Summary
نقدم بسيطة منصة تراكب الاغاروز أن تنمو الأجسام الشبه الكروية المتعددة الخلايا 3D باستخدام الهرموني العصبي خطوط الخلايا السرطانية. هذا الأسلوب يوفر وسيلة مريحة للغاية لدراسة تأثير العقاقير العلاجية على خلايا ورم الغدد الصم العصبية. ويمكن أن يساعد أيضا لنا إقامة الإنسان الأجسام الشبه الكروية ورم الغدد الصم العصبية لعلاج السرطان.
Abstract
أورام الغدد الصم العصبية (شبكات) هي أورام نادرة، مع حدوث اثنين من كل 100 شخص، 000 في السنة، وتبلغ نسبتهم 0.5٪ من جميع الأورام الخبيثة الإنسان. 1 أخرى من عملية جراحية للأقلية من المرضى الذين يعانون من مرض محلي، هل هناك القليل أو لا فائدة من البقاء على قيد الحياة العلاج المنهجي. ولذلك، فإن هناك حاجة ماسة إلى فهم أفضل للبيولوجيا الشباك، وعلى وجه الخصوص تحديد أهداف علاجية جديدة للمرضى المصابين بأورام الغدد الصم العصبية nonresectable أو النقيلي. 3D ثقافة الخلية أصبحت وسيلة شعبية لفحص المخدرات نظرا لأهميتها في نمذجة في الجسم الحي منظمة نسيج الورم والمكروية. 2،3 والأجسام الشبه الكروية 3D المتعددة الخلايا يمكن أن توفر معلومات قيمة في الوقت المناسب تماما وأقل تكلفة من الانتقال مباشرة من 2D خلية التجارب الثقافة الحيوانية (الفئران) نماذج.
لتسهيل اكتشاف علاجات جديدة لبات NETients، طورنا في المختبر نموذج 3D الأجسام الشبه الكروية المتعددة الخلايا باستخدام خطوط الخلايا البشرية NET. ومطلي الخلايا NET في صفيحة غير لاصقة 24-جيدا الاغاروز المغلفة وحضنت تحت الظروف الفسيولوجية (5٪ CO 2، و 37 درجة مئوية) مع الإثارة بطيئة جدا ل16-24 ساعة بعد الطلاء. هذه الخلايا تشكل الأجسام الشبه الكروية المتعددة الخلايا ابتداء من اليوم ال 3 أو 4 الثالثة. والأجسام الشبه الكروية تصبح أكثر كروية من يوم 6 الجاري، وعند هذه النقطة يتم البدء في العلاج بالعقاقير. ويتم رصد مدى فعالية العلاج بالعقاقير على الأجسام الشبه الكروية NET على أساس الشكل، والشكل الظاهري وحجم الأجسام الشبه الكروية مع المجهر ضوء مرحلة التباين. ويقدر حجم الأجسام الشبه الكروية تلقائيا باستخدام برنامج MATLAB عرف نموا على أساس خوارزمية كفاف نشط. علاوة على ذلك، علينا أن نبرهن طريقة بسيطة لمعالجة التضمين HistoGel على هذه الأجسام الشبه الكروية 3D، والسماح باستخدام معيار تقنيات النسيجية والمناعية.
Protocol
1. إعداد 1٪ بلايت 24-جيدا الاغاروز المغلفة
- إضافة 1 ز الاغاروز (RPI، A20090-500) إلى 100 مل ماء منزوع الأيونات في زجاجة 250-500 مل والأوتوكلاف لتعقيم الاغاروز (121 درجة مئوية، و 15 رطل، 15 دقيقة في جهاز الأوتوكلاف). نقل زجاجة مع الاغاروز تعقيمها في حمام ماء 70 درجة مئوية. والاغاروز جاهزة للسكب انه عندما تبرد إلى 70 درجة مئوية، والتي تستغرق حوالي ساعة واحدة. تأكد للحفاظ على العقيمة الاغاروز في جميع الأوقات.
- الحصول على 24 جيد مسطحة القاع لوحات (فالكون، 353047)، أي نوع من 24 جيدا لوحات مسطحة القاع ستعمل إذا كان من الممكن تصوير لوحات تحت المجهر مرحلة التباين.
