive temperaturen, kan de ovennevnte trinn gjentas over et snevrere temperaturområde (5 ° -10 ° C) for å belyseden nøyaktige ikke-permissive temperatur for enzymet av interesse. Notat, kan den ikke-permissive temperaturen identifisert i denne analysen være annerledes enn smeltetemperaturen belyst ved andre midler på grunn av forskjeller i volum, konsentrasjon, etc.
2. Generere Mutant Library
Etableringen av mutant biblioteket for å bli vist innebærer tilfeldig innlemme mutasjoner av en feil utsatt DNA polymerase med minimal nukleotid skjevhet i plyCA genet med GeneMorph II Random Mutagenese Kit som følger:
- Utforme nukleotid primere med liknende smeltetemperaturer (T m) mellom 55-72 ° C med de restriksjonsseter av valg ved 5 'og 3' endene av plyCA genet.
- Siden ønsket mutasjonsraten er 2-3 nukleotider pr plyCA (1,4 kb), kan du bruke PCR reaksjon komponent konsentrasjoner samt Termocycler betingelser som anbefales av produsenten for lav mutasjon frequencies (0 til 4,5 per kb).
- Klone de mutagenisert plyCA gener inn ekspresjonsvektoren pBAD24.
- Transformere konstruerer i en DH5α pBAD33: plyCB bakgrunn og plate transformanter på LB agarplater supplert med ampicillin og kloramfenikol.
- I tillegg transformere og plate DH5α pBAD33: plyCB med ekspresjonsvektoren pBAD24 inneholder WT plyCA genet. Kolonier fra denne platen vil fungere som kontrollene under screening.
3. 96 Vel Microtiter Plate Forberedelse og cellevekst betingelser
- Fyll hver brønn av en 96 brønn mikrotiterplate med 200 pl LB supplert med ampicillin og kloramfenikol.
- Etter mikrotiterplate skjematisk (Figur 2b), nøye velge en individuell koloni fra overnatter agarplater med en sterilisert tannpirker og inokuler bakteriene i den utpekte brønn 96 brønns mikrotiter PLAte. Det er viktig å sikre at bare én koloni per brønn er vaksinert.
- Rist godt forankret 96 brønn mikrotiterplate ved 300 rpm over natten ved 37 ° C.
4. Replica Plating, Protein Expression Induksjon og lysate Forberedelse
- Følg trinn 01.05 til 01.11 fra punktet "finne optimal oppvarming forhold" med en modifikasjon. Oppbevar den originale platen ved 4 ° C etter at kopi plating trinnet har konkludert.
- Etter trinn 1,11, overføring 110 pl av det oppløselige råolje lysatet til de tilsvarende brønner i en 96 brønn plate Termocycler unntatt for den positive kontroll brønnene A1-D1. Med hensyn til den positive kontroll lysater (dvs. lysater som ikke oppvarmet), overføring 100 pl av lysater til de tilsvarende brønner i en ny 96 brønn mikrotiterplate som vil tjene som den endelige analysen plate for eksperimentet og lagre på isen.
5. Løselig lysate Heat Treatment
- Varm den negative kontrollen og mutant løselig lysater øyeblikket innesperret i 96 brønn Termocycler plate i Termocycler i 30 minutter ved den optimaliserte ikke-permissive inkubasjonstemperatur bestemt i trinn 1.
- Etter ikke-permissive temperaturen inkubasjon inkuber 96 brønn Termocycler plate ved 4 ° C i 5 min.
- Overfør 100 ul av de oppløselige lysater fra 96 brønn Termocycler plate til deres identiske brønnlokasjoner i den endelige 96 brønn mikrotiter assay plate allerede inneholdende den positive kontrollen oppløselige lysater.
- Med en 12-kanals multipipettor, tilsett 100 ul GAS stamme D471 til hver brønn. Sett platen umiddelbart i mikroplaten spektrofotometer.
- Overvåke enzymkinetikk ved å måle OD 600 hver 15 sek i 20 min.
- En PlyC variant med kommet termisk oppførsel er definert som en konstruksjon som kan redusere den opprinnelige optiske tetthet med 50 prosent i løpet av mindre enn 900 sek vedikke-permissive temperaturen. I tillegg er positive kontroller (dvs. ikke-oppvarmet, WT PlyC) må vise WT katalytisk aktivitet (t 1/2 ≤ 100 sek) og de negative kontroller (dvs. oppvarmet, WT PlyC) bør være blottet for aktivitet.
