Summary
Se presenta una sencilla plataforma de agarosa superposición de crecer en 3D esferoides multicelulares que utilizan líneas celulares de cáncer neuroendocrino. Este método proporciona una forma muy conveniente para examinar el efecto de fármacos terapéuticos en las células tumorales neuroendocrinas. También podría ayudar a establecer humanos esferoides tumor neuroendocrino de la terapia del cáncer.
Abstract
Los tumores neuroendocrinos (TNE) son tumores poco frecuentes, con una incidencia de dos por cada 100, 000 individuos por año, y representan el 0,5% de todos los cánceres humanos. 1 Con excepción de la cirugía para la minoría de los pacientes que presentan enfermedad localizada, ¿hay la supervivencia de poco o ningún beneficio de la terapia sistémica. Por lo tanto, existe una gran necesidad de entender mejor la biología de los TNE, y en particular definir nuevos objetivos terapéuticos para pacientes con tumores neuroendocrinos resecables o metastásico. Cultivo de células en 3D se está convirtiendo en un método popular para la detección de drogas debido a su importancia en el modelado de la organización en el tejido del tumor in vivo y el microambiente. 2,3 Los esferoides multicelulares 3D podría proporcionar información valiosa de una manera más oportuna y menos costosa que la de proceder directamente de 2D experimentos con cultivos de células de los animales (ratón) modelos.
Para facilitar el descubrimiento de nuevas terapias para NET patients, hemos desarrollado un modelo in vitro 3D esferoides multicelulares utilizando las líneas de células humanas NET. Las células se sembraron NET en un no-adhesivo de agarosa recubierta 24-pocillos y se incubaron bajo condiciones fisiológicas (5% de CO 2, 37 ° C) con una agitación muy lenta durante 16-24 horas después de placas. Las células forman esferoides multicelulares de partida en el día 3 de o 4. Los esferoides se vuelven más esférica por el día 6 ª, en cuyo punto los tratamientos farmacológicos se inician. La eficacia de los tratamientos farmacológicos sobre los esferoides NET se controla sobre la base de la morfología, la forma y tamaño de los esferoides con un microscopio óptico de contraste de fase. El tamaño de los esferoides se calcula automáticamente utilizando un programa personalizado desarrollado MATLAB basa en un algoritmo de contorno activo. Además, se demuestra un método simple para procesar la incorporación de estos esferoides HistoGel 3D, permitiendo el uso de las técnicas histológicas e inmunohistoquímicas.
Protocol
1. Preparación de agarosa recubierto con 1% 24-así placa
- Añadir 1 g de agarosa (RPI, A20090-500) a 100 ml de agua desionizada en una botella ml 250-500 y autoclave para esterilizar la agarosa (121 ° C, 15 psi, 15 min en una máquina autoclave). Transferir la botella con esterilizado agarosa en un baño de 70 ° C el agua. La agarosa está listo para ser vertido cuando se enfría a 70 ° C, que dura aproximadamente una hora. Asegúrese de mantener la estéril de agarosa en todo momento.
- Obtener los 24-pocillos de fondo plano (Falcon placas, 353 047); cualquier tipo de 24 pocillos de fondo plano placas funcionaría si las placas se pueden obtener imágenes con un microscopio de contraste de fase.
- Dispensación 200 l de agarosa a cada pocillo con una pipeta Eppendorf repetidor en una cabina de bioseguridad y agitar la agarosa alrededor del pozo para que sea cubrir el pozo de manera uniforme. 200 l de agarosa es apropiado para formar una superficie cóncava de modo que esferoides pueden formar las formas esféricas consistentes. A menos de 200 l de agarosa no puedecubrir el pozo por completo, pero más de 200 l de agarosa no puede formar la superficie cóncava y los esferoides cultivadas en que no pueden formar formas esféricas.
- Los agarosa recubiertos con placas de 24 pocillos están listos para ser utilizados en aproximadamente 10 min. (Opcional) Añadir 100 l de medio para equilibrar la agarosa con medio de cultivo antes de la siembra de las células.
- Alternativamente, después de la agarosa está completamente solidificada, añadir 100 l medio de crecimiento a cada pocillo y sellar las placas con la cinta de sellado estéril (Nunc, 236 366). Estas placas pueden ser almacenadas a 4 ° C durante hasta una semana.