- الاستغناء عن 200 ميكرولتر من الاغاروز إلى كل جيدا مع ماصة مكرر إيبندورف في خزانة السلامة البيولوجية ودوامة من الاغاروز حول البئر لجعله تغطية بالتساوي جيدا. 200 ميكرولتر من الاغاروز مناسبة لتشكيل سطح مقعر بحيث يمكن أن تشكل الأجسام الشبه الكروية الأشكال بما يتفق كروية. ربما أقل من 200 الاغاروز ميكرولتر لاقد لا تغطي تماما جيدا، ولكن أكثر من 200 الاغاروز ميكرولتر قد لا تشكل سطح مقعر والأجسام الشبه الكروية نمت على أنها لا تشكل الأشكال الكروية.
- والاغاروز المغلفة 24-جيدا لوحات على استعداد لاستخدامها في 10 دقيقة تقريبا. (اختياري) أضف 100 ميكروليتر من متوسطة إلى أن تتوازن مع الاغاروز ثقافة المتوسط قبل خلايا البذر.
- بدلا من ذلك، بعد أن عزز بشكل كامل الاغاروز، إضافة 100 متوسط نمو ميكروليتر إلى كل بئر وختم لوحات مع الشريط ختم معقم (نونك، 236366). ويمكن تخزين هذه اللوحات في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
2. إعداد تعليق خلية واحدة
- تتم جميع التجارب باستخدام التقنيات القياسية العقيم في خزانة السلامة البيولوجية وتزرع كل الثقافات في الحاضنة 37 درجة مئوية مرطب مع ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ 2 في الهواء، ما لم يحدد.
- ويحتفظ البنكرياس الإنسان NET BON-1 في خلايا DMEM/F12 (إينفيتروجن، 10565) مصل مع 10٪ بقري جنيني (FBS، إينفيتروجن،16000-044) في المتوسط 100 ملم x 20 مم معقم صحن زراعة الأنسجة (كورنينج، 430167).
- عندما أحادي الطبقة BON-1 خلايا تصل 70-80٪ confluency، تتم إزالة المتوسط. تغسل الخلايا مع PBS مرتين، وطردت من الطبق بإضافة 1 مل TrypLE (إينفيتروجن، 12604) مع حضانة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. TrypLE يشبه التربسين لكن مستقرة بسرعة 15 - 30 درجة مئوية، وكذلك في 4 درجات مئوية. فحص تحت المجهر للتأكد من فصل جميع الخلايا من صحن.
- إضافة 9 متوسط نمو مل إلى الخلايا trypsinized واستخدام ماصة لماصة خلايا صعودا وهبوطا عدة مرات لضمان وجود تعليق خلية واحدة حتى.
- استخدم 70 ميكرومتر مصفاة الخلية (فيشر، 22363548) لتصفية الخلايا.
- جمع الخلايا وإجراء تعداد الخلايا باستخدام الجوافة PCA-96 نظام قاعدة (ميليبور).
- إعداد وتعليق من 5000 خلية لكل مل في الفينول خالية DMEM/F12 مع 10٪ متوسط نمو FBS.
3. كروي الثقافة
- تراكب 200 ميكرولتر من واحدتعليق الخلية إلى لوحة 24-جيدا الاغاروز المغلفة وختم لوحات 24-جيدا مع الشريط ختم عقيمة لمنع التبخر.
ملاحظة: - يجب تحديد عدد الخلايا لمطلي تجريبيا على أساس حجم الأجسام الشبه الكروية في يوم 6؛ 300-400 قطرها ميكرون من الأجسام الشبه الكروية سيكون حجم مثالي لبدء العلاج من تعاطي المخدرات؛ 1000 BON-1 و ومطلي H727 الخلايا.
- نحن لا ننصح بداية العلاج بالعقاقير بعد 6 أيام وذلك لأن بقاء الخلايا 3D يبدأ بالتخلي عن في يوم 10 (البيانات لا تظهر، مخطوطة في الإعداد).
