Summary
Ett nytt riktad evolution som är specifik för det område av termostabilitet teknik utvecklades och följaktligen validerade för bakteriolytiskt enzym. Efter endast en omgång av slumpmässig mutagenes, en utvecklad bakteriolytiskt enzym, PlyC 29C3, visade större än två gånger den kvarvarande aktivitet jämfört med vildtypsproteinet efter förhöjd temperatur inkubation.
Abstract
Riktad evolution definieras som en metod för att utnyttja det naturliga urvalet för att manipulera proteiner att förvärva särskilda egenskaper som inte är associerade med proteinet i naturen. Litteratur har gett många exempel när det gäller genomförandet av riktad evolution att framgångsrikt förändra molekylär specificitet och katalys 1. Den främsta fördelen med att använda riktad evolution i stället för mer rationell baserade metoder för molekylär teknik avser volym och mångfald av varianter som kan screenas 2. En möjlig tillämpning av riktad evolution handlar om att förbättra den strukturella stabiliteten hos bakteriolytiskt enzymer, såsom endolysins. Bakteriofag koda och uttrycka endolysins att hydrolysera en kritisk kovalent bindning i peptidoglykan (dvs. cellvägg) av bakterier, vilket resulterar i värdcellens lys och frigörelse av avkomma virioner. Noterbart dessa enzymer har förmågan att extrinsically inducera lys att susceptsg bakterier i frånvaro av fag och dessutom har validerats både in vitro och in vivo för deras terapeutiska potential 3-5. Ämnet för vår riktad evolution studie innebär PlyC endolysin, som består av PlyCA och PlyCB subenheter 6. När renas och lagt extrinsically, lyserar den PlyC holoenzym grupp A-streptokocker (GAS) samt andra streptokocker grupp på några sekunder och dessutom har validerats in vivo mot GAS 7. Betecknande övervakning kvarvarande enzymkinetik efter förhöjd temperatur inkubation ger distinkt bevis på att PlyC förlorar lytisk aktivitet abrupt vid 45 ° C, vilket tyder på en kort terapeutisk hållbarhetstid, vilket kan begränsa ytterligare utveckling av detta enzym. Ytterligare studier avslöjar bristen på termisk stabilitet endast observeras för PlyCA subenheten, medan PlyCB subenheten är stabil upp till ~ 90 ° C (opublicerad observation). Förutom PlyC finns finnseveral exempel i litteraturen som beskriver termolabila natur endolysins. Till exempel Staphylococcus aureus endolysin LysK och Streptococcus pneumoniae endolysins Cpl-1 och Pal förlorar aktivitet spontant vid 42 ° C, 43,5 ° C och 50,2 ° C respektive 8-10. Enligt Arrhenius ekvation, som beskriver sambandet mellan hastigheten för en kemisk reaktion på temperaturen som finns i det speciella systemet, kommer en ökning i termostabilitet korrelerar med en ökning i hållbarhetstiden förväntad 11. För detta ändamål har riktad evolution visat sig vara ett användbart verktyg för att förändra den termiska aktiviteten hos olika molekyler i naturen, men aldrig har denna teknik utnyttjats framgångsrikt för att studera bakteriolytiskt enzymer. Likaså framgångsrika konton framåt den strukturella stabiliteten hos denna klass av antimikrobiella medel är helt obefintlig. I den här videon, använder vi en ny metod som använder en fel-prett DNA-polymeras följt av en optimerad screening process med användning av en 96 brunnsformat mikrotiterplatta för att identifiera mutationer i PlyCA underenheten av PlyC streptokocker endolysin som korrelerar med en ökning av enzym kinetisk stabilitet (figur 1). Resultat efter bara en omgång med slumpmutagenes föreslår metoden genererar PlyC varianter som bibehåller mer än dubbelt kvarvarande aktivitet jämfört med vild-typ (WT) PlyC efter förhöjd temperatur behandling.
