Humane Neuroendokrine tumorcellelinier som en tredimensional model for studiet af den menneskelige Neuroendokrine Tumor Therapy

Summary

Vi præsenterer en simpel agarose overlay platform at vokse 3D flercellede kugler med neuroendokrine cancercellelinjer. Denne fremgangsmåde tilvejebringer en meget bekvem måde at undersøge virkningen af ​​terapeutiske lægemidler på neuroendokrine tumorceller. Det kunne også hjælpe os med at etablere menneskelige neuroendokrine tumorer sfæroiderne for kræftbehandling.

Abstract

Neuroendokrine tumorer (NET) er sjældne tumorer, med en forekomst af to pr 100, 000 personer om året, og de ​​tegner sig for 0,5% af alle humane maligne sygdomme. ¹ Andet end kirurgi for det mindretal af patienter, der præsenterer med lokaliseret sygdom, der er ringe eller ingen overlevelse af systemisk behandling. Derfor er der et stort behov for bedre at forstå biologi dybden, og især definerer nye terapeutiske mål for patienter med resektabel eller metastaserende neuroendokrine tumorer. 3D cellekultur er ved at blive en populær metode til drug screening på grund af dens relevans i modellering af in vivo tumorvæv organisation og mikromiljø. ^2,3 3D flercellede Sfæroiderne kunne give værdifulde oplysninger i en mere rettidig og billigere måde end direkte kommer fra 2D cellekultur eksperimenter med dyr (mus) modeller.

For at lette opdagelsen af ​​nye terapeutiske midler til NET patients, har vi udviklet en in vitro 3D flercellet sfæroiderne model ved hjælp af de menneskelige NET-cellelinjer. De NET celler udplades i et ikke-klæbende agarose-overtrukne 24-brønds plade og inkuberet under fysiologiske betingelser _(5% CO2, 37 ° C) med en meget langsom omrøring i 16-24 timer efter udpladning. Cellerne danner flercellede sphæroider starter den 3 ^RD eller 4 ^th dag. Sfæroiderne mere sfærisk af ^6. dag, på hvilket tidspunkt lægemiddelbehandlinger initieres. Effektiviteten af ​​de lægemiddelbehandlinger på NET sfæroiderne overvåges baseret på morfologi, formen og størrelsen af ​​sfæroider med en fase-kontrast lysmikroskop. Størrelsen af ​​sfæroider estimeres automatisk ved hjælp af en kundeudviklet MATLAB program baseret på en aktiv konturalgoritme. Yderligere har vi viser en enkel metode til at behandle HistoGel indlejringen af ​​disse 3D sfæroider, hvilket tillader anvendelse af standard histologisk og immunohistokemisk teknik.

Protocol

1. Fremstilling af 1% agarose-overtrukne 24-brønds plade

1. Tilsættes 1 g agarose (RPI, A20090-500) til 100 ml deioniseret vand i en 250-500 ml flaske og autoklaveres for at sterilisere agarose (121 ° C, 15 psi, 15 min i en autoklav maskine). Overføre flasken med steriliseret agarose i et 70 ° C vandbad. Agarosen er klar til at blive hældt når den er afkølet til 70 ° C, hvilket tager en time. Sørg for at holde agarose sterile på alle tidspunkter.
2. Opnå 24-brønds fladbundede plader (Falcon, 353.047), alle former for 24-brønds fladbundede plader ville fungere, hvis pladerne kan afbildes under et fase-kontrast mikroskop.
3. Dispensér 200 ul agarose til hver brønd med en Eppendorf repeater pipette i et biosikkerhed kabinet og slyng agarosen omkring brønden for at gøre det dækker godt jævnt. 200 ul af agarose er egnet til dannelse af en konkav overflade, således at sfæroider kan danne ensartede sfæriske former. Mindre end 200 ul agarose kan ikkeomfatter også helt, men mere end 200 ul agarose kan ikke danne den konkave overflade og sfæroider dyrket på det kan ikke danne sfæriske former.
4. De agarose-overtrukne 24-brønds plader er klar til anvendelse i omkring 10 min. (Valgfrit) Tilføj 100 ul medium til ækvilibrere agarose med dyrkningsmediet før såning celler.
5. Alternativt, efter agarose fuldt størknet, tilsættes 100 pi vækstmedium til hver brønd og forsegle pladerne med sterile tætningsbånd (Nunc, 236.366). Disse plader kan lagres ved 4 ° C i op til én uge.

