Menneskelige Nevroendokrine tumorcellelinjer som en tredimensjonal modell for studiet av menneskelig nevroendokrin svulst Therapy

Summary

Vi presenterer en enkel agarose overlegg plattform å vokse 3D flercellede spheroids med nevroendokrine kreft cellelinjer. Denne metoden gir en meget enkel måte å undersøke effekten av terapeutiske legemidler på de nevroendokrine kreftceller. Det kan også hjelpe oss å etablere humane nevroendokrin svulst spheroids for kreftbehandling.

Abstract

Nevroendokrine svulster (NET) er sjeldne svulster, med en forekomst av to per 100 000 individer per år, og utgjør disse 0,5% av alle menneskelige maligniteter. ^En annen enn kirurgi for mindretallet av pasienter som presenterer med lokalisert sykdom, er det liten eller ingen overlevelse fordel for systemisk behandling. Derfor er det et stort behov for å bedre forstå biologi av garn, og i særlig definere nye terapeutiske mål for pasienter med nonresectable eller metastatisk nevroendokrine svulster. 3D cellekultur er blitt en populær metode for narkotika screening på grunn av sin relevans i modellering in vivo svulstvev organisasjon og mikromiljøet. ^2,3 Den 3D flercellede spheroids kunne gi verdifull informasjon i en mer tidsriktig og billigere måte enn direkte fortsetter fra 2D cellekultur eksperimenter til dyr (murine) modeller.

For å lette oppdagelsen av nye legemiddelselskap for NET patients, har vi utviklet en in vitro 3D flercellet spheroids modellen med de menneskelige NET cellelinjer. De NET cellene er belagt i en ikke-klebende agarose-belagt 24-brønns plate og ruges i henhold fysiologiske forhold (5% CO _2, 37 ° C) med en svært langsom omrøring i 16-24 timer etter plating. Cellene danner flercellede spheroids starter på ^3. eller ^4. dag. De spheroids blitt mer sfærisk ved den ^6. dagen, og da de medikamentelle behandlinger er igangsatt. Effekten av medikamentell behandling på Net spheroids overvåkes basert på morfologi, form og størrelse på spheroids med en fase-kontrast lysmikroskop. Størrelsen på spheroids er beregnet automatisk ved hjelp av en egendefinert utbygd MATLAB program basert på en aktiv kontur algoritme. Videre viser vi en enkel metode for å behandle HistoGel embedding på disse 3D spheroids, som tillater bruk av standard histologiske og immunhistokjemiske teknikker.

Protocol

1. Forberedelse av 1% agarose-belagt 24-brønnen Plate

1. Tilsett 1 g agarose (RPI, A20090-500) til 100 ml avionisert vann i en 250-500 ml flaske og autoklav å sterilisere agarose (121 ° C, 15 psi, 15 min i en autoklav maskin). Overfør flasken med sterilisert agarose i et 70 ° C vannbad. Den agarose er klar til å helles når det er avkjølt til 70 ° C, som tar ca en time. Sørg for å holde agarose sterile til enhver tid.
2. Innhent 24-vel flat-bunnplater (Falcon, 353 047), alle slags 24-vel flat-bunnplater ville fungere hvis platene kan avbildes under en fase-kontrast mikroskop.
3. Tilsett 200 mL av agarose til hver brønn med en Eppendorf repeater pipetten i en biosikkerhet skap og virvle det agarose rundt brønnen for å gjøre det dekke brønnen jevnt. 200 mL av agarose er hensiktsmessig å danne en konkav overflate slik at spheroids kan danne konsistente runde former. Mindre enn 200 mL agarose kan ikkedekke brønnen helt, men mer enn 200 mL agarose kan ikke danne den konkave overflaten og spheroids dyrket på den kan ikke danne runde former.
4. De agarose-belagte 24-brønns plater er klare til å bli brukt i ca 10 min. (Valgfritt) Tilsett 100 mL av medium til stabilisering i agarose med kultur medium før såing celler.
5. Alternativt etter at agarose er fullt stivnet, tilsett 100 mL vekst medium til hver brønn og forsegle platene med sterile forseglingstape (Nunc, 236366). Disse platene kan lagres ved 4 ° C i opptil en uke.