- وضع فوق الاغاروز المغلفة 24 وحات جيدة مع BON-1 الخلايا على شاكر المداري في التحريض بطيئة جدا من أقل من 40 دورة في الدقيقة بين عشية وضحاها في الحاضنة 37 درجة مئوية مرطب مع ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ 2 في الهواء. ثم تنتقل هذه اللوحات إلى قاعدة مستقرة للحفاظ على الثقافات متزايد.
- إضافة 200 متوسط نمو ميكروليتر إلى كل بئر من لوحة فوقق كل 3 أيام. لا تعكر صفو الأجسام الشبه الكروية. محاولة إضافة المتوسطة من خلال الجدار من كل بئر من خلال لمس طرف ماصة إلى جانب البئر والسماح للتدفق المتوسط الى اسفل البئر.
- رصد تشكيل كروي في لوحات 24-جيدا تحت المجهر.
4. العلاج من تعاطي المخدرات
- عندما الأجسام الشبه الكروية يصل إلى نحو 300-400 ميكرون في القطر في يوم 6، والتعامل مع الأجسام الشبه الكروية 3D مع المخدرات. ويرمز هذا ك 0 يوميا لمدة العلاج من تعاطي المخدرات.
- في يوم 6، كل بئر من لوحة تحتوي على حوالي 400 ميكرولتر من المتوسط. للتأكد من أن العلاج بالعقاقير هي في تركيز نهائي 1X في كل التخفيفات جيدا، والمسلسل من 3X كل جرعة من العلاجات مصنوعة من مخزون الدواء في 5 مل متوسط النمو في أنبوب مخروطي 15 مل، وهو ما يكفي لمدة 8 مكررات.
- وتصنف والأجسام الشبه الكروية في كل صف من 24 لوحة وكذلك المركبات، وجرعة 1، 2، 3، 4 و 5. هناك 4 مكررات لكل جرعة من العلاج على 24 لوحة جيد واحد (انظر
- تدور أسفل لوحة 24-جيدا في 800 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية للتأكد من أن كل تكثفات على الشريط ختم الخوض في البئر. يرجع ذلك إلى ميزة تعويم الأجسام الشبه الكروية 3D، لا يتم إزالة المتوسطة في كل بئر لتجنب اضطراب في الأجسام الشبه الكروية.
- إضافة بعناية 200 ميكرولتر من العلاجات المذكورة أعلاه الصنع من كل جرعة في آبار المناسبة على طول الجدار من كل بئر.
- ختم لوحات 24 بشكل جيد مع شريط الختم واحتضان الثقافات في 37 درجة مئوية حاضنة مرطب مع ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ 2 في الهواء.
- إذا لزم الأمر، والتراجع في كل الأجسام الشبه الكروية بشكل جيد مع كل جرعة من العلاج بعد 72-96 ساعة.
5. شاشة 3D الثقافات الجسم الشبه الكروي
- في كل نقطة مرة بعد اختيار العلاجات الدوائية (0، 24، 48، 72 ساعة)، والأجسام الشبه الكروية في كل بئر من تيوقال انه التقط 24 لوحة جيدا مع المجهر Axiovert زييس مرحلة التباين 200/M-based باستخدام الهدف 5X.
ملاحظة: يمكن التقاط صور على أي ضوء المجهر مع زيادة معايرة بين ميكرومتر وبكسل. وثمة هدف 5X مثالية لأن الأجسام الشبه الكروية تتفوق بسرعة مجال التصوير مع هدف 10X.
- لا يمكن أن يؤديها تحليل كروي يدويا باستخدام زييس AxioVision 4.8.2 البرامج مع الصور الخام.
- بدلا من ذلك، يتم استخدام برنامج MATLAB عرف تطورا لتقدير حجم الأجسام الشبه الكروية تلقائيا / شبه تلقائيا. البرنامج تلقائيا ينفذ خوارزمية كفاف نشط من 4 إلى تحديد دقيق للكفاف كروي في صورة معينة، وقياس رئيسية لها (L) ومحاور التعديلات (W) تلقائيا. وهناك نسخة شبه التلقائي من نفس الخوارزمية يتيح للمستخدمين للمساعدة في بدء برنامج قوي عندما قطعة أثرية موجودة. كل الصور يجب أن يتم تصديرها مثل TIFF أو JPEG من صيغ الملفاتالصور الخام يمكن ان تقرأ من قبل البرنامج. ويقدر حجم كروي إلى 0.5 × العرض × L 2.