2. Fremstillinq af enkelte cellesuspensioner

1. Alle forsøg udføres under anvendelse af aseptiske standardteknikker i en biosikkerhed kabinet og alle kulturer dyrkes i en 37 ° C befugtet inkubator med 5% _CO2 i luft, medmindre andet er angivet.
2. Human pancreas NET Bon-1-celler opretholdes i DMEM/F12 (Invitrogen, 10.565) med 10% føtalt bovint serum (FBS, Invitrogen,16000-044) medium i en 100 mm x 20 mm sterile vævsdyrkningsskål (Corning, 430.167).
3. Når monolag Bon-1-celler nå 70-80% konfluens, er mediet fjernet. Cellerne vasket med PBS to gange og fjernes fra skålen ved tilsætning af 1 ml TrypLE (Invitrogen, 12604) med 5 minutters inkubation ved 37 ° C. TrypLE ligner trypsin, men er stabil ved 15 - 30 ° C såvel som ved 4 ° C. Kontroller under mikroskop for at sikre, at alle celler er adskilt fra fadet.
4. Tilsættes 9 ml vækstmedium til de trypsiniserede celler og anvende en pipette til at pipettere cellerne op og ned nogle få gange for at sikre en jævn enkelt cellesuspension.
5. Anvender 70 um cellefilter (Fisher, 22.363.548) at filtrere cellerne.
6. Indsamle celler og udføre en celletælling under anvendelse Guava PCA-96 Base System (Millipore).
7. Fremstilling af en suspension af 5.000 celler pr ml i phenol-fri DMEM/F12 med 10% FBS-vækstmedium.

3. Klumpformet Kultur

1. Overlay 200 ul af det indrecellesuspensioner til agarose-overtrukne 24-brønds plade og forsegl 24-brønds plader med sterile forseglingstapen at forhindre fordampning.

Bemærk: - Antallet af celler, der skal pletteres, bør bestemmes empirisk baseret på størrelsen af ​​sfæroiderne på dag 6, 300-400 um diameter sfæroider ville være ideelle størrelse til at starte lægemiddelbehandling, 1000 Bon-1 og H727 celler udplades.

- Vi anbefaler ikke at starte medicinsk behandling efter dag 6, fordi levedygtigheden af ​​3D-cellerne begynder at falde omkring dag 10 (data ikke vist, manuskript under udarbejdelse).

2. Anbring de ovennævnte agarose-overtrukne 24-brønds plader med Bon-1-celler på en orbitalryster ved en meget langsom omrøring på mindre end 40 rpm natten over i en 37 ° C befugtet inkubator med 5% _CO2 i luft. Så flytter disse plader til en stabil platform til at holde de kulturer vokser.
3. Tilsæt 200 pi vækstmedium til hver brønd af ovennævnte plades hver 3. dag. Må ikke forstyrrer sfæroiderne. Forsøger at tilføje medium gennem væggen af ​​hver brønd ved berøring pipettespidsen til siden af ​​brønden og lade mediet strømmer ned i brønden.
4. Overvåge den sphæroide dannelse i 24-brønds plader under et mikroskop.