2. Utarbeidelse av encellete utestengelse

1. Alle forsøk er gjort ved hjelp av standard aseptiske teknikker i en biosikkerhet skap og alle kulturer dyrkes i en 37 ° C fuktet inkubator med 5% CO ₂ i lufta, hvis ikke spesifisert.
2. Menneskelig pankreas NET Bon-1 celler opprettholdes i DMEM/F12 (Invitrogen, 10565) med 10% fosterets storfe serum (FBS, Invitrogen,16000-044) medium i en 100 mm x 20 mm sterilt vev kultur fatet (Corning, 430167).
3. Når monolayer Bon-1 celler nå 70-80% confluency, er medium fjernet. Cellene blir vasket med PBS to ganger, og løsnet fra fatet ved å legge 1 ml TrypLE (Invitrogen, 12604) med 5 min inkubasjon ved 37 ° C. TrypLE ligner trypsin, men er stabil ved 15 - 30 ° C samt ved 4 ° C. Sjekk under mikroskop for å sørge for at alle cellene er løsrevet fra fatet.
4. Legg 9 ml vekst medium til trypsinized celler og bruke en pipette til pipetter celler opp og ned noen ganger for å sikre en enda eneste celle suspensjon.
5. Bruk 70-mikrometer celle sil (Fisher, 22363548) for å filtrere cellene.
6. Samle cellene og utføre en celletall hjelp Guava PCA-96 Base System (Millipore).
7. Forbered en suspensjon av 5.000 celler per ml i fenol-free DMEM/F12 med 10% FBS vekst medium.

3. Spheroid Kultur

1. Overlay 200 mL av singelencellesuspensjoner til agarose-belagt 24-brønns plate og forsegle de 24-brønns plater med sterilt forseglingsteipen å hindre fordamping.

Merk: - Antall celler som skal belagt bør fastsettes empirisk basert på størrelsen av de spheroids på dag 6, 300-400 mikrometer diameter spheroids ville være den ideelle størrelsen for å starte behandling; 1000 BON-1 og H727 celler er belagt.

- Vi anbefaler ikke å starte medikamentell behandling etter dag 6 fordi livskraft for 3D cellene begynner å falle på ca dag 10 (data ikke vist, manuskript under utarbeidelse).

2. Plasser de ovennevnte agarose-belagte 24-brønns plater med BON-1 celler på en orbital shaker til en svært langsom omrøring på mindre enn 40 rpm over natten i en 37 ° C fuktet inkubator med 5% CO ₂ i luften. Deretter flytter disse platene til en stabil plattform for å holde kulturer vokser.
3. Tilsett 200 mL vekst medium til hver brønn av ovennevnte plates hver 3. dag. Ikke forstyrre spheroids. Prøv å legge medium gjennom veggen av hver brønn ved å berøre pipettespissen på siden av brønnen og la medium flyte ned i brønnen.
4. Overvåk sfæriske legemet formasjon i 24-brønns plater under et mikroskop.