6. HistoGel-التضمين من الأجسام الشبه الكروية في 3D NET
- يتم جمع 10-24 الأجسام الشبه الكروية من لوحات 24 جيد، وغسلها مرتين في برنامج تلفزيوني، ثابتة في الفورمالين 10٪ لمدة 2 ساعة، وغسلها في 50٪ و 70٪ من الإيثانول لمدة 15 دقيقة مرتين على التوالي، ونحن على استعداد لتضمين HistoGel. بدلا من ذلك، يمكن الاحتفاظ بها في الايثانول 70٪ في 4 درجات مئوية لعدة أشهر.
- يتم وضع أنبوب من HistoGel الباردة (الحرارية العلمية، HG-4000-012) في كوب مملوء بالماء. يسخن الدورق في الميكروويف لمدة 1 دقيقة أو حتى يتم المسال تماما الجل، ثم أبقى في الكأس مملوءة بالماء نفسه في جميع الأوقات.
- يتم نقل الأجسام الشبه الكروية في الايثانول 70٪ من أعلى إلى cryomold خزعة (نسيج تيك، ساكورا Finetek، 4565) باستخدام مسواك. تأكد من أن يتم نقل جميع الأجسام الشبه الكروية. السماح للالأجسام الشبه الكروية الجلوس لمدة دقيقة واحدة حتى تغرق إلى قاع الحيويPSY cryomold. محاولة للتخلص من السوائل في cryomold خزعة مع Kimwipes و في هذه الأثناء، دفع بلطف جدا الأجسام الشبه الكروية في مركز في الجزء السفلي من cryomold خزعة باستخدام أواني بلاستيكية ماصة باستير. هذه الخطوة قد يكون من الأسهل أن يتم تشريح تحت المجهر.
- يتم إضافة طبقة رقيقة من HistoGel حرارة إلى cryomold خزعة لتحقيق الاستقرار في الأجسام الشبه الكروية في الجزء السفلي من cryomold خزعة، وفي الوقت نفسه، يتم استخدام المسواك للحفاظ على الأجسام الشبه الكروية في مركز في الجزء السفلي من cryomold خزعة بلطف جدا. لا تضيف HistoGel الكثير ولكن يكفي فقط لتحقيق الاستقرار في الأجسام الشبه الكروية في الجزء السفلي من cryomold الخزعة.
- السماح للالأجسام الشبه الكروية / HistoGel الجلوس لمدة 1-2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة أو حتى وطدت وHistoGel. ثم ملء بقية cryomold خزعة مع HistoGel حرارة.
- السماح لها يصلب في درجة حرارة الغرفة لحوالي 10 دقيقة.
- قبيل تفرقع في الأجسام الشبه الكروية / كتلة HistoGel من cryomold خزعة، لياهاء عليه في 4 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، مما يساعد على تفرقع في الأجسام الشبه الكروية سليمة / كتلة HistoGel. يتم تغليف ثم الأجسام الشبه الكروية / كتلة HistoGel في قطعة من الحيوية يلف (Surgipath، 01090)، ووضع في الأنسجة وخزعة كاسيت (فيشر العلمية، 15-182-701D). يتم تخزين الأنسجة وكاسيت خزعة في وعاء مع الايثانول 70٪. ثم يتم اتباع معالجة الأنسجة روتين إجراءات لتضمين البارافين. 5
- لا يمكن للكتلة البارافين يكون مقطوع إلى 3-ميكرومتر الشرائح طبقة سميكة. ويمكن ملطخة الشرائح مع هيماتوكسيلين ويوزين لتحديد التغيرات النسيجية ويمكن أن تستخدم أيضا لتلطيخ المناعى.