Protocol
1. Avgöra den optimala värme Villkor
Först måste man bestämma experimentellt den optimala inkubationstemperaturen och tid att använda för uppvärmning steget i analysen. För vår PlyC modell, är det viktigt att notera att E. E. coli samtransformeras med plyCA och plyCB gener på separata expressionsplasmider har visat sig bilda en fullt fungerande PlyC holoenzym 6. Den 96 brunnars mikrotiterplatta preparat samt celltillväxt förhållanden och efterföljande replica plating teknik anpassades från exempel tillhandahålls i litteraturen 12-16. En inkubationstid på 30 minuter kommer att vara lämpliga för denna analys som resultat från tidigare termisk inaktivering experiment diktera en snabb förlust i aktivitet under kortvarig inkubation i miljöer överskrider fysiologisk temperatur (opublicerad observation). Den optimala inkubationstemperaturen för PlyC utreddes av följande steg:
- Transform uttrycket konstruktionen pBAD24: plyCA (Amp r) i kompetent E. coli-stam DH5a pBAD33: plyCB (Cm r).
- Platta transformanterna på en Luria-Bertani (LB)-agarplatta som kompletterats med ampicillin (100 pg / ml) och kloramfenikol (35 pg / ml). Inkubera plattorna över natten vid 37 ° C.
- Med en steril tandpetare, ympa en individuell koloni i varje rad av brunnar (figur 2a) i en steril, klar, flatbottnade 96 väl, lockförsedd mikrotiterplatta som innehåller 200 pl LB kompletterat med ampicillin och kloramfenikol.
- Säkert placera 96 brunnars mikrotiterplatta på en 37 ° C skakinkubator och odla bakterierna natten vid 300 varv per minut.
- Hämta 96 brunnars mikrotiterplatta från 37 ° C skakinkubator och replika plattan till en ny 96 brunnars mikrotiterplatta enligt följande:
- Lägg 180 pl LB kompletterat med ampicillin och kloramfenikoltill varje brunn i plattan replika.
- Överför 20 pl av bakterier från den ursprungliga plattan till motsvarande brunnar i repliken plattan. Detta bör leda till en initial OD 600 av ~ 0,5.
- Säkert placera kopian plattan på 37 ° C skakinkubator och inkubera plattan under 1 h vid 300 varv per minut, tillsätt sedan inductant. I fallet med de pBAD expressionssystem, är inductant 0,25% arabinos. Andra expressionssystem kan kräva olika inductants. Placera plattan tillbaka på 37 ° C skakinkubator och skaka vid 300 rpm under ytterligare 4 h för att medge proteinexpression. Expressionsnivåerna sträcker sig typiskt mellan 10-20 pg PlyC.
- När proteinuttryck har slutit, hämta replik plattan och pelletera bakterierna genom att placera 96 brunnars mikrotiterplatta i en kyld centrifug som innehåller en svängande-hink rötor som passar 96 brunnars mikrotiterplattor. Centrifugera vid 3.000 rpm under 10 minuter vid rumstemperatur.
- Avlägsna media supernatanten genom att långsamt vända mikrotiterplattan och försiktigt dekantering media.
- Lysera cellerna genom tillsats av 50 | il av B-PER II Bakteriell Protein Extraction Reagent till varje brunn. Inkubera plattan vid rumstemperatur under 20 minuter.
- Öka volymen i varje brunn till 120 pl genom att tillsätta 70 | il fosfatbuffrad saltlösning (PBS) pH 7,2.
- Pelletera olösliga cellrester genom centrifugering plattan vid 3.000 rpm under 10 minuter vid 4 ° C i kyld centrifug.
- Överför 110 | il av den lösliga rålysat till motsvarande brunnar i en 96 brunnars platta termocykler.
- Använda 30 min som den förutbestämda inkubationstiden, exponera de lösliga lysaten närvarande bor i 96 väl termocykler platta till en bred gradient temperaturområde spänner 15-20 ° C. Observera, är målet att bestämma vid vilken temperatur ett särskilt enzym förlorar> 95% katalytisk aktivitet.
- Efter inkubation, inkubera 96 vältermocykler plattan vid 4 ° C under 5 minuter och överför 100 pl av de lösliga lysaten från 96 väl termocykler platta till deras motsvarande väl plats i den slutliga 96 brunnars mikrotiterplatta.
- Med en 12-kanals multipipettor, tillsätt 100 pl av GAS-stammen D471 till varje brunn. Observera är D471 celler som ursprungligen lyofiliserades från natten kulturer och återsuspenderades med PBS pH 7,2 för att erhålla en OD 600 på ~ 2,0.
- Placera omedelbart 96 brunnar i mikroplattan spektrofotometern och övervaka enzymkinetiken genom att mäta OD 600 var 15 sekund under 20 minuter. Den lägsta temperaturen inkubation som motsvarade brunnar som saknade en förändring i optisk densitet (AOD ≤ 0,1) definieras som den icke-tillåtna temperaturen.