4. Medikamentell behandling

1. Når spheroids nå rundt 300-400 mikrometer i diameter på dag 6, blir 3D spheroids behandles med legemidler. Dette betegnes som dag 0 for behandling.
2. På dag 6, inneholder hver brønn på platen ca 400 mL av medium. For å sørge for at medikamentell behandling er på 1x endelig konsentrasjon i hver brønn, 3x serielle fortynninger av hver dose av behandlinger er laget av stoffet lager i 5 ml vekst medium i en 15 ml konisk rør, som er nok for 8 replikater.
3. De spheroids på hver rad i 24-brønnen plate er kategorisert som kjøretøy, dose 1, 2, 3, 4 og 5. Det er fire gjentak for hver dose behandlinger på en 24-brønns plate (se
4. Spinn ned 24-brønnen plate ved 800 rpm i 5 min ved 4 ° C for å sikre at alle sammenvoksing på forseglingsteipen gå inn i brønnen. På grunn av den flytende funksjonen av 3D spheroids er medium i hver brønn ikke fjernes for å unngå forstyrrelse av spheroids.
5. Nøye legge 200 mL av de ovenfor laget behandlinger av hver dose i de aktuelle brønnene langs veggen på hver brønn.
6. Forsegle 24-brønns plater med forseglingstapen og Inkuber kulturer i 37 ° C fuktet inkubator med 5% CO ₂ i luften.
7. Hvis nødvendig, trekke de spheroids ved hver brønn med respektive dose av behandlinger etter 72-96 timer.

5. Monitor 3D Spheroid kulturer

1. På hver valgt tidspunkt etter medikamentelle behandlinger (0, 24, 48, 72 timer), de spheroids ved hver brønn than 24-brønnen plate er avbildet med en Zeiss Axiovert 200/M-based fase-kontrast mikroskop med en 5x mål.

Merk: Bilder kan tas på alle lysmikroskop med en kalibrert skalering mellom mikrometer og pixel. En 5x Målet er ideelt fordi spheroids raskt vokse fra den radiologiske feltet med en 10x objektiv.

2. Spheroid analyse kan utføres manuelt med Zeiss AxioVision 4.8.2 Software med RAW-bilder.
3. Alternativt er en tilpasset utbygd MATLAB program som brukes for å estimere størrelsen på spheroids automatisk / semi-automatisk. Den automatiske program implementerer den aktive konturen algoritmen ⁴ å nøyaktig lokalisere konturene av det sfæriske legemet i en gitt bilde og måle sin store (L) og mindre (W) akser automatisk. En halvautomatisk versjon av samme algoritme gjør det mulig å hjelpe starte programmet når sterke gjenstanden er til stede. Alle bildene må eksporteres som TIFF eller JPEG filformater frade rå bildene kan leses av programmet. Volumet av det sfæriske legemet er beregnet som 0,5 x L x B ^2.

6. HistoGel-embedding av netto 3D Spheroids

1. 10-24 spheroids er hentet fra 24-brønns plater, vasket i PBS to ganger, fast i 10% formalin for 2 timer, vasket i 50% og 70% etanol for 15 min to ganger, henholdsvis, og er klar for HistoGel embedding. Alternativt kan de holdes i 70% etanol ved 4 ° C i flere måneder.
2. En tube med kald HistoGel (Thermo Scientific, HG-4000-012) er satt i et begerglass fylt med vann. Begeret varmes i mikrobølgeovn i 1 minutt eller til gel er helt flytende, deretter holdt i samme vannfylt begerglass til alle tider.
3. De spheroids i 70% etanol ovenfra blir overført til en biopsi cryomold (Tissue-Tek, Sakura Finetek, 4565) med en tannpirker. Kontroller at alle spheroids overføres. La spheroids sitte i et minutt til å synke ned til bunnen av bioPSY cryomold. Prøv å kvitte seg med væsker i biopsien cryomold med Kimwipes og i mellomtiden, meget forsiktig dytte spheroids til midten nederst på biopsi cryomold bruker engangs plast Pasteur pipette. Dette trinnet kan være lettere å skje under en dissekere mikroskop.
4. Et tynt lag med varm HistoGel legges til biopsi cryomold å stabilisere spheroids på bunnen av biopsi cryomold, i mellomtiden, blir tannpirker brukes til å holde spheroids i midten nederst på biopsi cryomold veldig forsiktig. Ikke legg for mye HistoGel men akkurat nok til å stabilisere spheroids nederst biopsien cryomold.
5. La spheroids / HistoGel sitte i 1-2 minutter ved romtemperatur eller till HistoGel er størknet. Deretter fyller resten av biopsi cryomold med oppvarmet HistoGel.
6. La den stivne i romtemperatur i ca 10 min.
7. Like før spratt ut spheroids / HistoGel kvartal fra biopsi cryomold, Leave den ved 4 ° C i 1 min, noe som bidrar spratt ut intakte spheroids / HistoGel blokk. De spheroids / HistoGel blokken da pakket inn i et stykke Bio-wraps (Surgipath, 01090) og satt i en vev og biopsi kassett (Fisher Scientific, 15-182-701D). Vevet og biopsi kassett blir lagret i en container med 70% etanol. Da de rutinemessige vev saksbehandlingsregler for parafin embedding blir fulgt. ⁵
8. Den parafin blokken kan være delt i tre-mikrometer tykke lag lysbilder. Lysbildene kan farges med hematoxylin og eosin for å bestemme histologiske forandringer og kan også brukes for immunhistokjemisk farging.