4. Drug Behandling

1. Når sfæroiderne nå op på omkring 300-400 um i diameter på dag 6, er 3D sfæroiderne behandles med medicin. Dette betegnes som dag 0 for medicinsk behandling.
2. På dag 6, indeholder hver brønd i pladen omkring 400 pi medium. For at sikre sig lægemiddelbehandlinger er i 1x slutkoncentration i hver brønd, 3x serielle fortyndinger af hver dosis af behandlinger er fremstillet af lægemidlet stamopløsning i 5 ml vækstmedium i et 15 ml konisk rør, der er tilstrækkelig til 8 gentagelser.
3. Sfæroiderne ved hver række i 24-brønds plade kategoriseres som vehikel, dosis 1, 2, 3, 4 og 5. Der er fire gentagelser for hver dosis af behandlinger på en 24-brønds plade (se
4. Vågeblus 24-brønds plade ved 800 rpm i 5 minutter ved 4 ° C for at sikre, at alle kondensationer på forseglingstapen gå ind i brønden. På grund af den flydende træk 3D sfæroider, mediet i hver brønd ikke fjernes for at undgå forstyrrelse af sfæroiderne.
5. Forsigtigt tilsættes 200 pi af de ovenfor fremstillede behandlinger af hver dosis i de behørige brønde langs væggen af ​​hver brønd.
6. Forsegle 24-brønds plader med forseglingstape og inkuber kulturerne i 37 ° C befugtet inkubator med 5% _CO2 i luft.
7. Om nødvendigt trække sfæroiderne ved hver brønd med den respektive dosis behandlinger efter 72-96 timer.

5. Monitor 3D klumpformet Cultures

1. Ved hvert valgt tidspunkt efter lægemiddelbehandlinger (0, 24, 48, 72 hr), sfæroider de ved hver brønd tHan 24-brønds plade er afbildet med et Zeiss Axiovert 200/M-based fasekontrastmikroskop med en 5x mål.

Bemærk: Billeder kan tages på alle lysmikroskop med en kalibreret skalering mellem um og pixel. Et 5x mål er ideel, fordi de sfæroiderne hurtigt vokser den billeddannende felt med et 10x objektiv.

2. Klumpformet analyse kan udføres manuelt ved hjælp af Zeiss AxioVision 4.8.2 software med de rå billeder.
3. Alternativt fremstilles en kundeudviklet MATLAB program anvendt til at estimere størrelsen af ​​sfæroider automatisk / semi-automatisk. Den automatisk program implementerer aktiv konturalgoritme ⁴ til nøjagtigt lokalisere konturen af den sphæroide i en given billede og måle dens store (L) og mindre (W) akser automatisk. En semi-automatisk version af den samme algoritme tillader brugere at medvirke til at initiere programmet, når stærke genstand er til stede. Alle billeder skal eksporteres som TIFF eller JPEG-filformater frade rå billeder, der skal læses af programmet. Volumenet af den sphæroide anslås 0,5 x L x ^W2.

6. HistoGel-indlejring af NET 3D Sfæroider

1. 10-24 sfæroider opsamles fra 24-brønds plader, vasket i PBS to gange, fikseret i 10% formalin i 2 timer, vasket i 50% og 70% ethanol i 15 minutter to gange, henholdsvis, og er klar til HistoGel indlejring. Alternativt kan de opbevares i 70% ethanol ved 4 ° C i adskillige måneder.
2. En tube kold HistoGel (Thermo Scientific, HG-4000-012) er sat i et bæger fyldt med vand. Bægerglasset opvarmes i en mikrobølgeovn i 1 minut eller indtil gelen er fuldstændig flydende, derefter holdt i det samme vandfyldte bægerglas på alle tidspunkter.
3. Sfæroiderne i 70% ethanol ovenfra overføres til en biopsi cryomold (Tissue-Tek, Sakura Finetek, 4565) under anvendelse af en tandstikker. Sørg for, at alle kugler er overført. Lad sfæroider sidde i et minut for at synke ned til bunden af ​​biopsy cryomold. Forsøge at slippe af væskerne i biopsi cryomold med Kimwipes og i mellemtiden, meget forsigtigt skubbe sfæroider til center på bunden af ​​biopsi cryomold hjælp af engangs plastik Pasteur-pipette. Dette trin kan være lettere at ske under et dissektionsmikroskop.
4. Et tyndt lag af opvarmet HistoGel tilsættes til biopsi cryomold at stabilisere sfæroider ved bunden af ​​biopsi cryomold, mellemtiden er tandstikker anvendes til at holde sfæroiderne i midten ved bunden af ​​biopsi cryomold meget forsigtigt. Ikke tilsættes for meget HistoGel men lige nok til at stabilisere sfæroider ved bunden af ​​biopsi cryomold.
5. Lad sfæroider / HistoGel sidde i 1-2 minutter ved stuetemperatur, eller indtil HistoGel er størknet. Derefter fyldes den øvrige del af biopsi cryomold med opvarmet HistoGel.
6. Lade det størkne ved stuetemperatur i omkring 10 minutter.
7. Lige før popping ud sfæroiderne / HistoGel blok fra biopsi cryomold, Leave den ved 4 ° C i 1 minut, hvilket hjælper affyret de intakte sfæroiderne / HistoGel blok. Sfæroiderne / HistoGel blok derefter pakket ind i et stykke Bio-omviklinger (Surgipath, 01.090) og anbragt i et væv og biopsi kassette (Fisher Scientific, 15-182-701D). Vævet og biopsi kassette er lagret i en beholder med 70% ethanol. Så rutinemæssige vævsbehandling procedurer for paraffin indstøbning følges. ⁵
8. Paraffin blok kan være opdelt i tre-um tykt lag objektglas. Objektglassene kan farves med hæmatoxylin og eosin for at bestemme histologiske ændringer og kan også anvendes til immunohistokemisk farvning.