7. ممثل النتائج
الإنسان البنكرياس الغدد الصم العصبية خطوط الخلايا السرطانية BON-1 (المقدمة إلى معهد Verto بواسطة أوبيرغ كجيل، جامعة أوبسالا، السويد)، QGP-1 (اليابانية للعلوم الصحية مؤسسة، أوساكا، اليابان)، والرئة الغدد الصم العصبية البشرية خط خلية H727 الورم (آي تي سي سي) كانت نمت على agarosه المغلفة 24 لوحة جيدا. كما رأينا في الشكل 1، وخطوط الخلايا الثلاث تظهر مورفولوجيا مختلفة. شكلت BON-1 و H727 خلايا الأجسام الشبه الكروية 3D. تحت المجهر، وأظهرت H727 خلايا الأجسام الشبه الكروية أشد وأكثر إحكاما من خلايا BON-1. نحن نفترض أن H727 الخلايا لديها القدرة المتزايدة للخلية خلية التصاق وتشكيل تشديد التقاطعات نتيجة لذلك. QGP-1 الخلايا إظهار كبير العنب مثل الجماهير التي يسهل اختراقها، والتي لا تعتبر الأجسام الشبه الكروية. يرجع ذلك إلى الاهتمام المتزايد من البحوث البنكرياس ورم الغدد الصم العصبية في السنوات الأخيرة، وتستخدم الخلايا BON-1 لبقية الشخصيات. بعد البذر BON-1 الخلايا على 24 لوحة جيد الاغاروز المغلفة، متعددة الخلايا الأجسام الشبه الكروية تشكيل يحدث عادة في اليوم الرابع 3 الثالثة أو (4) والأجسام الشبه الكروية أصبح مستدير من قبل 6 أيام عشر. يرجع ذلك إلى الحد من المواد الغذائية والأوكسجين، والخلايا في قلب الكثيفة من الأجسام الشبه الكروية تبدأ يموت حوالي 10 أيام، ويوم 17، والأجسام الشبه الكروية تبدأ في التفكك بسبب حجم كبير أو حتى فيلي حالات طرد من صميم نخرية. والأجسام الشبه الكروية يمكن أن تنمو عادة ما يصل إلى 1000 ميكرون في القطر. ويبين الشكل 2 مقاطع من النمو، وتكوين وتفكك الأجسام الشبه الكروية BON 1-3D.
وقد بدأ العلاج بالعقاقير عندما كانت الأجسام الشبه الكروية حول 300-400 ميكرون والخلايا الاحتفاظ جدوى عالية (مخطوطة قيد الإعداد). وقد تم اختيار يوم 6 الأجسام الشبه الكروية 3D كنقطة بداية للعلاجات الدوائية. فقد أفيد أن مثبطات deacetylase هيستون وأظهرت آثار أنتيبروليفرتيف] وproapoptotic على الخلايا NET. 6 لقد اخترنا هيستون deacetylase المانع-A-Trichostatin 3A (TSA) كمثال لتوضيح تأثير العلاج بالعقاقير على الأجسام الشبه الكروية NET 3D. ويبين الشكل في التشكل من الأجسام الشبه الكروية 3D على معالجة الشكل. TSA 3B يبين حجم الأجسام الشبه الكروية 3D على TSA (سيغما، T8552) معاملة. وقدر حجم كل فرد كروي تلقائيا باستخدام سلطات الجماركتوم نموا MATLAB برنامج كمبيوتر. تم إضافة 4 الرسم اليدوي خطوة للمساعدة في الحصول على الأجسام الشبه الكروية، والتي كانت على مقربة من حافة في صورة معينة. وتم قياس لا يقل عن 8 الأجسام الشبه الكروية في الجرعة الواحدة من العلاجات TSA في كل نقطة زمنية. تم حساب حجم كل كروي 3D مثل طول × 0.5 × العرض 2. أظهر كل جرعة من TSA هو مبين في الأرقام كما رأينا في الشكل 3A و 3B، نسبة إلى السيارة، درجة معينة من إعاقة النمو من الأجسام الشبه الكروية BON 1-3D. فيما بينها، وتركيزات من 125 نانومتر، و250 نيوتن متر من TSA قمعت بقوة في نمو الأجسام الشبه الكروية 3D، وأدى إلى موت الخلايا في 96 ساعة في نقطة زمنية.