Efter ett brett temperaturområde skärm utförs för att identifiera den icke tillåtna temperaturen, kan stegen ovan upprepas över ett smalare intervall av temperaturer (5 ° -10 ° C) för att belysaden exakta icke-permissiv temperatur för enzymet av intresse. Notera, kan den icke-tillåtna temperaturen identifierats i denna analys vara annorlunda än smälttemperaturen belyses med andra medel på grund av skillnader i volym, koncentration, etc.
2. Generera mutantbibliotek
Skapandet av den muterade biblioteket skall screenas innebär slumpvis innehåller mutationer av ett felbenägen DNA-polymeras med minimal nukleotid bias i plyCA genen med hjälp av GeneMorph II slumpmässig mutagenes Kit enligt följande:
- Utforma nukleotid primrar med liknande smälttemperaturer (Tm) mellan 55-72 ° C med restriktionsställena av val vid 5 'och 3' ändarna av genen plyCA.
- Eftersom den önskade mutationen uppgår 2-3 nukleotider per plyCA (1,4 MB), använd PCR koncentrationerna reaktionskomponenten samt villkoren termocykler rekommenderas av tillverkaren för låg mutation frequencies (0-4,5 per kb).
- Klona de muterade plyCA gener i expressionsvektorn pBAD24.
- Förvandla konstruktionerna i en DH5a pBAD33: plyCB bakgrund och transformanterna platta på LB-agarplattor kompletterade med ampicillin och kloramfenikol.
- Dessutom, omvandla och platta DH5a pBAD33: plyCB med uttryckningsvektorn pBAD24 innehållande WT plyCA genen. Kolonier från denna platta kommer att fungera som kontroller under screening.
3. 96 brunnars mikrotiterplatta Framställning och Cell tillväxtbetingelser
- Fyll varje brunn i en 96 brunnars mikrotiterplatta med 200 pl LB kompletterat med ampicillin och kloramfenikol.
- Efter mikrotiterplattan schema (figur 2b), noggrant välja en individuell koloni från natten agarplattorna med en steriliserad tandpetare och inokulera bakterier i utsedda brunn i 96 mikrotiterplattor PLAte. Det är viktigt att säkerställa att endast en koloni per brunn ympas.
- Skaka förankrad 96 brunnars mikrotiterplatta vid 300 rpm över natten vid 37 ° C.
4. Replica plating, Protein Expression Induktion och Lysate Förberedelser
- Följ stegen 1,5-1,11 från avsnittet "Bestämma de optimala värme villkor" med en modifikation. Förvara den ursprungliga plattan vid 4 ° C efter replik pläteringssteget har avslutats.
- Efter steg 1,11, överföring 110 pl av det lösliga rålysat till motsvarande brunnar i en 96 brunnars platta termocykler undantag för positiva kontrollbrunnar A1-D1. När det gäller de positiva kontroll lysaten (dvs. lysat som inte värms), överföring 100 pl av lysaten till motsvarande brunnar i en ny 96 brunnars mikrotiterplatta som kommer att fungera som den slutliga analysen plattan för experimentet och förvara på is.
5. Löslig Lysat Värmebehandling
- Värm den negativa kontrollen och mutant lösliga lysat närvarande inneslutet i 96 väl termocykler platta i termocykler under 30 min vid den optimerade icke-permissiv inkubationstemperatur bestäms i steg 1.
- Efter icke-permissiv temperatur inkubation inkubera 96 väl termocykler platta vid 4 ° C under 5 min.
- Överför 100 | il av de lösliga lysaten från 96 väl termocykler platta till deras identiska väl platser i den slutliga 96 väl mikrotiterplatta assayplatta redan innehåller de positiva kontroll lösliga lysat.
- Med en 12-kanals multipipettor, tillsätt 100 pl av GAS-stammen D471 till varje brunn. Omedelbart placera plattan i mikroplattan spektrofotometern.
- Övervaka enzymkinetiken genom att mäta OD 600 var 15 sekund under 20 minuter.
- En PlyC variant med fortskred termiska beteende definieras som en konstruktion som kan minska den ursprungliga optiska densiteten med 50 procent på mindre än 900 sekunder vidicke-permissiv temperatur. Dessutom de positiva kontrollerna (dvs. icke-uppvärmd, WT PlyC) måste visa WT katalytisk aktivitet (t 1/2 ≤ 100 sek) och de negativa kontrollerna (dvs. uppvärmd, WT PlyC) bör sakna aktivitet.