2. Preparación de suspensiones de células individuales
- Todos los experimentos se llevan a cabo utilizando las técnicas asépticas estándar en una cabina de bioseguridad y todos los cultivos se cultiva en un 37 ° C incubadora humidificada con 5% de CO 2 en el aire, salvo que se especifique.
- Pancreáticos humanos NET BON-1 en las células se mantienen en DMEM/F12 (Invitrogen, 10565) con 10% de suero fetal bovino (SFB, Invitrogen,16000-044) en un medio de 100 mm x 20 mm plato de cultivo de tejidos estéril (Corning, 430 167).
- Cuando monocapa BON-1 en las células alcanzan 70-80% de confluencia, el medio se retira. Las células se lavan dos veces con PBS, y desalojado del plato mediante la adición de 1 ml TrypLE (Invitrogen, 12604) con 5 minutos de incubación a 37 ° C. TrypLE es similar a la tripsina, pero es estable a 15 a 30 ° C, así como a 4 ° C. Compruebe bajo el microscopio para asegurarse de que todas las células se separan del plato.
- Agregar 9 ml de medio de crecimiento a las células con tripsina y utilizar una pipeta para pipetear las células arriba y hacia abajo varias veces para asegurar una suspensión de células, incluso solo.
- El uso de 70 m de células colador (Fisher, 22363548) para filtrar las células.
- Recoger las células y realizar un recuento de células utilizando Guayaba PCA-96 sistema base (Millipore).
- Preparar una suspensión de 5.000 células por ml en fenol libre de DMEM/F12 con medio de crecimiento 10% de FBS.
3. Cultura Esferoide
- Superposición de 200 l de la únicasuspensiones de células a la agarosa recubierta 24-así placa y sellar las placas de 24 pocillos con la cinta de sellado estéril para evitar la evaporación.
Nota: - El número de células que se chapados se debe determinar empíricamente basándose en el tamaño de los esferoides en día 6; 300-400 m de diámetro de los esferoides sería el tamaño ideal para iniciar el tratamiento farmacológico; 1.000 BON-1 y H727 células se cultivan en placas.
- No se recomienda iniciar tratamiento con medicamentos después de 6 días debido a que la viabilidad de las células en 3D comienza a disminuir alrededor del día 10 (datos no mostrados, manuscrito en preparación).
- Colocar por encima de los de agarosa recubiertas de placas de 24 pocillos con Bon-1 en las células en un agitador orbital a una agitación muy lenta de menos de 40 rpm noche a la mañana en un 37 ° C humidificado incubadora con 5% de CO 2 en el aire. A continuación, se mueven estas placas en una plataforma estable para mantener los cultivos en crecimiento.
- Añadir 200 l medio de crecimiento a cada pocillo de la placa superiors cada 3 días. No moleste a los esferoides. Trata de añadir medio a través de la pared de cada pocillo tocando la punta de la pipeta hacia el lado del pozo y dejar que el flujo medio hacia abajo en el pozo.
- Vigilar la formación esferoide en las placas de 24 pocillos con un microscopio.
4. Tratamiento de Drogas
- Cuando los esferoides llegar a alrededor de 300-400 micras de diámetro en el día 6, los esferoides en 3D se tratan con medicamentos. Esto se denota como 0 día para el tratamiento de drogas.
- Al día 6, cada pocillo de la placa contiene alrededor de 400 l de medio. Para asegurarse de que los tratamientos farmacológicos son a una concentración de 1x final en cada uno de diluciones así, 3x de serie de cada dosis de los tratamientos se hacen de la acción de drogas en 5 ml de medio de cultivo en un tubo cónico de 15 ml, lo cual es suficiente para 8 repeticiones.
- Los esferoides en cada fila de la placa 24-así se clasifican como vehículo, dosis de 1, 2, 3, 4 y 5. Hay 4 repeticiones para cada dosis de los tratamientos sobre una placa de 24 pocillos (véase
- Girar hacia abajo la placa de 24 pocillos a 800 rpm durante 5 min a 4 ° C para asegurarse de que todas las condensaciones sobre la cinta de sellado entrar en el pozo. Debido a la característica de flotación de los esferoides 3D, el medio en cada pocillo no se eliminan para evitar la perturbación de los esferoides.