- Når en PlyC variant med kommet termisk oppførsel er identifisert, hente den opprinnelige platen lagret ved 4 ° C og inokuler bakterier fra enkelt brønn spesifikke for mutant av interesse inn fersk LB medier supplert med ampicillin og kloramfenikol. Grow inokulatet natten ved 37 ° C.
- Pakk og rense plasmid DNA fra kultur og deretter sende for sekvensering for å identifisere de nukleotid mutasjoner som antyde forbedret termisk oppførsel til PlyCA. Tillegg supplere en liten alikvot fra overnatter kulturen med 10% glycerol og oppbevar ved -80 ° C for videre bruk.
Representative Results
Ved avslutningen av den første runden av tilfeldige mutagenese, ble over 6000 PlyC mutanter vist og totalt 35 mutanter med potensielt økt termisk oppførsel ble identifisert, valgt og sekvensert. Genomisk analyse, oppsummert i tabell I, viser at av de 35 kandidater, 7 av de konstruktene inneholdt WT PlyCA sekvenser på nivået av translasjon, tilsvarende falske positiver identifisert av analysen. Av de resterende 28 kandidatene var mutasjon området 1-6 nukleotid mutasjoner med en gjennomsnittlig mutasjon rate på 2,75 nukleotider pr plyCA genet, som var i de 2-3 nukleotid mutasjon område vi var målretting. På det translasjonelle nivå ga dette spesielle nukleotid mutasjonen rekkevidde og frekvens en aminosyre mutasjon rekke 1-5 aminosyrer, med en gjennomsnittlig hastighet på 1,9 mutasjon aminosyre mutasjoner per PlyCA polypeptid.
Av 28 kandidater med minst én aminosyre mutation, ble fire av disse muterte konstruerer tilfeldig valgt ut for videre karakterisering å validere at den omfattende screening prosessen av rettet evolusjon metodikk ble faktisk fungerer. Mutant PlyC enzymer ble renset til> 95% homogenitet basert på SDS-PAGE-analyse som beskrevet tidligere 6-7. Enzymkinetikk av WT PlyC og hver av de fire PlyC mutanter ble karakterisert ved like molare konsentrasjoner etter inkubere de rensede enzymer ved forskjellige forhøyede temperaturer. Aktivitet ble overvåket etter tilsetningen av D471 GAS ved å måle den optiske tettheten ved 600 nm hvert 15. sek i 20 min. Aktivitet ble definert som gjenværende maksimum hastighet av enzymet etter varmealdring inkubasjon. Av de fire kandidatene tilfeldig valgte for videre karakterisering, viste mutant 29C3 den mest forbedret termisk oppførsel. Den termiske oppførsel WT PlyC og 29C3 ble undersøkt ved forskjellige temperaturer mens ruger og analysere for aktivitet i PBS pH 7,2 ved80 nM og 40 nM konsentrasjoner, henholdsvis. De 45-50 ° C inkubasjon eksperimenter (figur 3) ble utført i en Termocycler der prøvene ble inkubert i et tynnvegget 96 brønn Termocycler platen i et totalt volum på 120 pl. Den 35 ° C, 40 ° C og 45 ° C inkubasjon eksperimenter (figur 4 og 5) ble utført i en varme-blokk der prøvene ble inkubert i en 1,5 ml mikrosentrifugerør i et totalt volum på 1,3 ml. Alle eksperimenter ble utført i triplicates.
WT PlyC og 29C3 viste ingen signifikant forskjell i kinetisk stabilitet ved romtemperatur (25 ° C) som avbildet i det første settet med stolpene i figur 3. Imidlertid, etter en kort tids inkubasjon i 30 minutter fra temperaturer fra 45-50 ° C, var aktiviteten av 29C3 vesentlig større enn aktiviteten spesifikke til WT konstruere ved hver temperatur punkt. For eksempel viste WT PlyC en 44% tap i aktivitet på 45,2° C, mens 29C3 viste bare en 2% tap i aktivitet ved den samme temperatur.
Langsiktige inkubering studier som sammenligner restaktivitet av både WT PlyC og 29C3 i tillegg ble utført ved 35 ° C og 40 ° C som omfatter måling av gjenværende aktivitet ved 24 og 48 timers tidspunkter. Ved 35 ° C, viste 29C3 41% og 176% høyere aktivitet enn WT PlyC ved 24 og 48 timers inkubasjon tidspunkter, henholdsvis (figur 4a). Ved 40 ° C, viste 29C3 28% og 107% høyere aktivitet enn WT PlyC ved 24 og 48 timers inkubasjon tidspunkter, henholdsvis (figur 4b).