- När en PlyC variant med fortskred termiska beteende identifieras, hämta den ursprungliga plattan lagrades vid 4 ° C och inokulera bakterier från individen väl specifika mutanten av intresse i färskt LB-medium kompletterat med ampicillin och kloramfenikol. Väx inokulatet över natten vid 37 ° C.
- Utdrag och rena plasmid-DNA från kulturen och sedan skicka för sekvensering för att identifiera de nukleotidmutationer som utläsa förbättrad termisk beteende PlyCA. Dessutom kompletterar en liten alikvot från övernattskultur med 10% glycerol och förvaras vid -80 ° C för vidare användning.
Representative Results
Vid slutet av den första omgången av slumpmässig mutagenes har över 6.000 PlyC mutanter screenas och totalt 35 mutanter med potentiellt ökad termisk beteende identifierades, ut och sekvenseras. Genomisk analys sammanfattas i Tabell I, antyder att de 35 kandidaterna, 7 av konstruktionerna innehöll WT PlyCA sekvenser vid nivån för translation, motsvarande falska positiva som identifieras av analysen. Av de återstående 28 kandidaterna var mutationen intervallet 1 till 6 nukleotidmutationer med en genomsnittlig mutationshastighet för 2,75 nukleotider per plyCA gen, som var i 2-3 nukleotider mutationen sortiment vi inriktning. På den translationella nivån, gav denna nukleotid mutation intervall och frekvens en aminosyra intervall syra mutation av 1 till 5 aminosyror, med en genomsnittlig mutationshastighet för 1,9 aminosyramutationer per PlyCA polypeptid.
Av de 28 kandidater med minst en aminosyra Mutatjon var fyra av dessa muterade konstruktioner slumpmässigt valts ut för ytterligare karakterisering att validera att den omfattande screening process av riktad evolution metoden verkligen fungerade korrekt. De mutanta PlyC enzymerna renades till> 95% homogenitet baserat på SDS-PAGE-analys såsom tidigare beskrivits 6-7. Enzymkinetik av WT PlyC och var och en av de fyra PlyC mutanterna karakteriserades vid lika molära koncentrationer efter inkubering av renade enzymer vid olika förhöjda temperaturer. Aktiviteten övervakades efter tillsats av D471 GAS genom mätning av den optiska densiteten vid 600 nm var 15 sek i 20 min. Aktivitet definierades som den återstående maximala hastigheten av enzymet efter inkubation värme. Av de fyra kandidaterna slumpmässigt valts ut för ytterligare karakterisering visade mutant 29C3 mest förbättrade termiska beteende. Den termiska beteende WT PlyC och 29C3 undersöktes vid olika temperaturer medan inkubering och analys med avseende på aktivitet i PBS pH 7,2 vid80 nM och 40 koncentrationer nM, respektive. De 45-50 ° C inkubation experiment (figur 3) utfördes i en termocykler där proven inkuberades i en tunnväggig 96 väl termocykler platta i en total volym av 120 | il. Den 35 ° C, 40 ° C och 45 ° C inkubation experiment (figur 4 och 5) utfördes i ett värmeblock där proven inkuberades i en 1,5 ml mikrocentrifugrör i en total volym av 1,3 ml. Alla experiment utfördes i triplikat.
WT PlyC och 29C3 visade ingen signifikant skillnad i kinetisk stabilitet vid rumstemperatur (25 ° C), såsom visas i den första uppsättningen av stänger i figur 3. Emellertid, efter en kort sikt inkubation under 30 min från temperaturer från 45-50 ° C var aktiviteten av 29C3 väsentligt större än aktiviteten specifik för WT konstruktionen vid varje temperatur punkt. Till exempel visade WT PlyC en 44% förlust i aktivitet vid 45,2° C medan 29C3 visade endast en 2% förlust i aktivitet vid samma temperatur.
Långsiktiga inkubation studier som jämför den återstående aktiviteten av både WT PlyC och 29C3 var dessutom genomfördes vid 35 ° C och 40 ° C, inbegripande mätning av kvarvarande aktivitet vid 24 och 48 tim tidpunkter. Vid 35 ° C, visade 29C3 41% och 176% högre aktivitet än WT PlyC vid 24 och 48 h inkubation poäng tid, respektive (figur 4a). Vid 40 ° C, visade 29C3 28% och 107% högre aktivitet än WT PlyC vid 24 och 48 h inkubation poäng tid, respektive (Figur 4b).
