Summary
Termostabilite mühendisliği alanında belirli bir yeni yönlendirilmiş evrim yöntem bacteriolytic enzimler için geliştirilen ve sonuç olarak doğrulanmıştır. Yükseltilmiş sıcaklıkta inkübasyon sonrasında yabani-tip protein ile karşılaştırıldığında rasgele mutagenez sadece bir yuvarlak, gelişmiş bir bacteriolytic enzim, PlyC 29C3, iki kez etkinlik kalıntı daha fazla görüntülenen sonra.
Abstract
Yönlendirilmiş evrim doğada protein ile ilişkili olmayan belirli özelliklerini elde etmek için mühendislik proteinleri için doğal seleksiyon yararlanmak için bir yöntem olarak tanımlanır. Edebiyat başarıyla moleküler özgüllüğü ve kataliz 1 değiştirmek için yönlendirilmiş evrim uygulanmasına ilişkin sayısız örnekler vermiştir. Yerine moleküler mühendislik için daha rasyonel tabanlı yaklaşımların yönlendirilmiş evrim kullanan birincil avantajı 2 taranabilir varyantların hacmi ve çeşitliliği ile ilgilidir. Yönlendirilmiş evrim olası bir uygulaması gibi endolysins gibi bacteriolytic enzimler, iyileştirilmesi yapısal kararlılık gerektirir. Kodlamak ve döl virionlar ev sahibi hücre parçalama ve kurtuluş sonuçlanan, bakterilerin peptidoglikan (yani hücre duvarı) kritik bir kovalent bağ hidrolize endolysins ifade bakteriyofaj. Özellikle, bu enzimler dışsal Yatkınlık için lizis ikna yeteneğine sahipfaj yokluğunda ve ayrıca ible bakteriler, in vitro ve bunların terapötik potansiyel 3-5 için in vivo olarak doğrulanmıştır. Bizim yönlendirilmiş evrim çalışmanın konusu PlyCA ve PlyCB alt birimlerinin 6 oluşur PlyC endolysin, içerir. Saflaştırıldı ve dışsal olarak eklendiğinde, PlyC holoenzyme birkaç saniye içinde grubu streptokoklar (GAS) yanı sıra, başka streptokokal grupları lysis oluşumunu ve ayrıca GAZ 7 karşı in vivo olarak doğrulanmıştır. Anlamlı, yüksek sıcaklıklarda inkübasyon sonrası rezidüel enzim kinetiği izlenmesi PlyC Bu enzimin ek geliştirme sınırlayabilir kısa bir terapötik raf ömrü, düşündüren, 45 ° C'de aniden litik aktivite kaybeder o ayrı kanıt sağlar. Daha ileri çalışmalar PlyCB altbirim kararlı iken, termal kararlılık eksikliği ancak PlyCA alt ünitesi için gözlenen açığa kadar ~ 90 ° C (yayınlanmamış gözlem). PlyC ek olarak, s varendolysins arasında termolabil doğasını açıklamak literatürde everal örnekler. Örneğin, Staphylococcus aureus endolysin LysK ve Streptococcus pneumoniae endolysins Cpl-1 ve Pal 42 kendiliğinden etkinlik kaybetmek ° C, 43.5 ° C ila 50.2 ° C, sırasıyla 8-10. Belirli bir sistem içinde mevcut sıcaklık için bir kimyasal reaksiyon oranı ile ilgilidir Arrhenius denklemi göre, termostabilite bir artış raf ömrü 11 bir artış ile ilişkili olacaktır. Bu amaçla, yönlendirilmiş evrim doğada çeşitli moleküllerin termal aktivite değiştirmek için yararlı bir araç olduğu gösterilmiştir, ancak bu özel teknoloji bacteriolytic enzimlerin çalışması için başarıyla yararlanan olmuştur asla. Aynı şekilde, antimikrobiyaller bu özel sınıfın yapısal stabilite ilerliyor başarı hesapları tamamen varolmayan vardır. Bu videoda, biz bir hata-pr kullanan bir roman metodoloji istihdambir DNA polimeraz enzim kinetik stabilite artışı (Şekil 1) ile bağlantılıdır PlyC streptokok endolysin arasında PlyCA alt ünitesine mutasyonları tanımlamak için bir 96 oyuklu plaka formatı kullanılarak iyileştirilmiş bir tarama işlemi takip eder. Rastgele mutajenez sadece bir tur sonra Sonuçlar metodolojisi yüksek sıcaklık tedavi sonrası vahşi tip (WT) PlyC kıyasla iki kat daha fazla rezidüel aktivitesi korumak PlyC türevlerini üreten düşündürmektedir.