Den gjenværende aktivitet av WT PlyC og 29C3 ble også overvåket hvert 20 min for totalt 3 timer ved 45 ° C. WT PlyC var bare i stand til å beholde 21% aktivitet etter en 3 timers inkubasjon ved denne temperatur mens 29C3 var i stand til å beholde 46% aktivitet. Halveringstiden (t 1/2) for WT PlyC og 29C3 var 67 og 147 minutter, henholdsvis, foreslår ing som 29C3 har en 2,2 ganger økning i kinetisk stabilitet ved 45 ° C (figur 5).
| Totalt Runde 1 Kandidater | 35 |
| Kandidater med WT PlyCA Sequence | 7 |
| Kandidater med ≥ 1 Amino Acid Mutasjon | 28 |
| - Gjennomsnittlig nukleotid Mutation Rate (nt / plyCA) | 2,75 |
| - Nukleotid Mutasjon Range (nt) | 1-6 |
| - Gjennomsnittlig Amino Acid mutasjonsraten (AA / PlyCA) | 1.9 |
| - Amino Acid Mutation Range (AA) | 1-5 |
Tabell 1. Candidate Pool genomisk analyse.
pload/4216/4216fig1highres.jpg "/>
Figur 1. Rettet evolusjon analysemetoden. I rettet evolusjon, man begynner med ledelsen enzymet, noe som ville være WT PlyC for første runde. Et bibliotek av PlyC mutanter inneholdende tilfeldige objektive nukleotid mutasjoner til plyCA genet blir deretter konstruert av en feilutsatt DNA polymerase, klonet inn i ekspresjonsvektor pBAD24 og transformert inn i E. coli-stamme DH5α allerede inneholdende pBAD33:. plyCB Individuelle transformanter blir inokulert i sine egne spesifikke brønn av en 96 brønn mikrotiterplate. Gjennom en omfattende screening prosess, blir de enkelte PlyC mutanter som er katalytisk aktiv etter inkubasjon ved en ikke-tillatte temperatur klassifisert som mutanter med forbedret kinetisk stabilitet. Theconstruct viser den mest kommet termisk oppførsel vil følgelig blir den innledende enzymet for neste runde av tilfeldig mutagenese. Samlet er det tre komplette runder med random mutagenese etterfulgt av DNA shuffling resulterer i en bacteriolytic molekyl med utviklet termisk oppførsel. Klikk her for å se større figur .
Figur 2. 96-brønners mikrotiterplate maler for rettet evolusjon analysen. Den mikrotiterplate skjematisk under bestemmelse av de optimale oppvarmingsbetingelser (Figur 2a) består av en enkelt inokulering foreldrenes WT PlyC klone i hver rad i mikrotiterplate. Den mikrotiterplate skjematisk under mutant screening (Figur 2b) består av inokulere hver brønn i kolonne 1 med en unik foreldreansvar WT PlyC klone samt inokulere hver brønn i kolonnene 2-12 med en distinkt PlyC mutant klon. Wells A1-D1 er utpekt for de positive foreldrekontroll, som consist av WT PlyC konstruksjoner ikke utsettes for ikke-tillatte temperatur inkubasjon. Wells E1-H1 er utpekt for de negative foreldrekontroll, som består av WT PlyC konstruksjoner som er utsatt for ikke-tillatte temperatur inkubasjon.
Figur 3. Restaktivitet kinetisk analyse sammenligner WT PlyC og 29C3. Enzymer ble renset til homogenitet og inkubert i 30 min i en Termocycler ved like molare konsentrasjoner på enten romtemperatur eller ved en temperatur gradient strekker seg fra 45-50 ° C. Enzymatisk aktivitet korrelerer med maksimumshastigheten vises etter spesifikk temperatur inkubasjon. Med unntak av 25 ° C og 47,7 ° C, er forskjellen i aktivitet mellom WT og 29C3 ved hver temperatur korrelert til en p-verdi <0,05. Alle data er rapportert som gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter. 
Figur 4. Restaktivitet kinetisk analyse sammenligner WT PlyC til 29C3 ved 35 ° C og 40 ° C. Like molare konsentrasjoner av renset WT PlyC og 29C3 ble inkubert i en varme-blokk ved 35 ° C (figur 4a) eller 40 ° C (figur 4b). Den gjenværende enzymaktivitet ble målt ved 24 og 48 timers tidspunkter. Aktiviteten vist av hver konstruksjon ble normalisert til den maksimale hastighet som vises på tidspunkt null. Variasjonen i aktivitet mellom WT og 29C3 ved hver temperatur og tidspunkt korrelert til en p-verdi <0,05. Alle data er rapportert som gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter.