- Añadir cuidadosamente 200 l de los tratamientos por encima de fabricación de cada dosis en los pocillos apropiados a lo largo de la pared de cada pocillo.
- Sellar las placas de 24 pocillos con la cinta de sellado e incubar los cultivos en la 37 ° C humidificado incubadora con 5% de CO 2 en el aire.
- Si es necesario, retirarse los esferoides en cada pocillo con la dosis respectiva de tratamientos después de 72-96 horas.
5. Monitor 3D Esferoide Culturas
- En cada punto de tiempo elegido después de los tratamientos con fármacos (0, 24, 48, 72 h), los esferoides en cada pocillo de tque placa de 24 pocillos se visualizan con un Zeiss Axiovert 200/M-based de contraste de fase microscopio utilizando un objetivo de 5x.
Nota: Las imágenes se pueden tomar en cualquier microscopio de luz con una escala calibrada entre micras y píxel. Uno de los objetivos de 5x es ideal porque los esferoides rápidamente superan el campo de la imagen con un objetivo de 10x.
- Análisis de esferoide se puede realizar manualmente utilizando Zeiss AxioVision Software 4.8.2 con las imágenes en bruto.
- Por otra parte, un programa personalizado desarrollado MATLAB se utiliza para estimar el tamaño de los esferoides de forma automática / semiautomática. El programa automático implementa el algoritmo de contorno activo 4 para localizar con precisión el contorno del esferoide en una imagen dada y medir su principal (L) y ejes menores (W) de forma automática. Una versión semi-automática del mismo algoritmo permite a los usuarios para ayudar a iniciar el programa cuando artefacto fuerte está presente. Todas las imágenes deben ser exportados como TIFF o JPEG de archivos delas imágenes en bruto para ser leídos por el programa. El volumen del esferoide se estima como 0,5 x L x W 2.
6. HistoGel-incorporación de los esferoides 3D NET
- 10-24 esferoides se recogen de las placas de 24 pocillos, se lavó dos veces en PBS, se fijaron en formalina al 10% durante 2 horas, se lavó en 50% y 70% de etanol durante 15 minutos dos veces, respectivamente, y están listos para la incrustación HistoGel. Alternativamente, se pueden mantener en el 70% de etanol a 4 ° C durante varios meses.
- Un tubo de frío HistoGel (Thermo Scientific, HG-4000-012) se coloca en un vaso lleno de agua. El vaso de precipitados se calienta en un horno de microondas durante 1 minuto o hasta que el gel está completamente licuado, después se mantuvo en el mismo vaso lleno de agua en todo momento.
- Los esferoides en el 70% de etanol desde arriba se transfieren a una biopsia cryomold (Tissue-Tek, Sakura Finetek, 4565) utilizando un palillo de dientes. Asegúrese de que todos los esferoides se transfieren. Deje que los esferoides reposar durante un minuto a hundirse hasta el fondo de la biopsy cryomold. Trata de deshacerse de los líquidos en el cryomold biopsia con Kimwipes y, mientras tanto, muy suavemente empuja los esferoides en el centro en la parte inferior de la cryomold biopsia utilizando la pipeta de plástico desechable Pasteur. Este paso puede ser más fácil que hacerse bajo un microscopio de disección.
- Una capa delgada de HistoGel calentada se añade a la cryomold biopsia para estabilizar los esferoides en la parte inferior de la cryomold biopsia; mientras tanto, el palillo de dientes se utiliza para mantener los esferoides en el centro en la parte inferior de la biopsia cryomold muy suavemente. No añadir HistoGel demasiado, pero sólo lo suficiente para estabilizar los esferoides en la parte inferior de la cryomold biopsia.
- Que los esferoides o HistoGel reposar durante 1-2 minutos a temperatura ambiente o hasta que el HistoGel se solidifica. Luego llene el resto de la biopsia con el cryomold HistoGel caliente.
- Permitir que se solidifican a temperatura ambiente durante aproximadamente 10 min.
