Summary
Vi utvecklade en ny kirurgisk metod för intratrakeal administration av bioaktiva medel i musen fostret. Leveransen rutten är mer effektivt i att rikta de fetala mus lungorna än den vanligtvis använda intra-amniotisk injektion. Detta förfarande har hittills inte beskrivits i en musmodell.
Abstract
Prenatal pulmonell leverans av celler, gener eller farmakologiska medel kan ligga till grund för nya terapeutiska strategier för olika genetiska och förvärvade sjukdomar. Förutom medfödda eller nedärvda avvikelser med kravet på en långsiktig uttryck av den levererade genen, flera icke-ärftliga perinatala tillstånd, där kortsiktiga genuttryck eller farmakologisk behandling är tillräcklig för att uppnå terapeutiska effekter, anses som potentiella framtida indikationer för detta typ av tillvägagångssätt. Kandidat sjukdomar för tillämpningen av kortsiktiga prenatal terapi kan vara övergående neonatal brist på tensidprotein B orsakar neonatal respiratorisk 1,2 distress syndrome eller hyperoxisk skador på nyfödda lungan 3. Kandidat sjukdomar för permanent terapeutisk korrigering är cystisk fibros (CF) 4, genetiska varianter av ytaktiva brister 5 och α1-antitrypsinbrist 6.
<p class = "jove_content"> I allmänhet är en viktig fördel av prenatal genterapi möjlighet att starta terapeutisk intervention tidigt i utvecklingen, vid eller med innan kliniska manifestationer i patienten, vilket förhindrar irreparabel skada på individen. Dessutom organ hos fostren har en ökad cellproliferation jämfört med vuxna organ, vilket kan ge en mer effektiv gen eller stamceller överföring till fostret. Vidare är i livmodern genleverans utförs när individens immunsystem är inte helt mogen. Därför bör transplantation av heterologa celler eller komplettering av ett icke-funktionellt eller frånvarande protein med en korrekt version orsakar inte immun sensibilisering till cellen, vektor eller transgen produkt, som nyligen har visat sig vara fallet med både cellulära och genetiska terapier 7 .I den aktuella studien undersökte vi möjligheten att direkt rikta fostrets luftstrupen i en mus mOdel. Detta förfarande används i större djurmodeller såsom kaniner och får 8, och även i en klinisk miljö 9, men har hittills inte utförts tidigare i en musmodell. När man studerar möjligheterna av fostrets genterapi för genetiska sjukdomar såsom CF är musmodell mycket användbar som ett första proof-of-concept på grund av den stora tillgången på olika transgena musstammar, väl dokumenterad embryogenes och fosterutveckling, mindre stränga etiska regler, kort dräktigheten och den stora kullstorleken.
Olika tillfartsvägar har beskrivits att rikta fostrets gnagare lunga, inklusive inom fostervatten injektion 10-12, (ultraljud-styrda) intrapulmonell injektion 13,14 och intravenös administrering i gulesäcken fartyg 15,16 eller navelsträng ven 17. Vår nya kirurgiskt ingrepp ger forskarna möjlighet att injicera medlet val direkt i fostrets mus luftstrupen som görför en mer effektiv leverans till luftvägarna än befintliga tekniker 18.
Protocol
1. Parning av möss för att erhålla önskad graviditet Stage
Tid mate gravida NMRI möss så att de är 18 dagar (E18) gravid (total dräktighet E19.5) vid tidpunkten för operation. Före och efter operation som de är inrymda i filtertoppen burar vid normal rumstemperatur och normalt dagsljus med fri tillgång till vatten och foder.
2. Fostrets Intratrakeal (IT) Injektion (figur 1)
- Först lämna gravida NMRI musen för generell anestesi med 1,5% isofluran i en blandning av O 2 vid 1,5 l / min. Nivån av isofluran beror på ålder och stam av mus, men i allmänhet isofluran bör vara på en nivå som sätter djur i det anestetiska tillståndet. Därefter sätta den gravida musen på en värmedyna (37 ° C) för att upprätthålla kroppstemperaturen under kirurgi.
- Hela kirurgiska proceduren utförs av två kirurger. En kirurg kommer att utföra dissektion av den gravida mus och efterföljande exponering av the foster för intratrakeal injektion. Den andra kirurg utför den fetala intratrakeal injektion själv. Det kirurgiska förfarandet utfördes med användning av sterila instrument och aseptisk teknik.