7. Representative Resultater

Menneskelig bukspyttkjertelen nevroendokrine tumorcellelinjer BON-1 (gitt til GeForce-institutt ved Kjell Oberg,, Sverige Uppsala Universitet), QGP-1 (japansk Health Sciences Foundation, Osaka, Japan), og human lunge nevroendokrin svulst celle linje H727 (ATCC) var dyrkes på en agarose-belagt 24-brønns plate. Som sett i Figur 1, de tre cellelinjer viser forskjellig morfologi. BON-1 og H727 celler dannet 3D spheroids. Under mikroskopet, viste H727 cellene tettere og mer kompakt spheroids enn Bon-1 celler. Vi hypotese at H727 cellene har en økt kapasitet for celle-celle adhesjon og danne strammere vegkryss som resultat. QGP-1 celler viser store drue-lignende porøse massene, som ikke anses som spheroids. På grunn av den økende interessen for pankreas nevroendokrin svulst forskning de siste årene, blir BON-1 celler som brukes for resten av tallene. Etter såing Bon-1 celler på agarose-belagt 24-brønnen plate, oppstår flercellet spheroids formasjon vanligvis ved ^3. eller ^4. dag og de ​​spheroids blitt rundere med den ^6. dagen. På grunn av næringsstoffer og oksygen begrensning, celler i tett kjerne av spheroids begynner å dø rundt dag 10 og dag 17, de spheroids begynner å gå i oppløsning på grunn av den store størrelsen eller i såmeg tilfellene utstøting av nekrotisk kjerne. De spheroids typisk kan vokse opp til 1000 mikrometer i diameter. Figur 2 viser deler av dannelse, vekst og nedbryting av Bon-1 3D spheroids.

Medikamentelle behandlinger ble startet da spheroids var rundt 300-400 mikrometer og celler beholdt høy levedyktighet (manuskript under utarbeidelse). Dag 6 3D spheroids ble valgt som startpunkt for medikamentell behandling. Det har blitt rapportert at histone deacetylase hemmere viste antiproliferative og proapoptotic effekter på Net cellene. ⁶ Vi valgte histone-deacetylase hemmer-Trichostatin A (TSA) som et eksempel for å illustrere effekten av medikamentell behandling på 3D Net spheroids. Figur 3A viser morfologi av 3D spheroids upon behandling av TSA. Figur 3B viser volumet av 3D spheroids upon TSA (Sigma, T8552) behandling. Størrelsen på hver enkelt sfæriske legemet ble anslått automatisk av et cusTom-utviklet MATLAB dataprogram. ⁴ En manuell tegning skritt ble lagt for å skaffe de spheroids, som var nær kanten på et gitt bilde. Minst 8 spheroids ble målt per dose av TSA behandlinger ved hvert tidspunkt. Volumet av hver 3D sfæriske legemet ble beregnet som 0,5 x lengde x bredde ^2. Som sett i Figur 3A og 3B, i forhold til kjøretøy, viste alle doser av TSA vist i figurene en viss grad av vekst hemming av Bon-1 3D spheroids. Blant dem er konsentrasjonen av 125 nM og 250 Nm i TSA sterkt undertrykte veksten av 3D spheroids og førte til celledød ved 96-timers tidspunkt.