Protocol
1. Optimal Isıtma Koşullar Belirlenmesi
İlk olarak, bir tane deneysel olarak ideal sıcaklık ve inkübasyon tahlil içinde ısıtma işlemi için kullanılacak zaman belirlemek gerekir. Bizim PlyC modeli için, dikkat edilmesi gereken önemli olduğunu E. coli ayrı ifade plazmit üzerinde plyCA ve plyCB genleri ile birlikte transforme tam olarak işlevsel PlyC holoenzyme 6 oluşturacak şekilde gösterilmiştir. Yanı sıra hücre büyüme koşulları ve sonraki yineleme kaplama tekniği olarak 96 oyuklu plaka hazırlık literatürde 12-16 sağlanan örneklerden adapte edildi. Önceki termal inaktivasyon denemelerinden alınan sonuçlar fizyolojik sıcaklık (yayınlanmamış gözlem) aşan ortamlarda kısa süreli inkübasyon sırasında faaliyetteki hızlı kaybı dikte olarak 30 dk bir inkübasyon süresi bu testte için uygun olacaktır. PlyC için optimum sıcaklık inkübasyon aşağıdaki adımlar ile belirlendi:
- TranYetkili E. içine plyCA (Amp r): İfade yapı pBAD24 sform plyCB (Cm r): coli DH5α pBAD33 süzün.
- Ampisilin (100 mg / ml) ve kloramfenikol (35 mg / ml) ile desteklenmiş bir Luria-Bertani (LB) agar plaka Plaka transformantlar. Gece boyunca 37 ° C'de inkübe plakaları
- Steril bir kürdan ile, iyi bir düz dipli, berrak, steril 96 kuyu her satır (Şekil 2a) içine tek bir koloni inoküle, ampisilin ve kloramfenikol ile desteklenmiş LB 200 ul içeren mikrotiter plaka değirmi.
- Güvenli bir 37 96 oyuklu plaka yerleştirin ° C inkübatör sallayarak ve 300 rpm'de gecede bakterileri büyür.
- 37 96 oyuklu plaka alma ° C aşağıdaki gibi yeni bir 96 oyuklu plaka için kuvöz ve çoğaltma plaka sallayarak:
- Ampisilin ve kloramfenikol ile desteklenmiş LB 180 ul ekleyinkopya plakanın her için.
- Kopya plaka karşılık gelen kuyulara orijinal plaka bakterilerin 20 ul aktarın. Bu ~ bir başlangıç OD 600 0.5 sonuçlanmalıdır.
- Güvenli bir şekilde 37 kopya plaka yerleştirmek ° C inkübatör sallama ile 300 rpm'de 1 saat için inkübe plaka, daha sonra inductant ekleyin. PBAD ekspresyon sistemleri söz konusu olduğunda, inductant% 0.25 arabinoz olup. Diğer ifade sistemleri, farklı inductants gerektirebilir. 37 geri plakası yerleştirin ° C protein ekspresyonu için izin vermek için ek bir 4 saat boyunca 300 rpm'de kuvöz ve sallamak sallayarak. İfade düzeyleri genellikle PlyC 10-20 mikrogram arasında değişmektedir.
- Protein ekspresyonu sonucuna sonra, 96 oyuklu plakalar uyan bir sallanan-kova rotor içeren bir soğutmalı santrifüj içinde 96 oyuklu plaka yerleştirerek kopya plaka ve pelet bakteri almak. Oda sıcaklığında 10 dakika için 3000 rpm'de santrifüj yapılır.
- Yavaşça ters mikrotiter plaka ile medya süpernatantı ortamı yavaşça şişeden.
- Her bir kuyucuğa B-PER II bakteriyel protein Ekstraksiyon Reaktifi 50 ul ilave edilerek hücreler parçalayıcı. 20 dakika oda sıcaklığında inkübe plaka.
- Fosfat 70 ul ekleyerek 120 ul her kuyuda hacmini artırın salin (PBS) pH 7,2 tampon.
- Pelet 10 dakika 4 ° C'de buzdolabında santrifüj için 3000 rpm'de dönen plaka ile çözünmeyen hücre kalıntıları.
- Bir 96 oyuklu plaka PCR karşılık gelen kuyulara çözülebilir ham lizat 110 ul aktarın.
- Önceden belirlenmiş bir inkübasyon süresi olarak 30 dakika kullanarak, şu anda 15-20 ° C kapsayan geniş bir degrade sıcaklık aralığı 96 PCR plaka ikamet çözünür lizatları maruz Not amacı, belirli bir enzim>% 95 katalitik etkinlik kaybeder sıcaklığında belirlemektir.
- İnkübasyondan sonra, kuyu 96 inkübe4 at termalcycler plakası 5 dakika ve de son 96 mikrotitre plakası kendilerine karşılık iyi bir konuma 96 PCR plaka çözünür lizatları 100 ul aktarın ° C.
- 12 kanallı multipipettor ile her kuyucuğa GAZ zorlanma D471 100 ul ekleyin. Not, D471 hücreleri başlangıçta gecede kültürlerden liyofilize ve ~ 2.0 bir OD 600 elde etmek için PBS pH 7.2 ile tekrar süspanse edilir.