- Desinficera buken med povidon jodid och utföra en median laparotomi att exponera gravida livmodern. Exteriorize en livmoderhorn i taget och räkna antalet gestational säckar. Ett foster per horn drivs på och väljs utifrån den optimala positionen för exteriorisering av fostrets huvud i efterföljande steg. Den mest lämpliga fostret väljs med visualisering genom livmoderväggen. Nosen på fostrets huvud ska peka mot kirurg som kommer att injicera in i luftstrupen efter exponering fostrets huvud och fastställande den bakåt (som förklaras i efterföljande steg 2,5).
- Först passerar en 6-0 polypropen (Prolene) sutur handväska sträng av ca 1 cm i diameter genom livmoderväggen och fetala membran (fostervatten Membrane och parietala gulesäcken) över det område där senare på fostrets huvud kommer att exponeras genom. Denna sutur håller fostret fast i livmodern från axlar och framåt. Därefter gör ett snitt i livmodern inuti väskan sträng av approximativt 0,8 cm med vass sax.
- Tryck försiktigt på huvudet och halsen på fostret genom hysterotomi. Dra sutur handväskan strängen försiktigt tätt runt halsen och fäst den på plats med 2 Micro-Mosquito tång. Fostrets huvud hålls i hyperextension av en 5-0 polyglaktin 910 (Vicryl) sutur på två tänger placerade i munnen runt den övre käken.
- Enligt stereoskopiska zoom mikroskopi (x10 förstoring) fostrets luftstrupen visualiseras genom att göra en vertikal hals snitt med vass och trubbig dissektion. Snittet i halsområdet är ca 5 mm lång. Det är en ytlig snitt, eftersom den underliggande vävnaden är vidare dissekeras med trubbig dissektion för att nå luftstrupen.
- Att byta ut huvudet i livmodern, tryck lätt på näsan. Halsen först går tillbaka in i livmodern, följt av huvudet. Näsan går i sista. Därefter stänger hysterotomi genom att dra åt plånboken strängen. Sedan injicera totalt cirka 0,5 ml fysiologisk lösning i fostervattenhålan att förhindra oligohydramnios. För att göra detta, sätt in en nål i snittet inuti väskan strängen. Därefter stänger suturen runt nålen, varefter saltlösning injiceras. I ett sista steg, dra in nålen, följt genom att fullständigt stänga pUrse sträng.
- Stäng moderns bukväggen (peritoneum och inre och yttre skikt muskel) och hud med en 5-0 Vicryl löpande sutur i två separata skikt. Därefter infiltrera snittet med 0,2% Xylocain för postoperativ smärtlindring. Det rekommenderas att använda buprenorfin (0,05 - 0,1 mg / kg SC eller IP) för postoperativ smärtlindring. Varken profylaktiska tokolys eller antibiotika används. Mössen hålls på en värmedyna (37 ° C) tills de är helt återhämtat (ca 1 timme).
3. Fostrets Intra-fostervatten (IA) Injektion
- Se 2,1
- Desinficera buken med povidon jodid och utföra en median laparotomi att exponera gravida livmodern. Exteriorize en livmoderhorn i taget och räkna antalet gestational säckar.
- IA injektion kan utföras på alla foster som det tar mindre tid att utföra. Vidare, är positionen för fostret inte kritiskacal jämfört med intratrakeal injektion. Som livmoderväggen är halvtransparent, fostrets strukturer såsom huvudet, armar och ben och svans och placenta läge är snyggt synliga.
- Med användning av samma nål och spruta som ovan (2,7), injicera 30 | il av substans i närheten av fostrets mun. Detta kan göras enklast antingen mellan fostrets huvud och framben, eller mellan de nedre extremiteterna och svans. Injektionen utförs endast efter noggrann undersökning av läget av nålen för att säkerställa att inga fetala strukturer är i kontakt med spetsen vid tidpunkten för injektion.
- Livmodern är omplacerad i buken och bukväggen och huden stängd såsom beskrivits ovan (2,9).
4. Bedömning av Injicerade foster och Cross-främjande
- Döda dammen med hjälp av en godkänd dödshjälp metod 36 timmar efter fostrets ingripande (vid E19.5). Halsdislokation utan extraanestesi skulle vara den bästa metoden, som alla andra former av eutanasi som inkluderar anestesi (t.ex. isofluran, pentobarbital) kommer söva eller döda foster, som du skulle vilja undvika hela tiden. Leverera drivs-on foster med kejsarsnitt. De opererade foster identifieras i livmodern genom sin ställning. Fostervatten säckar är numrerade med början i äggstockarna slutet av bicornuate livmodern.
- Efter leverans är följande kriterier används för att bedöma lönsamheten för fostren: förekomsten av (1) ett hjärtslag, (2) rosa hudfärg (kontra cyanotisk) och (3) spontana rörelser. Placera bara valpar som uppfyller dessa kriterier i en fostermor kull innehåller en dagar gamla valpar. Av erfarenhet vet vi att valparna med svag puls, cyanotisk hudfärg och / eller minimala spontana rörelser ofta inte kommer att överleva på grund av avslag från fostermodern kull eller moderns kannibalism.