For å forstå histologi av netto 3D spheroids, en H & E og immunhistokjemisk (IHC) farging ble utført på 3D spheroids som hadde blitt dyrket i 17 dager. Figur 4A illustrerer en metode for å behandle 3D spheroids for HistoGel embedding, som er nøkkelen trinn for parafin innebygging av 3D spher OID s. Figur 4b viser H & E flekker, den immunhistokjemisk farging av kløyvde caspase-3 (en markør for apoptotiske celler) og Ki-67 (en markør for voksende celler) antistoffer på 3D spheroids, som hadde blitt dyrket i 17 dager . Cellene i kjernen av 3D spheroids er for det meste nekrotisk / apoptotisk og det ytterste laget cellene er aktivt proliferating.

Figur 1. Morfologi av NET 3D Spheroids. Den 3D spheroids fra tre menneskelige nevroendokrine tumorcellelinjer er dannet på agarose-belagte 24-brønns plater. 1000 Bon-1, H727 og QGP-1 celler ble sådd på agarose-belagte 24-brønns plater og vokst i en normal fysiologisk tilstand som beskrevet i protokollen. Dette er bilder av 3D spheroids for BON-1 og H727 eller celle tilslag for QGP-1, som ble dyrket i 10 dager.

18/4218fig2.jpg "alt =" Figur 2 "/>
Figur 2. Veksten Tracking av Bon-1 3D Spheroids Veksten sporing av Bon-1 3D spheroids:. Dannelse, vekst og nedbryting av 3D spheroids. Som beskrevet i protokollen, er 1000 Bon-1 celler belagt på en agarose-belagt 24-brønns plate. Cellene er dyrket i et standard DMEM/F12 medium med 10% FBS på en orbital shaker i en fysiologisk tilstand natten, deretter flyttet på en stabil plattform og vokst i samme stand. Veksten sporing av 3D cellene ble fulgt av tenkelig celler hver time for første 5 hr etter plating, og deretter hver 1-3 dager med en Zeiss Axiovert 200/M-based fase-kontrast mikroskop med en 5x mål. Cellene samlede inn masser først, deretter danne flercellede aggregater, små spheroids, større spheroids, og til slutt spheroids gå i oppløsning.

Figur 3. TSA Behandling på BON-13D Spheroids. (A) Bilder av 3D spheroids upon TSA behandling. Behandling gruppe: V - Vehicle (0,0025% DMSO), D1-dose 1 (15.625 nM TSA); D2-dose 2 (31.25 nM TSA), D3: dose 3 (62,5 nM TSA), D4: dose 4 (125 nM TSA ), D5: dose 5 (250 nM TSA). Tidspunkt for behandling: 0 H - Tid punktet som behandlinger startet på dag 6 3D spheroids; 24 H, 48 H, 72 H og 96 H er de tidspunkter etter behandlingene startet. 3D spheroids ble fotografert på hvert tidspunkt som før. (B) Vekst av 3D spheroids upon TSA behandling. De store (L) og mindre (W) aksene i 3D spheroids i (A) ble estimert automatisk av Matlab-programmet ved hvert tidspunkt for behandling (0, 24, 48, 72 og 96 timer). Volumet av 3D spheroids ble beregnet som 0,5 x L x B ^2. Volumet av det sfæriske legemet i grafen var gjennomsnittet av åtte gjentak og feilen baren ble beregnet base på 8 replikater.

Tabell 1.Layout av de medikamentelle behandlinger på en 24-brønns plate.

Figur 4A. Illustrasjon av en metode til prosess 3D Spheroids for HistoGel Embedding. En metode for å behandle 3D spheroids for HistoGel embedding og immunhistokjemisk farging av 3D spheroids (A) En oversikt over en metode for å behandle 3D spheroids for HistoGel embedding. 3D spheroids ble innkapslet i en HistoGel å være på samme nivå i biopsi cryomold, så HistoGel / spheroids Blokken ble pakket inn i en blå Bio-wraps og overført til en gul biopsi kassett for parafin embedding.