- Hemen 20 dakika OD 600 her 15 sn ölçerek mikroplak spektrofotometrede 96 plaka yerleştirmek ve enzim kinetiği izlemek. Optik yoğunluk bir değişiklik (ΔOD ≤ 0.1) yoksun kuyulara karşılık düşük sıcaklık inkübasyon olmayan serbest sıcaklık olarak tanımlanır.
• geniş bir sıcaklık ekran olmayan serbest sıcaklık belirlemek için kullanıldı sonra, yukarıdaki adımların bir sıcaklık daha dar bir aralık (5 ° -10 ° C) aydınlatmak için üzerinde tekrarlanırsöz konusu enzimi için kesin olmayan serbest sıcaklığı. Not, bu tahlil içinde tanımlanan olmayan serbest sıcaklık bağlı hacim farklılıklar, konsantre hale getirme vb için başka araçlar ile belirlendi erime sıcaklığından daha farklı olabilir
2. Mutant Kitaplığı oluşturma
Taranacak mutant kütüphane oluşturulması rastgele şöyle GeneMorph II Rastgele Mutagenezi Kit kullanarak plyCA gen minimal nükleotid önyargı ile bir hata eğilimli DNA polimeraz tarafından mutasyonlar içeren içerir:
- 5 've 3' plyCA geninin ucunda tercih edilen kısıtlama siteleri ile 55-72 ° C arasında benzer bir erime sıcaklığına (Tm) sahip nükleotid primerleri tasarlar.
- İstenen mutasyon oranı plyCA başına 2-3 nükleotidler (1.4 kb) olduğundan, düşük f mutasyon için PCR reaksiyonu bileşen konsantrasyonlarının yanı sıra, imalatçı tarafından tavsiye edilen PCR koşulları kullanmakrequencies (kb başına 0-4,5).
- Ifade vektörü içine pBAD24 mutagenized plyCA gen klonlama.
- PlyCB arka plan ve ampisilin ve kloramfenikol ile desteklenmiş LB agar plaklarına plaka transformantlar: Bir DH5α pBAD33 içine yapıları Transform.
- Buna ek olarak, dönüştürme ve plaka DH5α pBAD33: plyCB ifade vektörü pBAD24 WT plyCA geni ihtiva eden ile. Bu plaka Kolonileri tarama sırasında denetimleri olarak görev yapacak.
3. 96 oyuklu plaka Hazırlama ve Hücre Büyümesi Şartları
- Ampisilin ve kloramfenikol ile desteklenmiş LB 200 ul ile 96 oyuklu plakanın her doldurun.
- Mikrotiter plate şematik (Şekil 2b) takiben, dikkatli steril bir kürdan ile gecede agar plaklarına bireyin koloni seçin ve 96 iyi tasarlanmış oyuklu pla bakteriler inokülete. Bu başına sadece bir koloni de inoküle edilir sağlamak esastır.
- 37 gecede 300 rpm'de güvenli demirlemiş 96 oyuklu plaka çalkalayın ° C.
4. Replica Kaplama, Protein Ekspresyonu İndüksiyon ve Lizat Hazırlama
- Bir değişiklik ile "optimum ısıtma koşullarının belirlenmesi" başlıklı bölümünden adımları 1,5-1,11 izleyin. Çoğaltma kaplama adım varmıştır ° C den sonra 4 de orijinal plaka saklayın.
- Sonra adım 1.11, pozitif kontrol kuyuları A1-D1 hariç bir 96 PCR plaka karşılık gelen kuyulara çözülebilir ham lizat transfer 110 ul. Pozitif kontrol lizatları (ısıtmalı değil yani lizatları), buz üzerinde deney ve mağaza için nihai tahlil plaka olarak hizmet verecek yeni bir 96 oyuklu plaka karşılık gelen kuyulara lizatları transfer 100 ul ile ilgili.
5. Çözünür Lizat Isıl İşlem
- Negatif kontrol ve 1. adımda belirlenen optimum olmayan serbest inkübasyon sıcaklığında 30 dakika için PCR içinde 96 oyuklu plaka PCR şu anda kapalı lizatları mutant çözünür ısıtın.
- Non-izin veren sıcaklık inkübasyondan sonra, 5 dakika 4 ° C de 96 PCR plaka inkübe edilir.
- Önceden pozitif kontrol lizatları çözünür içeren nihai 96 oyuklu tahlil plakası da onların aynı konumlara 96 PCR plaka çözünür lizatları 100 ul aktarın.
- 12 kanallı multipipettor ile her kuyucuğa GAZ zorlanma D471 100 ul ekleyin. Hemen mikroplak spektrofotometrede plakası yerleştirin.
- 20 dakika için OD 600 her 15 saniye ölçme tarafından enzim kinetikleri izler.