- Justo antes de estallar hacia fuera los esferoides o bloque HistoGel de la cryomold biopsia, leaVe a 4 ° C durante 1 minuto, lo que ayuda a hacer estallar los esferoides intactos o bloque HistoGel. Los esferoides o bloque HistoGel se envuelve en un pedazo de Bio-secreto (Surgipath, 01090) y poner en un pañuelo de papel y el cassette de la biopsia (Fisher Scientific, 15-182-701D). El tejido y el cassette biopsia se almacena en un recipiente con etanol al 70%. A continuación, los procedimientos de rutina de procesamiento de tejidos para inclusión en parafina se siguen. 5
- El bloque de parafina puede ser seccionado en 3-micras diapositivas capa gruesa. Las diapositivas se pueden teñir con hematoxilina y eosina para determinar los cambios histológicos y también puede ser utilizado para la tinción inmunohistoquímica.
7. Los resultados representativos
Neuroendocrinos de páncreas humano líneas de células tumorales BON-1 (siempre que Verto Instituto por Kjell Oberg, la Universidad de Uppsala, Suecia), QGP-1 (Ciencias de la Salud Fundación Japón, Osaka, Japón), y los tumores neuroendocrinos de pulmón humano línea celular H727 (ATCC) fueron crecido en un agarosE-24-revestido así placa. Como se ve en la Figura 1, las tres líneas celulares muestran morfología diferente. Células BON-1 y H727 forma esferoides 3D. Bajo el microscopio, las células H727 mostraron esferoides más estrictas y más compacto que BON-1 en las células. Nuestra hipótesis es que las células H727 tiene una mayor capacidad para la adhesión célula-célula y formar uniones más estrictos como resultado. QGP-1 en las células muestran grandes como uvas masas porosas, que no son considerados como esferoides. Debido al interés creciente de la investigación del tumor pancreático neuroendocrino en los últimos años, ONB-1 en las células se utilizan para el resto de las figuras. Después de la siembra BON-1 en las células en la agarosa con recubrimiento 24-pocillos, la formación de esferoides multicelulares se produce normalmente por el día ª 3 ª o 4 y los esferoides se redondean por el día 6 ª. Debido a la limitación de nutrientes y oxígeno, las células en el núcleo denso de los esferoides comienzan a morir alrededor del día 10 y por día 17, los esferoides comienzan a desintegrarse debido al gran tamaño o en modome casos la expulsión del núcleo necrótico. Los esferoides típicamente puede crecer hasta 1.000 micras de diámetro. Figura 2 muestra las secciones de la formación, el crecimiento y la desintegración de BON-1 esferoides 3D.
Los tratamientos farmacológicos se iniciaron cuando esferoides fueron alrededor de 300 a 400 micras y las células mantiene una alta viabilidad (manuscrito en preparación). Día 6 esferoides 3D fueron elegidos como el punto de inicio de los tratamientos farmacológicos. Se ha reportado que los inhibidores de histona deacetilasa mostraron efectos antiproliferativos y pro-apoptótico de las células NET. 6 Elegimos el inhibidor de la histona deacetilasa--3A Tricostatina A (TSA) como un ejemplo para ilustrar el efecto de los tratamientos farmacológicos en 3D esferoides NET. La figura muestra la morfología de los esferoides 3D sobre el tratamiento de la TSA. Figura 3B muestra el volumen de los esferoides 3D sobre TSA (Sigma, T8552) tratamiento. El tamaño de cada individuo esferoide se calcula automáticamente por un CUStom-desarrolló el programa MATLAB equipo. 4 Un paso de dibujo manual ha sido añadido para ayudar a adquirir los esferoides, que eran cerca de la orilla en una imagen dada. Al menos 8 esferoides se midieron por dosis de tratamientos TSA en cada momento. El volumen de cada esferoide 3D se calcula como el 0,5 Largo x Ancho x 2. Como se ve en la Figura 3A y 3B, en relación al vehículo, todas las dosis de TSA se muestran en las figuras demostrado algún grado de inhibición del crecimiento de BON-1 esferoides 3D. Entre ellos, las concentraciones de 125 nM y 250 nM de TSA fuertemente reprimida el crecimiento de esferoides 3D y condujo a la muerte celular en 96-horas punto de tiempo.