Figur 4B. H & E flekker og immunhistokjemisk farging av dag-17 3D Spheroids. (B) H & E farging, Immunhistokjemisk farging av Ki-67 og kløyvde caspase-3 av de 17-dagers 3D spheroids. Detparafin-embedded-seksjonert lysbilder var deparaffinized og antigen gjenfinning ble utført ved hjelp CCI (Cell Conditioning Solution, Verana Medical System, # 711-065-152). Rabbit polyklonal Ki-67 antistoff (Abcam. # Ab833) og kløyvde caspase 3 antistoff (cellesignalisering Technology, # 9661) ble anvendt på en konsentrasjon av 1:75 og 1:200, henholdsvis for 1 time i romtemperatur. Den anti-kanin sekundært antistoff (Jackson Immunolab, # 711-065-152) ble anvendt på 1:500 i 1 time i romtemperatur, fulgt av kromogent påvisning kit DABMap (Ventana Medical Systems, # 760-124). Lysbilder ble kontrafarget med Hematoxylin og dehydrert og ryddet før coverslipping fra xylen.

Discussion

Vi har vist en enkel, pålitelig og reproduserbar metode for å danne 3D flercellet sfæriske legemet fra menneskelige nevroendokrin svulst celler ved hjelp av agarose-belagte 24-brønns plater. Suksessen med denne teknikken er muligheten til å få en eneste sfæriske legemet med homogen størrelse og ensartet form av dag 6 starter fra et fast antall celler. Nøkkelen trinnet er langsom omrøring av platen med NET celler for første 16-24 timer etter plating. Denne metoden kan også gjelde for felles menneskelige brystkreft celler linje MCF-7, human tarmcelle linje HT-29, menneske ikke-småcellet lungekarsinom celle H1299 linje og menneskelige embryonale nyre celle linje HEK-293. De kan alle danne ensartede og kompakt 3D spheroids for terapeutisk legemiddel skjerm (data ikke vist). Selv om flere metoder rapporteres på å generere 3D spheroids, rapporterte ^7-10 metoden her ikke krever spesialiserte plater eller reagenser og er dermed enkel og kostnadseffektiv. Vår upublisert data demonstrate at netto 3D spheroids dyrket på agarose etterligne in vivo NET xenograft tumor geometrisk og molecularly, sammenlignet med monolayer 2D celler. Dette ligner på det som har blitt rapportert for 3D spheroids laget av andre menneskelige kreft cellelinjer. ^11,12 Begrensningen til 3D cellekultur-modellen er at det ikke kan erstatte testing av in vivo effekten av noen medisiner eller terapeutiske behandlinger fordi 3D spheroids er som avaskulær svulster, som er forskjellig fra in vivo tumor i dette aspektet. Likevel vil denne metoden hjelpe bro over gapet og vurderinger av NET terapeutiske legemidler fra in vitro til in vivo i enkelte aspekter.

Immunfluorescens flekker på flercellede spheroids er svært vanskelig å utføre på grunn av den store størrelsen og geometrien av de flytende 3D spheroids og begrensning av confocal mikroskop. Her har vi illustrere en metode for å behandle HistoGel embedding for parafininnebygging, tillater immunhistokjemisk farging av de serielle seksjoneres lysbilder av 3D spheroids. Dessuten bidrar vår spesialutviklede MATLAB program nøyaktig og reproduserbart anslå størrelsen på spheroids, overvåke legemidlets effekt effektivt, og kan inngå i en high-throughput skjerm i utviklingen av legemidler for netto pasienter.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12 Media	Gibco	10565-018
TrypLE	Gibco	12604
24-well plates	Falcon	353047
70 mM cell strainer	Fisher Scientific	22363548
Sterile sealing tape	Nunc	236366
Trichostatin A	Sigma	T8552
Orbital Shaker	Fisher Scientific	11-402-12