- Efter förlossningen ofa synligt färgämne via IT eller IA injektion (t.ex. röda fluorescerande molekyler), är det möjligt att säkerställa en korrekt injektion genom närvaron av detta färgämne (rosa färg från de injicerade röda fluospheres) i bröstkorg (genom direkt injektion in i lungorna efter IT injektion, eller genom inhalation i lungorna efter injektion lA) eller bukhålan (vid förtäring). Detta är möjligt på grund av det faktum att nyfödda möss är semitransparenta möjliggör in vivo-bedömning av lungor och mage.
- Markera injiceras korrekt valpar med kinesisk bläck subkutant ovanför svansen grund. Placera alla valparna, som uppfyller kraven som anges i 4,2 i fosterhemmet moderns kull.
- För att säkerställa maximal acceptans och överlevnad drivs-on valpar, lämna inte mer än 10 valpar totalt i fostermodern kull (båda hennes egna 1 dag gamla valpar, samt gränsöverskridande främjas valpar). Innan du placerar den opererade-på valpsi fostermodern kull, täcka dem i strö från fostermodern, som innehåller både hennes avföring och urin för att maskera eventuella icke-bekanta dofter.
- Placera buren i en lugn miljö och inte störa kullen minst 12 timmar (över natten).
- Följande dag, noggrant utvärdera överlevnaden att främja genom att räkna alla valparna, vilket gör åtskillnad mellan fostermodern s valpar och de opererade-on valpar (markerade med kinesiska Bläck och i genomsnitt mindre än de andra valparna). Minimera manipulation tidpunkten för dessa ungar för att undvika avstötning av modern och för att undvika hypotermi. I allmänhet om valpar inte har någon mjölk i magen (som är synlig på grund av den halvgenomskinliga natur nyfödda valpar), är prognosen mycket dålig för ytterligare överlevnad av dessa djur.
5. Representativa resultat
Den övergripande planen av experimentet visas i Figure 2.
Bestämning av den optimala volymen för intratrakeal injektion
Att bestämma den optimala volymen för IT injektion, valde vi empiriskt olika volymer från 10, 20 till 30 pl (n = 3/volume). För enkel detektion, valde vi att injicera röda fluorescerande molekyler (fluospheres, Molecular Probes, Leiden, Nederländerna) sized 100 nm. Efter IT-injektion i E18 gamla foster, var lungorna skördades 24 h senare, fixerades i 4% paraformaldehyd över natten vid 4 ° C och 6 pm frusna sektioner gjordes. Kärnor och aktinfilament färgades med Hoechst 33258 (Sigma-Aldrich, Bornem, Belgien) och Alexa Fluor 488 falloidin (Invitrogen, Merelbeke, Belgien) respektive i 20 min vid rumstemperatur. Konfokala bilder gjordes med en Biorad Radiance 2100 konfokalmikroskop med LaserSharp2000.6 programvara från Carl Zeiss. Den relativa fluorescens (förhållandet rött till blå fluorescens representerar fluospheres och kärnkraft staining, respektive) kvantifierades med ImageJ programvara online (Figur 3). Även vid tidpunkten för fetal kirurgi, har en backflöde detekterades endast efter injektion av 30 | il, vilket indikerar ett överskott av injicerade fluider, gav 30 pl den högsta mängden fluorescerande signal i lungparenkym såsom kvantifieras genom mätning av relativ fluorescens (variansanalys , jämförelser för varje par med användning av Students t-test, * p <0,05, *** p <0,001).
Kvantitativ bedömning av fluospheres i lungvävnad och biodistribution till mag-tarmkanalen
Därefter ville vi jämföra effektiviteten inriktning på fostrets muslunga efter IT kontra IA injektion. För att göra detta, var 30 pl fluospheres levereras till fostrets muslunga efter antingen IT eller IA injektion i E18 gravida NMRI möss (n = 5 per grupp). IT injektion resulterade i en signifikant högre leverans av fluospheres till fostrets lunga jämfört med IA. rutt (1,43 ± 0,56 och 0,05 ± 0,02 relativ fluorescens (förhållandet mellan fluospheres Hoechst respektive variansanalys, Students t-test, *** p <0,001) (figur 4 ac). var obehandlad kontroll foster används för normalisering av fluorescerande bakgrundssignal. Det mag-tarmkanalen var positiv för både IT och IA injicerade djuren (Figur 4 d). nr röd fluorescens observerades i andra vävnader från behandlade foster eller i de negativa kontrolldjuren (data ej visade).