- Ilerledikçe termal davranışı ile PlyC varyantı az daha 900 sec 50 oranında orijinal optik yoğunluk azaltabilirsiniz bir yapı olarak tanımlanırolmayan müsamahakâr sıcaklığı. Ayrıca, pozitif kontrol (yani non-ısıtmalı, WT PlyC) WT katalitik aktivite göstermek gerekir (t 1/2 ≤ 100 sn) ve negatif kontrolleri (yani, WT PlyC ısıtmalı) aktivite yoksun olmalıdır.
- Ile bir varyant PlyC ısıl özellikleri tanımlanır ilerledikçe sonra, ampisilin ve kloramfenikol ile desteklenmiş taze LB ortam maddesine ilgili mutant için iyi belirli bireysel 4 ° C ve inokülasyon bakterilere depolanmış orijinal plaka alır. 37 gecede inokulum büyütün ° C.
- Özü ve saflaştırmak plazmid DNA kültürden sonra PlyCA gelişmiş termal davranış anlaması nükleotid mutasyonları tespit etmek için, sıralama için gönderin. Ayrıca, -80% 10 gliserol ve mağaza ° C daha fazla kullanım için olan gecede kültür küçük bir kısım ek.
Representative Results
Rastgele mutajenez ilk turun bitiminde, 6.000 'den fazla PlyC mutantlar tarandı ve potansiyel olarak artan ısıl davranışı ile 35 mutantlar toplam tanımlanan seçilmiş ve dizi analizleri yapıldı. Tablo I de özetlenmiştir genomik analizi, anlaşılacağı 35 kişide, tahlil tarafından tanımlanan yanlış pozitif karşılık gelen çeviri seviyesinde WT PlyCA sekanslar içerdiği yapıların 7 o. Kalan 28 adayların, mutasyon aralığı, 1'den biz hedeflediğiniz 2-3 nükleotid mutasyonu aralığında idi plyCA gen, başına 2.75 nükleotidlerin ortalama bir mutasyon oranı ile 6 nükleotid mutasyonu oldu. Translasyon düzeyinde, özellikle bu nükleotit mutasyon frekans aralığı ve polipeptid PlyCA başına 1,9 amino asidin mutasyonlarının, bir ortalama mutasyon oranı ile, 1 ila 5 amino asit, bir amino asit mutasyon dizi elde edilmiştir.
En az bir amino asit ile Mutat 28 adaylarıniyon, bu mutant yapıların dört rasgele yönlendirilmiş evrim metodoloji kapsamlı bir eleme süreci gerçekten düzgün olduğunu doğrulamak için daha ileri karakterizasyon için seçilmiştir. Mutant PlyC enzimler 6-7 önceden tarif edildiği gibi SDS-PAGE analizine göre>% 95 homojen bir hale edildi. WT PlyC ve dört PlyC mutant her enzim kinetikleri çeşitli yükseltilmiş sıcaklıklarda enzimler inkübe sonra eşit molar konsantrasyonlarda karakterize edilmiştir. Etkinlik 20 dakika için 600 nm, her 15 saniyede bir optik yoğunluk ölçülerek D471 gazın eklenmesinden sonra izlendi. Etkinlik ısı inkübasyondan sonra enzimin maksimum hızının kalıntı olarak tanımlanmıştır. Rastgele ileri karakterizasyonu için seçilen dört aday ki, mutant 29C3 en gelişmiş termal davranış gösterdi. Kuluçka ve PBS pH 7.2 'de etkinlik için assaying ise WT PlyC ve 29C3 ve termal davranışları farklı sıcaklıkta araştırılmıştır80 nM ve 40 nM konsantrasyonlarda sırasıyla. 45-50 ° C'de inkübasyon deneyleri (Şekil 3) örneklerinin 120 ul toplam hacim içinde bir ince duvarlı 96 PCR plaka içinde inkübe edildi bir PCR gerçekleştirilmiştir. 35 ° C, 40 ° C ve 45 ° C kuluçka deneylerden (Şekil 4 ve 5) örnek 1.3 ml toplam hacim içinde bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde inkübe edildi bir ısıtma bloğu içinde yapıldı. Tüm deneyler, kopyalardaki yapılmıştır.
WT PlyC ve 29C3 oda sıcaklığında (25 ° C) Şekil 3'te barlar ilk seti tasvir. Kinetik stabilite açısından anlamlı fark gösterdi Bununla birlikte, 45-50 arasındaki sıcaklıklarda 30 dakika ° C de bir kısa süreli inkübasyondan sonra, 29C3 faaliyeti her bir sıcaklık noktasında oluşturmak WT spesifik etkinlik önemli ölçüde daha büyük olmuştur. Örneğin, WT PlyC 45.2 az aktivitesinde% 44 kayıp görüntülenir° C iken, 29C3, aynı sıcaklıkta aktivitesinde sadece% 2'lik bir kayıp gösterdi.