لفهم الأنسجة من الأجسام الشبه الكروية في 3D NET، وأجريت H & E والمناعى تلطيخ (IHC) على الأجسام الشبه الكروية 3D التي تم زرعها لمدة 17 يوما. الشكل 4A يوضح طريقة لمعالجة الأجسام الشبه الكروية 3D لتضمين HistoGel، والذي هو مفتاح خطوة لتضمين البارافين من spher 3D oids. الشكل 4B يبين تلطيخ H & E، وتلطيخ المناعى من 3 كاسباس المشقوق (أ علامة للحصول على خلايا أفكارك) وكي 67 (أ علامة للحصول على تكاثر الخلايا) الأجسام المضادة في الأجسام الشبه الكروية 3D، والذي كان قد زرعها لمدة 17 يوما . الخلايا ضمن جوهر الأجسام الشبه الكروية 3D هي في معظمها نخرية / أفكارك وخلايا الطبقة الخارجية تنتشر بنشاط.
الشكل 1. وشكلت الصرف من الأجسام الشبه الكروية 3D NET. والأجسام الشبه الكروية 3D من ثلاثة خطوط الخلايا البشرية الغدد الصم العصبية ورم على لوحات 24-جيدا الاغاروز المغلفة. وفازت المصنفة 1000 BON-1، H727 وQGP 1-الخلايا على 24 لوحات جيدة الاغاروز المغلفة، وتنمو في حالة من الفسيولوجية العادية كما هو مفصل في البروتوكول. هذه هي صور الأجسام الشبه الكروية 3D لBON-1 و H727 أو خلية الركام لQGP-1، والتي تم زرعها لمدة 10 أيام.
18/4218fig2.jpg "ALT =" الشكل 2 "/>
الشكل 2. وتتبع نمو الأجسام الشبه الكروية BON 1-3D وتتبع نمو الأجسام الشبه الكروية BON 3D-1: تكوين ونمو وتفكك الأجسام الشبه الكروية 3D. كما هو مفصل في البروتوكول، ومطلي 1000 BON-1 الخلايا على لوحة 24-جيدا الاغاروز المغلفة. وتزرع الخلايا في المتوسط DMEM/F12 معيار مع FBS 10٪ على شاكر المداري في حالة فسيولوجية بين عشية وضحاها، ثم انتقل على منصة مستقرة ونمت في نفس الحالة. وتلت النمو تعقب الخلايا 3D من قبل خلايا التصوير في كل ساعة لساعة بعد أول 5 الطلاء، ومن ثم كل 1-3 أيام مع Axiovert زييس 200/M-based مرحلة التباين باستخدام مجهر الهدف 5X. خلايا الكلي في الجماهير أولا، ثم تشكيل كتل متعددة الخلايا، الأجسام الشبه الكروية الصغيرة، وأكبر الأجسام الشبه الكروية، وتفكك في نهاية المطاف الأجسام الشبه الكروية.
الشكل 3. TSA المعالجة على BON-1الأجسام الشبه الكروية 3D. (A) صور من الأجسام الشبه الكروية 3D على علاج TSA. علاج المجموعة: V - المركبات (0.0025٪ DMSO)؛ D1-جرعة 1 (15،625 نانومتر TSA)؛ D2 بالجرعات 2 (31.25 نانومتر TSA)؛ D3: جرعة 3 (62.5 نانومتر TSA)؛ D4: جرعة 4 (125 نانومتر TSA )؛ D5: جرعة 5 (250 نيوتن متر TSA). وقت للعلاج: 0 H - نقطة الوقت الذي بدأت العلاج في يوم 6 الأجسام الشبه الكروية 3D، و 24 ه، 48 ساعة، 72 ساعة و 96 H هي النقاط وقت بعد بدء العلاج. تم تصوير الأجسام الشبه الكروية 3D في كل مرة نقطة كما كان من قبل. (ب) النمو من الأجسام الشبه الكروية 3D على علاج TSA. وقدرت الكبرى (L) والثانوية (W) محاور 3D الأجسام الشبه الكروية في (أ) تلقائيا باستخدام برنامج ماتلاب في كل نقطة زمنية من العلاجات (0، 24، 48، 72 و 96 ساعة). ويقدر حجم الأجسام الشبه الكروية 3D إلى 0.5 × العرض × L 2. وكان حجم كروي في الرسم البياني للمتوسط من 8 يتطابق وحساب شريط خطأ قاعدة على 8 مكررات.