Para comprender la histología de los esferoides 3D NET, un H & E y tinción inmunohistoquímica (IHC) se realizaron en esferoides 3D que habían sido cultivadas durante 17 días. Figura 4 ilustra un método para procesar los esferoides en 3D para la incrustación HistoGel, que es la clave paso para la inclusión en parafina de 3D spher OID. Figura 4B muestra la tinción H & E, la tinción inmunohistoquímica de la exfoliados caspasa-3 (un marcador de apoptosis) y Ki-67 (un marcador de proliferación de las células) anticuerpos en esferoides en 3D, que habían sido cultivadas durante 17 días . Las células dentro del núcleo de los esferoides en 3D son en su mayoría necrosis / apoptosis y las células de la capa exterior se multiplican activamente.
Figura 1. La morfología de la NET Esferoides 3D. Los esferoides 3D a partir de tres líneas humanos neuroendocrinos de células tumorales se forman en agarosa recubiertas de placas de 24 pocillos. 1.000 células BON-1, H727 y QGP 1-fueron sembradas en agarosa recubiertas de placas de 24 pocillos y se cultivaron en condiciones fisiológicas normales, como se detalla en el protocolo. Estas son las imágenes de esferoides en 3D para BON-1 y H727 o célula agregados para QGP-1, que se cultivaron durante 10 días.
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Figura 2. El seguimiento del crecimiento de BON-1 Esferoides 3D El seguimiento del crecimiento de BON-1 esferoides 3D:. Formación, crecimiento y desintegración de esferoides en 3D. Como se detalla en el protocolo, 1.000 BON-1 en las células se sembraron en un gel de agarosa recubierta de 24 pocillos. Las células se cultivan en un medio DMEM/F12 estándar con FBS al 10% en un agitador orbital en una condición fisiológica durante la noche, luego se trasladó en una plataforma estable y crecido en la misma condición. El crecimiento de seguimiento de las células en 3D fueron seguidos por las células de imágenes cada hora durante las primeras 5 horas después de placas, y luego cada 1-3 días con un Zeiss Axiovert 200/M-based de contraste de fase microscopio utilizando un objetivo de 5x. Las células se agregan en masas en primer lugar, a continuación, formar agregados multicelulares, esferoides pequeños, grandes esferoides, y finalmente se desintegran los esferoides.
Figura 3. TSA tratamiento de la ONB-1Esferoides 3D. (A) Imágenes de esferoides en 3D sobre el tratamiento de la TSA. Grupo tratamiento: V - Vehículo (0,0025% de DMSO), D1-dosis de 1 (15.625 nM TSA), D2-dosis de 2 (31.25 nM TSA); D3: 3 dosis (62,5 nM TSA), D4: dosis de 4 (125 nM TSA ); D5: dosis de 5 (250 nM TSA). Duración del tratamiento: 0 H - punto de tiempo que los tratamientos se inició el día 6 esferoides 3D; 24 h, 48 h, 72 ya las 96 horas son los puntos de tiempo después de los tratamientos comenzaron. Esferoides fueron imágenes en 3D en cada momento, como antes. (B) Crecimiento de los esferoides en 3D sobre el tratamiento de la TSA. Los principales (L) y menor (W) ejes de los esferoides 3D en (A) se calcula automáticamente por el programa Matlab en cada punto de tiempo de los tratamientos (0, 24, 48, 72 y 96 h). El volumen de los esferoides 3D se estimó como 0,5 x L x W 2. El volumen del esferoide en el gráfico era la media de 8 repeticiones y la barra de error se calculó sobre la base de 8 repeticiones.
Tabla 1.Disposición de los tratamientos farmacológicos en una placa de 24 pocillos
Figura 4A. Ilustración de un método para procesar Esferoides 3D para incrustar HistoGel. Un método para procesar los esferoides en 3D para la incrustación HistoGel y tinción inmunohistoquímica de los esferoides 3D (A) Una visión general de un método para procesar esferoides 3D para empotrar HistoGel. Esferoides 3D se encapsula en un HistoGel estar en el mismo nivel en el cryomold biopsia, entonces el HistoGel / bloque esferoides se envolvió en un azul de Bio-envolturas y se transfirió a un amarillo casete biopsia para inclusión en parafina.