WT PlyC ve 29C3 hem de kalıntı aktivitesi göre uzun süreli inkübasyondan çalışmalar ayrıca 35 de yapıldı ° C ve 40 ° C'de 24 saat ve 48 saat zaman noktalarında kalıntı aktivitesinin ölçümü içeren. 35 ° C'de, 29C3% 41 görüntülenir ve 24. WT PlyC ve 48 saat inkübasyon süresi noktaları, sırasıyla (Şekil 4a) daha 176% daha yüksek aktivite. 40 ° C'de, 29C3% 28 görüntülenir ve 24. WT PlyC ve 48 saat inkübasyon süresi noktaları, sırasıyla (Şekil 4b) den% 107 daha yüksek etkinlik.
WT PlyC ve 29C3 ve kalıntı aktivitesi ayrıca, 45 3 saat arasında bir toplam için her 20 dakikada ° C'de takip edilmiştir WT PlyC sadece 29C3% 46 aktivite korumak için mümkün iken bu sıcaklıkta 3 saat inkübasyondan sonra% 21 aktivite korumak başardı. WT PlyC ve 29C3 için yarılanma ömrü (t 1/2) sırasıyla 67 ve 147 dk idi, önermek sönme 29C3 45 ° C (Şekil 5) kinetik kararlılık içinde 2.2 kat artış vardır.
| Toplam Round 1 Adayları | 35 |
| WT PlyCA Sırası ile adaylar | 7 |
| ≥ 1 Amino Asit Mutasyon ile adaylar | 28 |
| - Ortalama Nükleotid Mutasyon Oranı (nt / plyCA) | 2.75 |
| - Nükleotid Mutasyon Aralığı (nt) | 1-6 |
| - Ortalama Amino Asit Mutasyon Oranı (AA / PlyCA) | 1.9 |
| - Amino Asit Mutasyon Aralığı (AA) | 1-5 |
Tablo 1. Aday Havuzu Genomik Analizler.
pload/4216/4216fig1highres.jpg "/>
Şekil 1. Yönlendirilmiş evrim test metodolojisine. Yönlendirilmiş evrim, bir ilk tur için WT PlyC olurdu kurşun enzimi ile başlar. PlyCA gen rastgele tarafsız nükleotid mutasyonları içeren PlyC mutantlar bir kütüphane, daha sonra bir hata eğilimli DNA polimeraz tarafından inşa ifade vektörü pBAD24 klonlanmış ve E. dönüşür coli zaten pBAD33 içeren DH5α süzün:. plyCB Bireysel transformantlar 96 oyuklu plaka çok iyi kendi özel inoküle edilir. Kapsamlı bir tarama süreci sayesinde, olmayan bir izin sıcaklığında inkübasyon sonrasında katalitik olarak aktif olan bireysel PlyC mutantlar geliştirilmiş kinetik kararlılık ile mutantlar olarak sınıflandırılır. Dolayısıyla rastgele mutagenez sonraki turda kurşun enzim haline olacak en ilerledi termal davranış gösteren Theconstruct. Genel olarak, randomize üç tam tur vardırm mutagenez gelişti termal davranışları ile bacteriolytic molekülünde edilen DNA shuffling izledi. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 2. Yönlendirilmiş evrim deneyi için 96 oyuklu plaka şablonları. Optimum ısıtma koşullarının belirlenmesi sırasında mikrotiter plate şematik (Şekil 2a) mikrotitre plakanın her satıra tek bir ebeveyn WT PlyC klon inokülasyon oluşur. Mutant tarama (Şekil 2b) ve mikro-titer plaka şematik bir eşsiz ebeveyn WT PlyC klon ile sütun 1, her sıra inokülasyon hem de ayrı bir PlyC mutant klon ile sütun 2-12 her çukurun inokülasyon oluşur. Wells A1-D1 eş olumlu ebeveyn denetimleri için belirlenmiş olanWT PlyC arasında nsist olmayan izin verilen sıcaklık inkübasyon maruz kalmaz oluşturur. Wells E1-H1 olmayan izin verilen sıcaklık inkübasyon maruz WT PlyC yapılardan oluşan olumsuz ebeveyn denetimleri için belirlenir.
Şekil 3,. WT PlyC ve 29C3 karşılaştırarak Kalıntı etkinlik kinetik analizi. Enzimler, homojen bir hale ve oda sıcaklığında ya da az ya da 45-50 ° C arasında değişen bir sıcaklık gradyanı eşit molar konsantrasyonlarda bir PCR içinde 30 dakika süre ile inkübe edildi ve Enzimatik aktivite belirli sıcaklık inkübasyondan sonra görüntülenen maksimum hız ile ilişkilidir. 25 ° C'de ve 47.7 ° C'de hariç olmak üzere, bir p-değeri <0.05 ile ilişkili her bir sıcaklıkta WT ve 29C3 arasında faaliyet varyasyonu. Tüm veriler ortalama ± üç bağımsız deneyin SEM olarak bildirilmiştir. 