Figur 5. Restaktivitet kinetisk analyse som sammenlignerWT PlyC til 29C3 ved 45 ° C. Like molare konsentrasjoner av renset WT PlyC og 29C3 ble inkubert i en varme-blokk ved 45 ° C og den gjenværende enzymaktivitet ble målt hvert 20 min i 3 timer. Aktiviteten vist av hver konstruksjon ble normalisert til den maksimale hastighet som vises på tidspunkt null. Med unntak av datapunktene ved 20 min, variasjonen i aktivitet mellom WT og 29C3 ved hvert tidspunkt korrelert til en p-verdi <0,05. Alle data er rapportert som gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter.
Discussion
Denne protokollen, skissert i figur 1, viser en 96 brønn mikrotiterplate metodikk som tillater en å utnytte rettet evolusjon å øke thermostability av enhver bacteriolytic enzym. Gjennom bruk av en feilutsatt DNA polymerase, en introdusere tilfeldige mutasjoner som øker den samlede kinetiske stabiliteten av det oversatte bacteriolytic molekyl av interesse, noe som er typisk skyldes molekylære omorganiseringer bestående av økende elektrostatisk, disulfidbro og hydrofobe interaksjoner som genererer forbedret molekylær pakking, forbedrede modifikasjoner av overflaten ansvaret nettverk eller forsterkning av en høyere oligomerisering tilstand 17-18. Etter innføringen av nukleotid mutasjoner, ble en omfattende screeningsprosedyre deretter brukes til å identifisere mutasjoner som er termisk gunstig. De representative resultater som presenteres her er basert på en runde med tilfeldig mutagenese. I realiteten er det blitt foreslått atminst tre suksessive runder av tilfeldig mutagenese, er hver ved hjelp av mest robuste mutanten som ledende enzymet, etterfulgt av DNA-shuffling hensiktsmessig for disse typer rettet evolusjon termisk oppførsel studier 2.
Det er viktig å forstå at mens denne protokollen identifiserer mutasjoner som utvider kinetisk stabilitet, disse variantene ikke nødvendigvis har økt thermostability. Et molekyl anses termostabilt når det har evnen til å beholde sin struktur ved en høy temperatur. Imidlertid, i analysen presentert, blir den gjenværende aktivitet av de mutante lysater ikke analysert ved den samme temperatur som de opprinnelig ble inkubert ved under varmebehandlingen trinn og dermed en kan velge for mutasjoner som fremmer refolding fremfor forbedret thermostability 19. Mens vi ekstrapolere termisk oppførsel som en indikasjon på termisk stabilitet, må sann termisk stabilitet måles empirisk ved Biophysical metoder som sirkulær dichroism (CD), Differential Scanning Calorimetry (DSC) og differensial skanning fluorimetry (DSF). Foreløpige data fra CD-og DSF eksperimenter tyder på at flere kandidater identifisert fra metodikken presentert gjør faktisk vise kommet thermostability (data ikke vist).
Selv om metodikken som presenteres her er spesifikk for gjennomføring økt termisk oppførsel til PlyC, kan dette samme metode i tillegg brukes til å forbedre termisk aktivitet til andre bacteriolytic enzymer med noen mindre endringer i variabler som buffere, mutasjon priser, oppvarming betingelser og uttrykk systemer. Et kritisk variabel assosiert med denne analysen vedrører nukleotid mutasjon rate av feilutsatt DNA polymerase. Vi valgte å bruke utsatt for feil Mutazyme II DNA polymerase i vår rettet evolusjon analysen på grunn eksperimentelle bevis som tyder på dette spesielt enzym viser minst skjevhet medhensyn til hvilke nukleotider er tilfeldig innlemmet i genet av interesse i forhold til andre tilfeldige mutagenese teknikker så som bruk av hydroksylamin, mutator E. coli stammer og andre utsatt for feil DNA polyermases 20. Generelt lavere mutasjon priser tendens til å være mer ønskelig av to grunner. Først, består prosjektering thermostability til proteiner vanligvis av relativt få aminosyresubstitusjoner. Høye mutasjon priser kan føre til dramatiske strukturelle endringer til bestemte molekyler som kan endelig resultere i strukturelle misfolding og funksjonelle avvik. For eksempel kan inkorporering av glycin og prolin rester forstyrre alfa skrueformede sekundære strukturer 21. Sekund, High nukleotid mutasjon priser øker sjansene for å innlemme tidlig stopp kodon, som resulterer i avkortede molekyler som er biologisk inaktive. Generelt er lavere mutasjon priser foretrekkes fordi lavere feilrater resultat i accumulasjon av adaptive mutasjoner mens høyere mutasjon priser generere nøytrale eller skadelig mutasjoner 22.