Den kvarvarande aktiviteten för WT PlyC och 29C3 övervakades också var 20 minut under totalt 3 timmar vid 45 ° C. WT PlyC kunde bara behålla 21% aktivitet efter en 3 timmars inkubation vid denna temperatur medan 29C3 kunde behålla 46% aktivitet. Halveringstiden (t 1/2) för WT PlyC och 29C3 var 67 och 147 minuter, respektive föreslå ning att 29C3 har en 2,2-faldig ökning i kinetisk stabilitet vid 45 ° C (figur 5).
| Totala levande 1 Kandidater | 35 |
| Kandidater med WT PlyCA sekvens | 7 |
| Sökande med ≥ 1 Amino Acid Mutation | 28 |
| - Genomsnittlig Nucleotide mutationshastighet (NT / plyCA) | 2,75 |
| - Nucleotide Mutation Range (nt) | 1-6 |
| - Genomsnittlig Amino Acid mutationshastighet (AA / PlyCA) | 1,9 |
| - Aminosyra Mutation Range (AA) | 1-5 |
Tabell 1. Kandidat Pool Genomic Analysis.
pload/4216/4216fig1highres.jpg "/>
Figur 1. Riktad evolution analys metod. I riktad evolution börjar en med ledningen enzymet, vilket skulle vara WT PlyC för den första omgången. Ett bibliotek av PlyC mutanter innehållande slumpmässiga objektiva nukleotidmutationer till plyCA genen konstrueras sedan genom ett felbenägen DNA-polymeras, klonades in i expressionsvektorn pBAD24 och transformerades in i E. coli stam DH5a redan innehållande pBAD33:. plyCB Enskilda transformanter inokuleras i sina egna specifika brunn i en 96 brunnars mikrotiterplatta. Genom en omfattande screening process, individuella PlyC mutanter som är katalytiskt aktiva efter inkubation vid en icke-tillåten temperatur klassificeras som mutanter med förbättrad kinetisk stabilitet. Theconstruct visa mest gått termiska beteende kommer därför blir den ledande enzymet för nästa omgång av slumpmässig mutagenes. Sammantaget finns det tre kompletta rundor Random mutagenes följt av DNA-skyffling resulterar i en bakteriolytiskt molekyl med utvecklad termiska beteende. Klicka här för att se större bild .
Figur 2. 96 brunnars mikrotiterplatta mallar för riktad evolution analys. Mikrotiterplattan schematiska under bestämningen av de optimala förhållandena uppvärmning (Figur 2a) består av ympa en enda föräldra WT PlyC klon i varje rad av mikrotiterplattan. Mikrotiterplattan schematiska under mutant screening (Figur 2b) består av ympning varje brunn i kolumn 1 med en unik föräldra WT PlyC klon samt ympning varje brunn i spalterna 2-12 med en distinkt PlyC mutant klon. Wells A1-D1 utses för de positiva föräldrakontroll, som samarbetarnsist av WT PlyC konstruktioner inte utsätts för icke-tillåten temperatur inkubation. Wells E1-H1 är avsedda för de negativa föräldrakontroll, som består av WT PlyC konstruktioner som utsätts för icke-tillåten temperatur inkubation.
Figur 3. Restaktivitet kinetisk analys jämför WT PlyC och 29C3. Enzymer renades till homogenitet och inkuberades under 30 min i en termocykler vid lika molära koncentrationer vid antingen rumstemperatur eller vid en temperatur-gradient som sträcker sig från 45-50 ° C. Enzymatisk aktivitet korrelerar med den maximala hastigheten visas efter specifik temperatur inkubation. Med undantag av 25 ° C och 47,7 ° C, variationen i aktivitet mellan WT och 29C3 vid varje temperatur korrelerat till ett p-värde <0,05. Alla data rapporteras som medelvärdet ± SEM för tre oberoende experiment. 