Şekil 4. 35 29C3 WT PlyC göre Kalıntı etkinlik kinetik analiz ° C ve 40 ° saflaştırılmış WT PlyC ve 29C3 C. eşit molar konsantrasyonlarda 35 ° C'de (Şekil 4a) veya 40 ° C (Şekil 4b) bir ısıtma bloğu içinde inkübe edildi. Kalıntı enzim aktivitesi, 24 ve 48 saat zaman noktalarında ölçüldü. Her yapı tarafından görüntülenen aktivite zaman noktasında sıfır görüntülenen maksimum hıza göre normalize edildi. Her sıcaklık ve zaman noktada WT ve 29C3 arasında faaliyet varyasyon bir p-değeri <0.05 korelasyon gösteriyordu. Tüm veriler ortalama ± üç bağımsız deneyin SEM olarak bildirilmiştir.
Şekil 5,. Karşılaştırarak rezidüel aktivitesi kinetik analizi45 29C3 WT PlyC ° saflaştırılmış WT PlyC ve 29C3 C. eşit molar konsantrasyonlarda 45 ° C ve kalıntı enzim aktivitesi, 3 saat boyunca her 20 dakikada bir ölçüldü ısıtma bloğu içinde inkübe edildi. Her yapı tarafından görüntülenen aktivite zaman noktasında sıfır görüntülenen maksimum hıza göre normalize edildi. 20 dak veri noktalarının haricinde, her zaman noktasında WT ve 29C3 arasında faaliyet varyasyonun bir p-değeri <0.05 korelasyon gösteriyordu. Tüm veriler ortalama ± üç bağımsız deneyin SEM olarak bildirilmiştir.
Discussion
Şekil 1 'de özetlenen bu protokol, herhangi bir bacteriolytic termostabilite artırmaya yönelik evrim kullanmak olanak sağlayan bir 96 oyuklu plaka yöntemi sunar. Geliştirilmiş oluşturmak bir hata eğilimli DNA polimeraz kullanılarak, bir tipik olarak elektrostatik artan oluşan moleküler yeniden düzenlemeler nedeniyle ilgi tercüme bacteriolytic molekülü, genel olarak kinetik stabilitesini arttırmak rastgele mutasyonların tanıtmak için, disülfid köprü ve hidrofobik etkileşimler moleküler ambalaj, yüzey yükü ağlar veya daha yüksek bir oligomerizasyonun devletin 17-18 takviye gelişmiş değişiklikler. Nükleotid mutasyonu girişten sonra, kapsamlı bir tarama prosedürü ardından termal yararlı mutasyonları tanımlamak için kullanılmıştır. Burada sunulan temsilcisi sonuçlar rastgele mutajenez bir tur dayanmaktadır. Gerçekte, bu ileri sürülmüştürrastgele mutajenez en az üç ardışık tur, DNA shuffling ardından kurşun enzim olarak en güçlü mutant kullanarak her yönlendirilmiş evrim termal davranış bu tür çalışmalar 2 için uygundur.
Bu protokol kinetik kararlılık artırmak mutasyonlar tespit ederken, bu varyantlar ille termostabilite artış olmadığını anlamak önemlidir. Yüksek bir sıcaklıkta yapısı tutma yeteneğine sahip olduğunda bir molekül ısı ayarlı olarak kabul edilir. Ancak, sunulan bu tahlil içinde, mutant lizatları kalıntı aktivitesi başlangıçta ısıl işlem adımı sırasında inkübe edildi ve böylece bir 19 refolding yerine geliştirilmiş termostabilite desteklemek mutasyon için seçilerek olabilir ki, aynı sıcaklıkta test edilmemiştir. Biz termal istikrarın bir göstergesi olarak termal davranış extrapolating edilirken, gerçek termal stabilite Biophys ampirik olarak ölçülmesi gerekirdairesel dikroizm (CD), diferansiyel taramalı kalorimetre (DSC) ve diferansiyel tarama fluorimetry (DSF) gibi ical yöntemleri. CD ve DSF deneyler Ön veriler sundu metodolojisi tanımlanan birkaç aday gerçekten ilerledi termostabilite (veriler gösterilmemiştir) görüntülemek öneririz.