الجدول رقم 1.تخطيط العلاج بالعقاقير على طبق من ذهب 24-جيدا.
رقم 4A. توضيح من وسيلة لمعالجة الأجسام الشبه الكروية 3D لتضمين HistoGel. وهناك طريقة لمعالجة الأجسام الشبه الكروية 3D لتضمين HistoGel وتلطيخ المناعى من الأجسام الشبه الكروية 3D (A) لمحة عامة عن وسيلة لمعالجة الأجسام الشبه الكروية 3D لتضمين HistoGel. تم تغليف الأجسام الشبه الكروية 3D في HistoGel أن تكون على نفس المستوى في cryomold خزعة، ثم HistoGel / كانت ملفوفة في كتلة الأجسام الشبه الكروية زرقاء بيو الكتمان، ونقل إلى شريط أصفر خزعة لتضمين البارافين.
رقم 4B. H & E تلطيخ وتلطيخ المناعية من يوم 17 3D الأجسام الشبه الكروية. (B) H & E تلطيخ، وتلطيخ المناعية من كي 67 و ملصوق كاسباس-3 من الأجسام الشبه الكروية التي استمرت 17 يوما 3D. ووكانت جزءا لا يتجزأ من البارافين الشرائح مقطوع deparaffinized وأجريت استرجاع مستضد باستخدام غرفة تجارة وصناعة (خلية حل تكييف، Verana الطبية النظام، # 711-065-152). طبقت أرنب بولكلونل كي-67 الأضداد (Abcam. # Ab833) وملصوق كاسباس 3 الضد (الخلية اشارة التكنولوجيا، # 9661) بتركيز 1:75 و 1:200، على التوالي، لمدة 1 ساعة على درجة حرارة الغرفة. الجسم المضاد المضادة للأرنب الثانوية (جاكسون Immunolab، # 711-065-152) طبق في 1:500 لمدة 1 ساعة على درجة حرارة الغرفة، يليه كشف مولد اللون عدة DABMap (فينتانا للأنظمة الطبية، # 760-124). كانت counterstained الشرائح مع هيماتوكسيلين والمجففة وتطهيرها من قبل coverslipping الزيلين.
Discussion
وقد أثبتت لنا طريقة بسيطة وموثوق بها، وقابلة للتكرار لتشكيل كروي 3D المتعددة الخلايا من خلايا ورم الغدد الصم العصبية باستخدام الاغاروز المغلفة 24-جيدا لوحات. نجاح هذه التقنية هي القدرة على الحصول على كروي واحد مع حجم وشكل موحد متجانس من قبل 6 أيام بدءا من عدد محدد من الخلايا. الخطوة الأساسية هي تحريض البطيء للوحة مع الخلايا الصافية للساعة الأولى بعد 16-24 تصفيح. هذه الطريقة يمكن أن تنطبق أيضا على الإنسانية المشتركة خلية سرطان الثدي خط MCF-7، الإنسان خلية غدية خط القولون HT-29، الإنسان الرئة ذي الخلية غير الصغيرة سرطان خط خلية H1299 والبشرية الخلية الجنينية الكلى خط كلوة الجنين البشري-293. فإنها يمكن أن تشكل جميع الأجسام الشبه الكروية 3D موحد والاتفاق على شاشة العقاقير العلاجية (لا تظهر البيانات). على الرغم من أن يتم الإبلاغ عن العديد من الطرق في توليد الأجسام الشبه الكروية 3D، وذكرت 7-10 الأسلوب هنا لا يحتاج لوحات المتخصصة أو الكواشف وبسيط وبالتالي وفعالة من حيث التكلفة. لدينا demonstrat بيانات غير منشورةه أن الأجسام الشبه الكروية 3D NET نمت على الاغاروز تحاكي في ورم الجسم الحي طعم أجنبي NET هندسيا وجزيئيا، بالمقارنة مع خلايا أحادي الطبقة 2D. هذا يشبه ما تم الإبلاغ عن الأجسام الشبه الكروية 3D مصنوعة من الإنسان الأخرى على خطوط الخلايا السرطانية. 11،12 والحد من نموذج خلية ثقافة 3D هو أنه لا يمكن أن تحل تماما محل اختبار فعالية في الجسم الحي من أية عقاقير أو علاجات العلاجية بسبب والأجسام الشبه الكروية 3D مثل الأورام اوعائي، الذي يختلف عن ورم في الجسم الحي في هذا الجانب. ومع ذلك، فإن هذه الطريقة تساعد على ردم الهوة وتقييم العقاقير العلاجية من NET في المختبر لفي الجسم الحي في بعض الجوانب.