7. Repræsentative resultater

Menneskelig bugspytkirtlen neuroendokrine tumorcellelinjer BON-1 (forudsat at Verto Institute af Kjell Oberg, Uppsala Universitet, Sverige), QGP-1 (japansk Health Sciences Foundation, Osaka, Japan), og human lunge neuroendokrine tumor cellelinje H727 (ATCC) var dyrkes på et agarose-coatede 24-brønds plade. Som det ses i figur 1, af de tre cellelinjer udviser forskellig morfologi. Bon-1 og H727-celler dannede 3D sfæroider. Under mikroskop viste H727 celler strammere og mere kompakt sfæroider end Bon-1-celler. Vi den hypotese, at H727-celler har en forøget kapacitet for celle-celle-adhæsion og danner strammere junctions som resultat. QGP-1 celler viser store drue-lignende porøse masser, der ikke betragtes som kugler. På grund af den stigende interesse for pancreatisk neuroendokrin tumor forskning i de senere år er Bon-1-celler anvendt til resten af ​​figurerne. Efter podning Bon-1-celler på agarose-overtrukne 24-brønds plade, typisk multicellulær sfæroider dannelse sker ved ^3. eller ^4. dag og sfæroider er blevet rundere af ^6. dag. På grund af næringsstof og oxygen-begrænsning, celler i tæt kerne af sfæroiderne begynder at dø omkring dag 10 og dag 17, sfæroiderne begynder at desintegrere grund af den store størrelse eller i detME tilfælde udstødning af den nekrotiske kernen. De kugler typisk kan vokse op til 1.000 um i diameter. Figur 2 viser dele af formationen, vækst og opløsning af Bon-1-3D-kugler.

Drug behandlinger blev startet, da kugler var omkring 300-400 um og celler bevares høj levedygtighed (manuskript under udarbejdelse). Dag 6 3D kugler blev valgt som startpunkt for medicinsk behandling. Det er blevet rapporteret, at histon deacetylase-hæmmere viste antiproliferative og proapoptotiske virkninger på NET cellerne. ⁶ Vi valgte histon-deacetylase-hæmmere Trichostatin A (TSA) som et eksempel for at illustrere virkningen af lægemiddelbehandlinger på 3D NET sfæroider. Figur 3A viser morfologien af 3D sfæroider upon behandling af TSA. Figur 3B viser mængden af 3D sfæroider upon TSA (Sigma, T8552) behandling. Størrelsen af ​​hver enkelt sfærisk blev estimeret automatisk ved en kundeTom-udviklede MATLAB edb-program. ⁴ En manuel tegning skridt blev sat til at hjælpe erhverve de sfæroiderne, som var tæt på kanten i en given billede. Mindst 8 sfæroider blev målt pr dosis TSA behandlinger på hvert tidspunkt. Volumenet af hver 3D sfæroid blev beregnet som 0,5 x længde x bredde ^2. Som det ses i figur 3A og 3B, i forhold til køretøjet, alle doser af TSA vist i figurerne viste nogen grad af vækstinhibering af Bon-1-3D sfæroider. Blandt disse, kraftigt koncentrationerne af 125 nM og 250 nM i TSA undertrykt vækst af 3D sfæroider og førte til celledød ved 96-timers tidspunktet.