Burada sunulan metodoloji PlyC yükselmiştir termal davranışı uygulamak için belirli olsa da, bu aynı metodoloji ayrıca böyle tamponlar, mutasyon oranları, ısıtma koşulları ve ifade sistemleri gibi değişkenler için bazı küçük değişiklikler ile diğer bacteriolytic enzimler için termal aktivite geliştirmek için istihdam edilebilir. Bu tahlil ile ilişkili bir önemli değişken hata eğilimli DNA polimeraz nükleotid mutasyon oranı ile ilgilidir. Biz nedeniyle bu özel enzim ile önyargı az miktarda görüntüler gösteren deneysel kanıtlar bizim yönlendirilmiş evrim tayininde hataya Mutazyme II DNA polimeraz kullanmayı seçtiBu tür hidroksilamin kullanımı, mutator E. gibi diğer rasgele mutajenez teknikleri ile karşılaştırıldığında nükleotid ilişkin rasgele ilgilenilen genin dahil edilmiştir coli suşları ve diğer hata eğilimli DNA 20 polyermases. Genel olarak, düşük bir mutasyon oranları iki nedenden dolayı daha fazla arzu edilen olma eğilimindedir. İlk olarak, protein mühendisliği ile termostabilite tipik olarak nispeten daha az amino asit ikamesine oluşur. Yüksek mutasyon oranları kesin yapısal misfolding ve fonksiyonel farklılıklar neden olabilir belirli moleküllere önemli yapısal değişikliklere neden olabilir. Örneğin, glisin, prolin kalıntıları eklenmektedir alfa sarmal ikincil yapılar 21 bozabilir. İkincisi, yüksek nükleotid mutasyon oranları biyolojik olarak inaktif kesilmiş moleküller ile sonuçlanan, erken durdurmak kodonlar içeren şansını artırmak. Genel olarak, düşük bir mutasyon oranlar tercih edilir, çünkü accumul daha düşük hata oranı sonucunuadaptif mutasyon ation yüksek mutasyon oranları nötr veya zararlı mutasyonların 22 üretirken.
Rastgele mutajenez her turu için bir optimize gereken başka bir kritik değişken tarama işlemi sırasında kullanılan inkübasyon sıcaklığı içerir. Deneysel olmayan ılımlı sıcaklık seçimi nispeten zordur. Biz başlangıçta 10 olan bir inkübasyon sıcaklığı kullanılan ° C, PlyC-olmayan müsamahakâr sıcaklığından daha yüksek ise 3.000 mutantlar eleme sonrasında, herhangi bir faydalı mutasyonların tespit koyamadık. Yönlendirilmiş evrim yöntemleri sırayla additif etkileri vardır faydalıdır aminoasit değişikliğini tespit oluşmaktadır akılda tutarak, bunun yanlış pozitif üretme şansı artmış olsa bile daha az katı bir sıcaklık tarama sürecinde kullanılması gerektiğini tespit edilmiştir. Bu nedenle, biz sadece sigara-permiss C'nin birkaç derece üzerinde olduğu bir inkübasyon sıcaklığı kullanılırive sıcaklık ve rescreened seçilen adayların yanlış pozitif ekarte etmek.
Biz çok ılıman değildi bir inkübasyon sıcaklığı kullanmaya karar verdiler (≤ 1 ° C düşük olmayan müsamahakar sıcaklığından daha yüksek) ve tersine çok sert değil (≥ 5 ° düşük olmayan müsamahakar sıcaklığından daha yüksek C). Biz özellikle bu deneyde kullanmaya karar ideal sıcaklık ılımlı 2 ° C idi deneysel belirlenen non-müsamahakar sıcaklığından daha yüksek. Bir orta sıcaklıkta inkübasyon kullanıldığında çok hafif bir sıcaklık seçme gözlediğimiz ~% 20 (Tablo I) çok daha yüksek bir yanlış pozitif oran kimlik neden olur. Ayrıca, çok sert bir inkübasyon sıcaklığı kullanarak sonuçta önemli ölçüde geliştirilmiş termal davranışı ile mutantlar belirlemek için yetersizlik neden olabilir. Örneğin, ≥ 5 inkübasyon sıcaklığı kullanarak ° C tanımlamak için yetersizlik sonuçlandı olurdu29C3 mutant yanı sıra tarama ilk turda seçilen diğer adayların çoğunluğu umut.
Toplamı, biz gelişmiş kinetik kararlılık elde etmek için mühendislik bacteriolytic enzimler için bir protokol sağlar. Üstelik, bu ısıtma adımlar olmadan aynı tahlil, katalitik aktivitesini arttırmak mutasyonları tespit etmek amacıyla kullanılabilir. Katalitik aktivite ve termostabilite hem Augmenting herhangi bir terapötik enzim bakan önemli bir gelişimsel engeldir. Bu protokolün ayrıntılar endolysin PlyC özgü da, metodoloji sadece birkaç değişiklik ile herhangi bir bacteriolytic enzim için adapte edilebilir. Biz önemli büyüklükte moleküler termostabilite bir artış oluşturmak mutasyonların uygulanması ve kimlik sonuçlanan testin işlevsellik doğrular mutagenez yalnızca ilk turda alınan ön sonuçlarını sundu.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Yazarlar teknik yardım Emilija Renke ve Janet Yu teşekkür etmek istiyorum. DCN Savunma Amerika Birleşik Devletleri Bölümü (DR080205, DM102823, OR09055 ve OR090059) hibe tarafından desteklenmektedir. RDH Maryland Tarım Deneme İstasyonu ve Hücre ve Moleküler Biyoloji bir NIH Eğitim Grant bir hibe ile desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B-PER II Bacterial Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 78260 | |
| GeneMorph II Random Mutagenesis Kit | Agilent Technologies | 200500 | |
| Clear 96 Well, Flat-bottomed Microtiter Plate With Lid | BD Vacutainer Labware Medical | 353072 | |
| 96 Well Nonskirted PCR Plates | Fisher Scientific | 14-230-232 | |
| Swing-bucket Rotor | Eppendorf | A-2-DWP | |
| Ampicillin Sodium Salt | Fisher Scientific | BP1760 | |
| Chloramphenicol | Fisher Scientific | BP904 | |
| Arabinose | Fisher Scientific | BP2504 | |
| pBAD24 Expression Vector | ATCC | 87399 | |
| pBAD33 Expression Vector | ATCC | 87402 |
References
- Jackel, C., Kast, P., Hilvert, D. Protein design by directed evolution. Annual review of biophysics. 37, 153-173 (2008).