تلطيخ المناعي على الأجسام الشبه الكروية المتعددة الخلايا من الصعب جدا على أداء الواجب لحجم كبير وهندسة الأجسام الشبه الكروية في 3D العائمة والحد من المجهر متحد البؤر. نحن هنا لتوضيح طريقة لمعالجة التضمين HistoGel لالبارافينالتضمين، والسماح تلطيخ المناعى من الشرائح مقطوع التسلسلي لل3D الأجسام الشبه الكروية. الى جانب ذلك، لدينا برنامج MATLAB عرف نموا يساعد بدقة وبتكاثر تقدير حجم الأجسام الشبه الكروية، ورصد فعالية الدواء بكفاءة، ويمكن إدراجها في شاشة عالية الإنتاجية في مجال تطوير الأدوية للمرضى NET.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر بإخلاص الدكتور تشن ون جين للحصول على المساعدة لها مع برنامج MATLAB ومعهد السرطان من منشأة جديدة التشريح المرضي جيرسي ومرفق المجهري. كما نشكر المراجعين لتعليقاتهم واقتراحاتهم. وتدعم هذه الدراسة من قبل رايموند وبيفرلي ساكلر مؤسسة البحوث.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 Media | Gibco | 10565-018 | |
| TrypLE | Gibco | 12604 | |
| 24-well plates | Falcon | 353047 | |
| 70 mM cell strainer | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Sterile sealing tape | Nunc | 236366 | |
| Trichostatin A | Sigma | T8552 | |
| Orbital Shaker | Fisher Scientific | 11-402-12 |
References
- Taal, B. G., Visser, O. Epidemiology of neuroendocrine tumours. Neuroendocrinology. 80, 3-7 (2004).
- Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nat. Methods. 4, 359-365 (2007).
- Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nat. Protocol. 4, 309-324 (2009).
- Chan, T. F., Vese, L. A. Active contours without edges. IEEE Trans Image Process. 10, 266-277 (2001).
- Olert, J., Wiedorn, K. H., Goldmann, T., Kühl, H., Mehraein, Y., Scherthan, H., Niketeghad, F., Vollmer, E., Müller, A. M., Müller-Navia, J. HOPE Fixation: A Novel Fixing Method and Paraffin-embedding Technique for Human Soft Tissues. Pathology-Research and Practice. 197, 823-826 (2001).
- Baradari, V., Huether, A., Höpfner, M., Schuppan, D., Scherübl, H. Antiproliferative and proapoptotic effects of histone deacetylase inhibitors on gastrointestinal neuroendocrine tumor cells. Endocr. Relat. Cancer. 13, 1237-1250 (2006).
- Foty, R. A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids. J. Vis. Exp. (51), e2720 (2011).
- Shaw, K. R., Wrobel, C. N., Brugge, J. S. Use of three-dimensional basement membrane cultures to model oncogene-induced changes in mammary epithelial morphogenesis. J. Mammary Gland Biol. Neoplasia. 9, 297-310 (2004).
- Ivascu, A., Kubbies, M. Rapid generation of single-tumor spheroids for high-throughput cell function and toxicity analysis. J. Biomol. Screen. 11, 922-932 (2006).
- Napolitano, A. P., Chai, P., Dean, D. M., Morgan, J. R. Dynamics of the Self-Assembly of Complex Cellular Aggregates on Micromolded Nonadhesive Hydrogels. Tissue Engineering. 13, 2087-2094 (2007).
- do Amaral, J. B., Rezende-Teixeira, P., Freitas, V. M., Machado-Santelli, G. M. MCF-7 cells as a three-dimensional model for the study of human breast cancer. Tissue Eng. Part C Methods. 17, 1097-1107 (2011).
- Hirschhaeuser, F., Menne, H., Dittfeld, C., West, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. A. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148, 3-15 (2010).