Figur 4. Restaktivitet kinetisk analys jämför WT PlyC till 29C3 vid 35 ° C och 40 ° C. Lika molära koncentrationer av renat WT PlyC och 29C3 inkuberades i ett värmeblock vid 35 ° C (figur 4a) eller 40 ° C (figur 4b). Den kvarvarande enzymaktiviteten mättes vid 24 och 48 tim tidpunkter. Aktiviteten visas av varje konstruktion normaliserades till den maximala hastigheten som visas vid tidpunkt noll. Variationen i aktivitet mellan WT och 29C3 vid varje temperatur och tidpunkt korreleras till ett p-värde <0,05. Alla data rapporteras som medelvärdet ± SEM för tre oberoende experiment.
Figur 5. Restaktivitet kinetisk analys jämförWT PlyC till 29C3 vid 45 ° C. Lika molära koncentrationer av renat WT PlyC och 29C3 inkuberades i ett värmeblock vid 45 ° C och den kvarvarande enzymaktiviteten mättes var 20 min under 3 timmar. Aktiviteten visas av varje konstruktion normaliserades till den maximala hastigheten som visas vid tidpunkt noll. Med undantag av datapunkterna vid 20 min, variationen i aktivitet mellan WT och 29C3 vid varje tidpunkt korrelerat till ett p-värde <0,05. Alla data rapporteras som medelvärdet ± SEM för tre oberoende experiment.
Discussion
Detta protokoll, som beskrivs i figur 1, presenterar en 96 väl metodik mikrotiterplatta som gör att man kan utnyttja riktad evolution för att öka värmestabiliteten hos ett bakteriolytiskt enzym. Genom användning av ett felbenägen DNA-polymeras, kan man införa slumpmässiga mutationer som ökar den totala kinetiska stabiliteten av den translaterade bakteriolytiskt molekylen av intresse, vilket är typiskt beror på molekylära omorganisationer bestående av ökande elektrostatisk, disulfidbrygga och hydrofoba interaktioner som genererar förbättrad molekylär packning, förbättrade modifieringar av nätverk yta avgift eller förstärkning av ett högre oligomerisering tillstånd 17-18. Efter införandet av nukleotidmutationer gjordes en omfattande screening förfarande används sedan för att identifiera mutationer som är termiskt fördelaktigt. De representativa resultat presenteras här var baserade på en omgång av slumpmässig mutagenes. I verkligheten har det föreslagits attminst tre på varandra följande rundor av slumpmässig mutagenes, är varje med den mest robusta mutanten som den ledande enzymet, följt av DNA-skyffling lämplig för dessa typer av riktad evolution termiska beteende studier 2.
Det är viktigt att förstå att även detta protokoll identifierar mutationer som utökar kinetisk stabilitet, inte dessa varianter inte nödvändigtvis ökat termostabilitet. En molekyl anses termostabil när den har förmågan att bibehålla sin struktur vid en hög temperatur. I den presenterade analysen, är den kvarvarande aktiviteten av de mutanta lysaten analyserades inte vid samma temperatur som de initialt inkuberades vid under värmebehandlingssteget och därmed en kan selektera för mutationer som främjar återveckning snarare än förbättrad termostabilitet 19. Medan vi extrapolera termiskt beteende som en indikation på termisk stabilitet, måste sanna termisk stabilitet mätas empiriskt genom Biophyska metoder såsom cirkulär dikroism (CD), differentiell svepkalorimetri (DSC) och differentialavsökande fluorimetri (DSF). Preliminära data från CD-och DSF experiment tyder på att flera kandidater identifierats från den presenterade metoden verkligen inte visa fortskred termostabilitet (data visas inte).
Även den metod som presenteras här är specifik för genomförandet ökad termisk beteende PlyC kan samma metodik dessutom användas för att förbättra termisk aktivitet till andra bakteriolytiskt enzymer med några smärre ändringar variabler såsom buffertar, priser mutation, villkor värme-och uttryck. En kritisk variabel associerad med denna analys avser nukleotid mutationshastighet av felbenägna DNA-polymeras. Vi valde att använda felbenägen Mutazyme II DNA-polymeras i vår riktad evolution analys på grund av experimentella bevis tyder detta enzym visar minsta partiskhet medgäller vilka nukleotider är slumpvis införlivas genen av intresse jämfört med andra slumpmässiga mutagenestekniker, såsom användning av hydroxylamin, mutator E. coli-stammar och andra felbenägen DNA polyermases 20. I allmänhet, lägre mutation tenderar att vara mer önskvärt av två skäl. Först består teknisk termostabilitet till proteiner typiskt relativt få aminosyrasubstitutioner. Höga mutation priser kan orsaka dramatiska strukturella förändringar till vissa molekyler som slutgiltigt kan leda strukturell felveckning och funktionella avvikelser. Till exempel, kan inkorporeringen av glycin och prolinrester störa alfa spiralformade sekundära strukturer 21. Det andra, höga nukleotid mutation skulle öka chanserna att införliva prematura stoppkodon, vilket resulterar i trunkerade molekyler som är biologiskt inaktiva. I allmänhet lägre priser mutation föredrages eftersom lägre felprocent resulterar i accumulring av adaptiva mutationer medan högre mutation priser genererar neutrala eller skadliga mutationer 22.