- Liu, L., Li, Y., Liotta, D., Lutz, S. Directed evolution of an orthogonal nucleoside analog kinase via fluorescence-activated cell sorting. Nucleic acids research. 37, 4472-4481 (2009).
- Fischetti, V. A. Bacteriophage lysins as effective antibacterials. Curr. Opin. Microbiol. 11, 393-400 (2008).
- Fischetti, V. A., Nelson, D., Schuch, R. Reinventing phage therapy: are the parts greater than the sum. Nat. Biotechnol. 24, 1508-1511 (2006).
- Loessner, M. J. Bacteriophage endolysins--current state of research and applications. Curr. Opin. Microbiol. 8, 480-487 (2005).
- Nelson, D., Schuch, R., Chahales, P., Zhu, S., Fischetti, V. A. PlyC: A multimeric bacteriophage lysin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 10765-10770 (2006).
- Nelson, D., Loomis, L., Fischetti, V. A. Prevention and elimination of upper respiratory colonization of mice by group A streptococci using a bacteriophage lytic enzyme. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 4107-4112 (2001).
- Filatova, L. Y., Becker, S. C., Donovan, D. M., Gladilin, A. K., Klyachko, N. L. LysK, the enzyme lysing Staphylococcus aureus cells: specific kinetic features and approaches towards stabilization. Biochimie. 92, 507-513 (2010).
- Varea, J., et al. Structural and thermodynamic characterization of Pal, a phage natural chimeric lysin active against pneumococci. J. Biol. Chem. 279, 43697-43707 (2004).
- Sanz, J. M., Garcia, J. L., Laynez, J., Usobiaga, P., Menendez, M. Thermal stability and cooperative domains of CPL1 lysozyme and its NH2- and COOH-terminal modules. Dependence on choline binding. J. Biol. Chem. 268, 6125-6130 (1993).
- Anderson, G., Scott, M. Determination of product shelf life and activation energy for five drugs of abuse. Clin. Chem. 37, 398-402 (1991).
- Kim, G. J., Cheon, Y. H., Kim, H. S. Directed evolution of a novel N-carbamylase/D-hydantoinase fusion enzyme for functional expression with enhanced stability. Biotechnol. Bioeng. 68, 211-217 (2000).
- Koutsioulis, D., et al. Directed evolution on the cold adapted properties of TAB5 alkaline phosphatase. Protein Eng. Des. Sel. 21, 319-327 (2008).
- McCarthy, J. K., Uzelac, A., Davis, D. F., Eveleigh, D. E. Improved catalytic efficiency and active site modification of 1,4-beta-D-glucan glucohydrolase A from Thermotoga neapolitana by directed evolution. J. Biol. Chem. 279, 11495-11502 (2004).
- Ren, C., Chen, T., Zhang, J., Liang, L., Lin, Z. An evolved xylose transporter from Zymomonas mobilis enhances sugar transport in Escherichia coli. Microbial cell factories. 8, 66 (2009).
- Tsuzuki, K. Thermostable mutants of the photoprotein aequorin obtained by in vitro evolution. J. Biol. Chem. 280, 34324-34331 (2005).
- Eijsink, V. G., Gaseidnes, S., Borchert, T. V., vanden Burg, B. Directed evolution of enzyme stability. Biomolecular engineering. 22, 21-30 (2005).
- Kumar, S., Nussinov, R. How do thermophilic proteins deal with heat. Cell. Mol. Life Sci. 58, 1216-1233 (2001).
- Hibbert, E. G., Dalby, P. A. Directed evolution strategies for improved enzymatic performance. Microb. Cell Fact. 4, 1475-2859 (2005).
- Rasila, T. S., Pajunen, M. I., Savilahti, H. Critical evaluation of random mutagenesis by error-prone polymerase chain reaction protocols, Escherichia coli mutator strain, and hydroxylamine treatment. Anal. Biochem. 388, 71-80 (2009).
- Wong, T. S., Roccatano, D., Zacharias, M., Schwaneberg, U. A statistical analysis of random mutagenesis methods used for directed protein evolution. J. Mol. Biol. 355, 858-871 (2006).
- Arnold, F. H., Wintrode, P. L., Miyazaki, K., Gershenson, A. How enzymes adapt: lessons from directed evolution. Trends in biochemical sciences. 26, 100-106 (2001).