Figura 4B. H & E y tinción inmunohistoquímica de 17 días-Esferoides 3D. (B) tinción H & E, la tinción inmunohistoquímica de Ki-67 y exfoliados caspasa-3 de los esferoides en 3D de 17 días. El paraffin embebidos en diapositivas se deparaffinized seccionados y la recuperación de antígenos se realizó a través de CCI (Solución Celular Acondicionado, Verana Medical System, # 711-065-152). Policlonal de conejo Ki-67 anticuerpo (Abcam. # Ab833) y se escindió caspasa 3 anticuerpo (Señalización Celular Tecnología, # 9661) se aplicaron a una concentración de 1:75 y 1:200, respectivamente, durante 1 hora a temperatura ambiente. El anticuerpo secundario anti-conejo (Jackson Immunolab, # 711-065-152) se aplicó a 1:500 durante 1 hora a temperatura ambiente, seguido por la detección cromogénica DABMap kit (Ventana Medical Systems, 760-124). Las láminas fueron contrastados con hematoxilina y se deshidrataron y se aclaró antes de cubreobjetos de xileno.
Discussion
Hemos demostrado un método sencillo, fiable y reproducible para formar esferoide 3D multicelular de células tumorales humanas neuroendocrinos utilizando agarosa recubiertos con placas de 24 pocillos. El éxito de esta técnica es la capacidad para obtener un esferoide solo con tamaño homogéneo y forma uniforme por día 6 a partir de un número fijo de células. El paso clave es la agitación lenta de la placa con células NET para la primera 16-24 horas después de placas. Este método puede aplicarse también al común de cáncer de mama humano línea de células MCF-7, el adenocarcinoma de colon humano línea de células HT-29, humana no pequeñas de pulmón de células carcinoma de la línea celular H1299 y de embriones humanos línea celular de riñón HEK-293. Todos ellos pueden formar esferoides en 3D uniformes y compactas para la pantalla de la droga terapéutica (datos no presentados). Aunque varios métodos se reportan en la generación de esferoides 3D, 7-10 el método descrito aquí no requiere placas especializadas o reactivos y por tanto es sencilla y económica. Nuestros datos no publicados demonstrate que NET esferoides 3D cultivadas en agarosa imitar el tumor in vivo en xenoinjertos NET geométricamente y molecularmente, cuando se compara con monocapa de células 2D. Esto es similar a lo que se ha informado de los esferoides 3D hechas a partir de otras líneas celulares de cáncer humano. 11,12 La limitación del modelo de cultivo celular 3D es que no puede sustituir completamente a prueba la eficacia in vivo de los fármacos o tratamientos terapéuticos porque los esferoides 3D son como tumores avasculares, que es diferente de la de tumores in vivo en este aspecto. Sin embargo, este método le ayudará a cerrar la brecha y las evaluaciones de los medicamentos terapéuticos de NET in vitro a in vivo en algunos aspectos.
La tinción de inmunofluorescencia en esferoides multicelulares es muy difícil de realizar debido al gran tamaño y geometría de los esferoides 3D flotantes y la limitación del microscopio confocal. Aquí se ilustra un método para procesar incrustación HistoGel para parafinaincorporación, lo que permite la tinción inmunohistoquímica de las diapositivas de serie de sección de los esferoides en 3D. Además, nuestra costumbre desarrollada programa MATLAB ayuda precisa y reproducible estimar el tamaño de los esferoides, vigilar la eficacia de los medicamentos de manera eficiente, y podría ser incorporado en una pantalla de alto rendimiento en el desarrollo de fármacos para los pacientes NET.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Agradecemos sinceramente a la Dra. Chen Wenjin por su ayuda con el programa de MATLAB y el Instituto del Cáncer de Nueva Jersey instalación histopatología y microscopía de las instalaciones. También agradecemos a los revisores por sus comentarios y sugerencias. Este estudio se apoya en el Raymond y Beverly Sackler Fundación para la Investigación.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 Media | Gibco | 10565-018 | |
| TrypLE | Gibco | 12604 | |
| 24-well plates | Falcon | 353047 | |
| 70 mM cell strainer | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Sterile sealing tape | Nunc | 236366 | |
| Trichostatin A | Sigma | T8552 | |
| Orbital Shaker | Fisher Scientific | 11-402-12 |
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