För varje omgång av slumpmässig mutagenes, innebär en annan kritisk variabel som man måste optimera inkubationstemperaturen används under screeningsprocessen. Val av den experimentella icke-permissiv temperatur är relativt utmanande. Vi användes ursprungligen en inkubationstemperatur som var 10 ° C högre än den icke-tillåtande temperatur PlyC, men efter screening 3.000 mutanter, kunde vi inte hitta några fördelaktiga mutationer. Med tanke på riktad evolution metoder består av sekventiellt identifiera nyttiga aminosyrasubstitutioner som har additiva effekter bestämdes det att en mindre sträng temperatur bör användas under screening process, även om den ökade risken för att generera falskt positiva. Som sådan har vi använt en inkubationstemperatur som var bara några grader över den icke-permissive temperatur och återscreenades utvalda kandidater att utesluta falskt positiva.
Vi bestämde oss för att använda en inkubationstemperatur som inte var alltför tempererat (≤ 1 ° C högre än lägsta icke tillåtna temperaturen) och omvänt inte för hårt (≥ 5 ° C högre än lägsta icke tillåtna temperaturen). Den idealiska temperaturen beslutade vi att använda i denna analys var en måttlig 2 ° C högre än den experimentellt bestämda icke-permissiv temperatur. Välja en temperatur som är alltför lätt kommer att resultera i en mycket högre falskt positiv identifiering takt än ~ 20% vi observerade (tabell I) vid användning av en måttlig inkubationstemperatur. Dessutom kan användning av en inkubationstemperatur som är alltför hård slutligen resulterar i oförmåga att identifiera mutanter med väsentligt förbättrad termisk beteende. Till exempel, med användning av en inkubationstemperatur av ≥ 5 ° C skulle ha resulterat i oförmågan att identifieralovande 29C3 mutant samt majoriteten av de andra kandidaterna som valts under den första rundan av screening.
I summering ger vi ett protokoll för teknik bakteriolytiskt enzymer för att förvärva ökad kinetisk stabilitet. Dessutom kan denna samma analys, utan uppvärmningssteg, användas för att screena för mutationer som ökar katalytisk aktivitet. Utöka både katalytisk aktivitet och termostabilitet är en viktig utvecklings hindret någon terapeutisk enzym. Medan detaljerna i detta protokoll är specifika för endolysin PlyC kan metoden anpassas till varje bakteriolytiskt enzym med endast ett fåtal ändringar. Vi presenterade preliminära resultat från endast den första omgången av mutagenes som validerar att funktionaliteten av analysen, vilket resulterar i genomförandet och identifiering av mutationer som genererar en ökning i molekylär termostabilitet av betydande storlek.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Emilija Renke och Janet Yu för tekniskt stöd. DCN stöds av bidrag från USA: s försvarsdepartement (DR080205, DM102823, OR09055 och OR090059). RDH stöds av ett bidrag från Maryland Jordbruk Experiment Station och en NIH Training Grant i cell-och molekylärbiologi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B-PER II Bacterial Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 78260 | |
| GeneMorph II Random Mutagenesis Kit | Agilent Technologies | 200500 | |
| Clear 96 Well, Flat-bottomed Microtiter Plate With Lid | BD Vacutainer Labware Medical | 353072 | |
| 96 Well Nonskirted PCR Plates | Fisher Scientific | 14-230-232 | |
| Swing-bucket Rotor | Eppendorf | A-2-DWP | |
| Ampicillin Sodium Salt | Fisher Scientific | BP1760 | |
| Chloramphenicol | Fisher Scientific | BP904 | |
| Arabinose | Fisher Scientific | BP2504 | |
| pBAD24 Expression Vector | ATCC | 87399 | |
| pBAD33 Expression Vector | ATCC | 87402 |
References
- Jackel, C., Kast, P., Hilvert, D. Protein design by directed evolution. Annual review of biophysics. 37, 153-173 (2008).