At forstå histologi af NET 3D sfæroider, en H & E og immunohistokemisk (IHC) farvning blev udført på 3D sfæroider, som var blevet dyrket i 17 dage. Figur 4A illustrerer en fremgangsmåde til at behandle 3D sfæroider til HistoGel indlejring, som er nøglen skridt for paraffin indlejring af 3D spher oider Figur 4B viser H & E-farvning er immunohistokemisk farvning af den spaltede caspase-3 (en markør for apoptotiske celler) og Ki-67 (en markør for prolifererende celler) antistoffer på 3D sfæroider, som var blevet dyrket i 17 dage . Cellerne i kernen af ​​de 3D sfæroider meste nekrotisk / apoptotiske og det ydre lag celler aktivt prolifererende.

Figur 1. Morfologien af NET 3D sfæroider. 3D sfæroider fra tre humane neuroendokrine tumorcellelinier er dannet på agarose-coatede 24-brønds plader. 1.000 Bon-1, H727 og QGP-1-celler blev podet på agarose-overtrukne 24-brønds plader og dyrket i en normal fysiologisk tilstand, som beskrevet i protokollen. Disse er billeder af 3D sfæroider til Bon-1 og H727 eller celleaggregater til QGP-1, som blev dyrket i 10 dage.

18/4218fig2.jpg "alt =" Figur 2 "/>
Figur 2. Vækst-Tracking af Bon-1 3D Sfæroider Væksten sporing af Bon-1 3D sphæroider:. Dannelse, vækst og opløsning af 3D-kugler. Som beskrevet i protokollen, er 1.000 BON-1-cellerne udpladet på en agarose-belagt 24-brønds plade. Cellerne dyrkes i en standard DMEM/F12 medium med 10% FBS i en orbitalryster i en fysiologisk tilstand natten over, derefter flyttet til en stabil platform, og dyrket i samme tilstand. Væksten sporing af 3D-celler blev fulgt af billedbehandlingsprogrammer celler hver time i de første 5 timer efter plating, og derefter hver 1-3 dage med et Zeiss Axiovert 200/M-based fasekontrast-mikroskop med en 5x mål. Cellerne aggregere til masserne først, derefter danne multicellulære aggregater, små sfæroider, større sfæroider, og i sidste ende sfæroiderne desintegrerer.

Figur 3. TSA behandling på BON-13D Sfæroider. (A) Billeder af 3D-kugler upon TSA behandling. Behandling gruppe: V - Vehicle (0,0025% DMSO), D1-dosis 1 (15,625 nM TSA), D2-dosis 2 (31,25 nM TSA), D3: dosis 3 (62,5 nM TSA), D4: dosis 4 (125 nM TSA ) D5: dosis 5 (250 nM TSA). Behandlingstiden: 0 H - tidspunkt, der behandlinger begyndte på dag 6 3D sfæroider; 24 timer, 48 timer og 72 timer og 96 timer er de tidspunkter efter behandlingerne begyndte. 3D sfæroider blev afbildet på hvert tidspunkt som før. (B) Vækst af 3D sfæroiderne upon TSA behandling. De store (L) og mindre (W) akser 3D sfæroider i (A) blev estimeret automatisk af Matlab program på hvert tidspunkt for behandling (0, 24, 48, 72 og 96 timer). Volumenet af 3D sfæroider blev beregnet som 0,5 x L x ^W2. Volumenet af den sphæroide i grafen, var gennemsnittet af otte gentagelser og fejlen bar blev beregnet base på 8 gentagelser.

Tabel 1.Opstillingen af ​​lægemiddelbehandlinger på en 24-brønds plade.

Figur 4A. Illustration af en metode til Proces 3D Sfæroider for HistoGel Embedding. En metode til at behandle 3D-kugler for HistoGel indlejring og immunhistokemisk farvning af 3D sfæroiderne (A) En oversigt over en metode til at behandle 3D-kugler for HistoGel indlejring. 3D-kugler blev indkapslet i en HistoGel at være på samme niveau i biopsi cryomold, så HistoGel / kugler blok blev svøbt i en blå Bio-wraps og overføres til en gul biopsi kassette for paraffin indlejring.