For hver runde av tilfeldig mutagenese, innebærer en annen kritisk variabel at man må optimalisere inkubasjonstemperatur brukt under screening prosessen. Valg av den eksperimentelle ikke-permissive temperaturen er relativt utfordrende. Vi opprinnelig brukt en inkubasjonstemperatur som var 10 ° C høyere enn den ikke-ettergivende temperatur på PlyC, men etter screening 3000 mutanter, var vi i stand til å identifisere eventuelle fordelaktige mutasjoner. Husk rettet evolusjon metoder består av sekvensielt identifisere gunstige aminosyresubstitusjoner som har additive effekter, ble det fastslått at et mindre strengt temperatur skal brukes i løpet av screening prosessen, selv om den økte sjansen for å generere falske-positive. Som sådan, vi brukte en inkubasjonstemperatur som var bare noen få grader over den ikke-permissive temperatur og rescreened utvalgte kandidater til å utelukke de falske positiver.
Vi besluttet å bruke en inkubasjonstemperatur som ikke var altfor temperert (≤ 1 ° C høyere enn laveste non-permissive temperatur) og omvendt ikke altfor harde (≥ 5 ° C høyere enn laveste non-permissive temperatur). Den ideelle temperaturen vi besluttet å bruke i denne analysen var en moderat 2 ° C høyere enn den eksperimentelt bestemte ikke-ettergivende temperatur. Velge en temperatur som er for mild, vil resultere i en mye høyere falsk positiv identifikasjon enn den ~ 20% vi observert (tabell I) ved bruk av en moderat inkubasjonstemperatur. Videre kunne bruke en inkubasjonstemperatur som er for harde til slutt resultere i manglende evne til å identifisere mutanter med betydelig forbedret termisk oppførsel. For eksempel, ved hjelp av en inkubasjonstemperatur på ≥ 5 ° C ville ha resultert i manglende evne til å identifiserelovende 29C3 mutant samt de fleste av de andre kandidatene som ble valgt i den første runden av screening.
I summering, tilbyr vi en protokoll for prosjektering bacteriolytic enzymer for å skaffe økt kinetisk stabilitet. Dessuten kan dette samme assay, uten varmetrinn, brukes til å screene for mutasjoner som øker katalytisk aktivitet. Forsterke både katalytisk aktivitet og thermostability er ein viktig utviklingsmessig hinder overfor noen terapeutisk enzymet. Mens detaljene i denne protokollen er spesifikke for endolysin PlyC kan metodikken tilpasses enhver bacteriolytic enzym med bare noen få endringer. Vi presenterte foreløpige resultater fra bare den første runden av mutagenese som validerer at funksjonaliteten av analysen, noe som resulterer i gjennomføringen og identifisering av mutasjoner som genererer en økning i molekylær thermostability av betydelig omfang.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Emilija Renke og Janet Yu for teknisk assistanse. DCN er støttet med tilskudd fra United States Department of Defense (DR080205, DM102823, OR09055, og OR090059). RDH er støttet av et stipend fra Maryland Landbruk Experiment Station og en NIH Training Grant i celle-og molekylærbiologi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B-PER II Bacterial Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 78260 | |
| GeneMorph II Random Mutagenesis Kit | Agilent Technologies | 200500 | |
| Clear 96 Well, Flat-bottomed Microtiter Plate With Lid | BD Vacutainer Labware Medical | 353072 | |
| 96 Well Nonskirted PCR Plates | Fisher Scientific | 14-230-232 | |
| Swing-bucket Rotor | Eppendorf | A-2-DWP | |
| Ampicillin Sodium Salt | Fisher Scientific | BP1760 | |
| Chloramphenicol | Fisher Scientific | BP904 | |
| Arabinose | Fisher Scientific | BP2504 | |
| pBAD24 Expression Vector | ATCC | 87399 | |
| pBAD33 Expression Vector | ATCC | 87402 |
References
- Jackel, C., Kast, P., Hilvert, D. Protein design by directed evolution. Annual review of biophysics. 37, 153-173 (2008).