- Liu, L., Li, Y., Liotta, D., Lutz, S. Directed evolution of an orthogonal nucleoside analog kinase via fluorescence-activated cell sorting. Nucleic acids research. 37, 4472-4481 (2009).
- Fischetti, V. A. Bacteriophage lysins as effective antibacterials. Curr. Opin. Microbiol. 11, 393-400 (2008).
- Fischetti, V. A., Nelson, D., Schuch, R. Reinventing phage therapy: are the parts greater than the sum. Nat. Biotechnol. 24, 1508-1511 (2006).
- Loessner, M. J. Bacteriophage endolysins--current state of research and applications. Curr. Opin. Microbiol. 8, 480-487 (2005).
- Nelson, D., Schuch, R., Chahales, P., Zhu, S., Fischetti, V. A. PlyC: A multimeric bacteriophage lysin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 10765-10770 (2006).
- Nelson, D., Loomis, L., Fischetti, V. A. Prevention and elimination of upper respiratory colonization of mice by group A streptococci using a bacteriophage lytic enzyme. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 4107-4112 (2001).
- Filatova, L. Y., Becker, S. C., Donovan, D. M., Gladilin, A. K., Klyachko, N. L. LysK, the enzyme lysing Staphylococcus aureus cells: specific kinetic features and approaches towards stabilization. Biochimie. 92, 507-513 (2010).
- Varea, J., et al. Structural and thermodynamic characterization of Pal, a phage natural chimeric lysin active against pneumococci. J. Biol. Chem. 279, 43697-43707 (2004).
- Sanz, J. M., Garcia, J. L., Laynez, J., Usobiaga, P., Menendez, M. Thermal stability and cooperative domains of CPL1 lysozyme and its NH2- and COOH-terminal modules. Dependence on choline binding. J. Biol. Chem. 268, 6125-6130 (1993).
- Anderson, G., Scott, M. Determination of product shelf life and activation energy for five drugs of abuse. Clin. Chem. 37, 398-402 (1991).
- Kim, G. J., Cheon, Y. H., Kim, H. S. Directed evolution of a novel N-carbamylase/D-hydantoinase fusion enzyme for functional expression with enhanced stability. Biotechnol. Bioeng. 68, 211-217 (2000).
- Koutsioulis, D., et al. Directed evolution on the cold adapted properties of TAB5 alkaline phosphatase. Protein Eng. Des. Sel. 21, 319-327 (2008).
- McCarthy, J. K., Uzelac, A., Davis, D. F., Eveleigh, D. E. Improved catalytic efficiency and active site modification of 1,4-beta-D-glucan glucohydrolase A from Thermotoga neapolitana by directed evolution. J. Biol. Chem. 279, 11495-11502 (2004).
- Ren, C., Chen, T., Zhang, J., Liang, L., Lin, Z. An evolved xylose transporter from Zymomonas mobilis enhances sugar transport in Escherichia coli. Microbial cell factories. 8, 66 (2009).
- Tsuzuki, K. Thermostable mutants of the photoprotein aequorin obtained by in vitro evolution. J. Biol. Chem. 280, 34324-34331 (2005).
- Eijsink, V. G., Gaseidnes, S., Borchert, T. V., vanden Burg, B. Directed evolution of enzyme stability. Biomolecular engineering. 22, 21-30 (2005).
- Kumar, S., Nussinov, R. How do thermophilic proteins deal with heat. Cell. Mol. Life Sci. 58, 1216-1233 (2001).
- Hibbert, E. G., Dalby, P. A. Directed evolution strategies for improved enzymatic performance. Microb. Cell Fact. 4, 1475-2859 (2005).
- Rasila, T. S., Pajunen, M. I., Savilahti, H. Critical evaluation of random mutagenesis by error-prone polymerase chain reaction protocols, Escherichia coli mutator strain, and hydroxylamine treatment. Anal. Biochem. 388, 71-80 (2009).
- Wong, T. S., Roccatano, D., Zacharias, M., Schwaneberg, U. A statistical analysis of random mutagenesis methods used for directed protein evolution. J. Mol. Biol. 355, 858-871 (2006).
- Arnold, F. H., Wintrode, P. L., Miyazaki, K., Gershenson, A. How enzymes adapt: lessons from directed evolution. Trends in biochemical sciences. 26, 100-106 (2001).