Figur 4B. H & E-farvning og immunohistokemisk farvning af dag 17 3D sfæroider. (B) H & E-farvning, Immunhistokemisk farvning af Ki-67 og spaltes Caspase-3 af de 17 dages 3D sfæroider. Denparaffin-indlejrede snit objektglas blev afparaffiniseret og antigen genfinding blev udført under anvendelse CCI (Cell Conditioning opløsning, Verana Medical System, # 711-065-152). Kanin-polyklonalt Ki-67-antistof (Abcam. # Ab833) og spaltes caspase-3 antistof (cellesignalering Technology, # 9661) blev anvendt ved en koncentration på 1:75 og 1:200, henholdsvis i 1 time ved stuetemperatur. Anti-kanin-sekundært antistof (Jackson Immunolab, # 711-065-152) blev påført i 1:500 i 1 time ved stuetemperatur, efterfulgt af kromogene påvisningskit DABMap (Ventana Medical Systems, # 760-124). Objektglas blev modfarvet med hæmatoxylin og dehydreret og ryddet inden dækglas fra Xylen.

Discussion

Vi har påvist en enkel, pålidelig og reproducerbar metode til dannelse af 3D multicellulær sfæroid fra humane neuroendokrine tumorceller under anvendelse agarose-overtrukne 24-brønds plader. Succes af denne teknik er evnen til at opnå en enkelt sfæroid med homogen størrelse og ensartet form ved dag 6 ud fra et fast antal celler. Den centrale trin er langsom omrøring af pladen med NET celler til det første 16-24 timer efter udpladning. Denne fremgangsmåde kan også anvendes til almindelig human brystcancer-cellelinie MCF-7, humant colon-adenocarcinom-cellelinie HT-29, human ikke-småcellet lungecarcinom-cellelinje H1299 og human embryonisk nyrecellelinie HEK-293. De kan alle danne ensartede og kompakt 3D sphæroider til terapeutisk lægemiddel skærm (data ikke vist). Selv om adskillige fremgangsmåder er angivet på generering 3D sfæroider, ^7-10 fremgangsmåden beskrevet her, ikke kræver specialiserede plader eller reagenser, og er således simpel og omkostningseffektiv. Vores upublicerede data demonstrate, NET 3D sfæroider dyrket på agarose efterligne in vivo NET xenotransplantat tumor geometrisk og molekylært, når der sammenlignes med monolag 2D celler. Dette svarer til, hvad der er rapporteret for 3D sfæroiderne fremstillet på andre humane cancercellelinier. ^11,12 Begrænsningen af 3D cellekultur er, at den ikke helt kan erstatte afprøvning in vivo virkningen af eventuelle lægemidler eller terapeutiske behandlinger, da 3D sfæroider er som avaskulære tumorer, der er forskellig fra den in vivo tumor i dette aspekt. Ikke desto mindre vil denne metode hjælpe med at bygge bro og vurderinger af NET terapeutiske lægemidler fra in vitro til in vivo i visse henseender.

Immunfluorescensfarvning af multicellulære sfæroider er meget vanskelig at udføre på grund af den store størrelse og geometrien af ​​de flydende 3D sfæroider og begrænsning af det konfokale mikroskop. Her viser vi en metode til at behandle HistoGel indlejring i paraffinindlejring, tillader immunhistokemisk farvning af de serielle sektionsopdelte lysbilleder af 3D sfæroiderne. Udover vores kundeudviklet MATLAB program hjælper nøjagtigt og reproducerbart vurdere størrelsen af ​​sfæroiderne, overvåge lægemiddeleffektivitet effektivt, og kunne indarbejdes i en high-throughput skærmen i udviklingen af ​​lægemidler til NETTO patienter.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12 Media	Gibco	10565-018
TrypLE	Gibco	12604
24-well plates	Falcon	353047
70 mM cell strainer	Fisher Scientific	22363548
Sterile sealing tape	Nunc	236366
Trichostatin A	Sigma	T8552
Orbital Shaker	Fisher Scientific	11-402-12