- Liu, L., Li, Y., Liotta, D., Lutz, S. Directed evolution of an orthogonal nucleoside analog kinase via fluorescence-activated cell sorting. Nucleic acids research. 37, 4472-4481 (2009).
- Fischetti, V. A. Bacteriophage lysins as effective antibacterials. Curr. Opin. Microbiol. 11, 393-400 (2008).
- Fischetti, V. A., Nelson, D., Schuch, R. Reinventing phage therapy: are the parts greater than the sum. Nat. Biotechnol. 24, 1508-1511 (2006).
- Loessner, M. J. Bacteriophage endolysins--current state of research and applications. Curr. Opin. Microbiol. 8, 480-487 (2005).
- Nelson, D., Schuch, R., Chahales, P., Zhu, S., Fischetti, V. A. PlyC: A multimeric bacteriophage lysin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 10765-10770 (2006).
- Nelson, D., Loomis, L., Fischetti, V. A. Prevention and elimination of upper respiratory colonization of mice by group A streptococci using a bacteriophage lytic enzyme. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 4107-4112 (2001).
- Filatova, L. Y., Becker, S. C., Donovan, D. M., Gladilin, A. K., Klyachko, N. L. LysK, the enzyme lysing Staphylococcus aureus cells: specific kinetic features and approaches towards stabilization. Biochimie. 92, 507-513 (2010).
- Varea, J., et al. Structural and thermodynamic characterization of Pal, a phage natural chimeric lysin active against pneumococci. J. Biol. Chem. 279, 43697-43707 (2004).
- Sanz, J. M., Garcia, J. L., Laynez, J., Usobiaga, P., Menendez, M. Thermal stability and cooperative domains of CPL1 lysozyme and its NH2- and COOH-terminal modules. Dependence on choline binding. J. Biol. Chem. 268, 6125-6130 (1993).
- Anderson, G., Scott, M. Determination of product shelf life and activation energy for five drugs of abuse. Clin. Chem. 37, 398-402 (1991).
- Kim, G. J., Cheon, Y. H., Kim, H. S. Directed evolution of a novel N-carbamylase/D-hydantoinase fusion enzyme for functional expression with enhanced stability. Biotechnol. Bioeng. 68, 211-217 (2000).
- Koutsioulis, D., et al. Directed evolution on the cold adapted properties of TAB5 alkaline phosphatase. Protein Eng. Des. Sel. 21, 319-327 (2008).
- McCarthy, J. K., Uzelac, A., Davis, D. F., Eveleigh, D. E. Improved catalytic efficiency and active site modification of 1,4-beta-D-glucan glucohydrolase A from Thermotoga neapolitana by directed evolution. J. Biol. Chem. 279, 11495-11502 (2004).
- Ren, C., Chen, T., Zhang, J., Liang, L., Lin, Z. An evolved xylose transporter from Zymomonas mobilis enhances sugar transport in Escherichia coli. Microbial cell factories. 8, 66 (2009).
- Tsuzuki, K. Thermostable mutants of the photoprotein aequorin obtained by in vitro evolution. J. Biol. Chem. 280, 34324-34331 (2005).
- Eijsink, V. G., Gaseidnes, S., Borchert, T. V., vanden Burg, B. Directed evolution of enzyme stability. Biomolecular engineering. 22, 21-30 (2005).
- Kumar, S., Nussinov, R. How do thermophilic proteins deal with heat. Cell. Mol. Life Sci. 58, 1216-1233 (2001).
- Hibbert, E. G., Dalby, P. A. Directed evolution strategies for improved enzymatic performance. Microb. Cell Fact. 4, 1475-2859 (2005).
- Rasila, T. S., Pajunen, M. I., Savilahti, H. Critical evaluation of random mutagenesis by error-prone polymerase chain reaction protocols, Escherichia coli mutator strain, and hydroxylamine treatment. Anal. Biochem. 388, 71-80 (2009).
- Wong, T. S., Roccatano, D., Zacharias, M., Schwaneberg, U. A statistical analysis of random mutagenesis methods used for directed protein evolution. J. Mol. Biol. 355, 858-871 (2006).
- Arnold, F. H., Wintrode, P. L., Miyazaki, K., Gershenson, A. How enzymes adapt: lessons from directed evolution. Trends in biochemical sciences. 26, 100-106 (2001).