Jämförelse av intratrakeal och inom fostervatten injektion efter rAAV2/6.2 medierad gen leverans i fostrets lunga
Efter att ha jämfört de båda leveransmetoder genom att injicera fluorescerande molekyler, ville vi att utvärdera effektiviteten av viral transduktion och efterföljande genuttryck efter IT och IA injektion med rAAV-vektorer. rAAV2/6.2 kodning eldflugeluciferas (Fluc) (3x10 10 GC / foster)under kontroll av kyckling-β-aktin (CBA)-promotorn injicerades IT (n = 8) eller lA (n = 6) i fetala NMRI möss vid E18. Efter kejsarsnitt och främja, överlevande ungar följdes upp av icke-invasiv bioluminescens imaging (BLI) och övervakas för Fluc aktivitet (fotoner / sekund, p / s) vid 1 veckas ålder (Figur 5). Den totala fotonflöde för IT-gruppen var signifikant högre än i IA-gruppen och den negativa kontrollen (variansanalys, jämförelser för varje par med användning av Students t-test, * p <0,05). Den genomsnittliga BLI signalen i IA-gruppen var inte signifikant högre än i den negativa kontrollgruppen.
Skillnaden mellan en korrekt och en felaktig foster intratrakeal injektion
Skillnaden mellan en korrekt och en incorrectI.T. injektion kan bedömas på flera nivåer. Vid tidpunkten för kirurgi, under insprutning i den fetala luftstrupen, kommer inget motstånd att märkas när needle är placerad i luftstrupen. Dock kommer en högre motstånd märkas vid injektion i paratracheal utrymmet. Andra vid kejsarsnitt eftersom fostret är halvtransparent, är det möjligt att se lungorna och därefter närvaro av en synlig färg (t.ex. kinesiska bläck, fluorescerande molekyler). Ett sista alternativ för att bedöma en korrekt injektion av optisk avbildning och mer specifikt bioluminiscens avbildning. BLI är ett elegant system för att icke-invasivt uppföljning genuttryck av reportergenen eldflugeluciferas, men den rumsliga upplösningen och anatomiska informationen är begränsade. Magnetisk resonanstomografi (MRT) ger hög upplösning, tomografiska bilder som innehåller detaljerad anatomisk information. Därför har vi undersökt kombinationen av BLI med MRT för att erhålla en overlay bild, som kombinerar ytan BLI signalen med en visualisering av de djupare anatomiska strukturer (inre organ). Vårt mål var att få mer detaljerad in vivo information om lokalasering av genuttryck för att kunna skilja en korrekt från en fel det injektion.
Kombinerade BL-MR-bilder förvärvades på flera djur injicerade IT med rAAV2/6.2 CBA-Fluc och CBA-LacZnls (3x10 10 GC / foster för varje vektor, n = 10) vid en veckas ålder (Figur 6). BL avbildning avslöjade en signal som härrör från halsen och bröstkorg regionen. Samtidig registrering av MRT med BLI ligger luciferasgenen uttryck i lungorna området efter en riktig injektion (figur 6 a), men i halsen och buken efter en felaktig injektion (figur 6 b). Histologisk analys av X-gal-färgning bekräftade in vivo co-registrering.
Överlevnad efter intratrakeal och intra-fostervatten injektion
- Fluorosfärer
Överlevnaden för leverans av E18 gamla NMRI foster injicerade IT eller IA med 30 pl 100 nm röd fluorescent-molekyler var 100% i båda grupperna och definierades som antalet injicerade foster vid liv vid tidpunkten för skörd, 24 timmar efter fostrets operation (tabell 1). - rAAV vektor
Överlevnaden för leverans av foster injicerade IT eller IA med rAAV2/6.2, vilket definieras som antalet foster vid liv vid tidpunkten för kejsarsnitt 36h efter fostrets injektion, var 85,3% och 86,3% (tabell 1). Den tidiga neonatala överlevnadsgraden var 53,3% (IT) och 74,5% (lA), respektive, och beräknades genom att korrelera antalet ungar levande 1 dag efter att främja med det ursprungliga antalet injicerade foster. För att få dessa slutliga överlevnad, optimerat vi den kirurgiska perioperativ förfarande protokoll med (1) inhalation isofluran som anestesi istället för administration av en blandning av ketamin (75 mg / kg IP) och medetomidin (1 mg / kg IP) , (2) en värmedyna för att förhindra hypotermi under operation, (3),en stereoskopisk zoom mikroskop och (4) operatörerna blir mer erfaren med det kirurgiska ingreppet.
Figur 1. Intratrakeal injektion i E18 foster möss. I denna figur de viktigaste stegen i det kirurgiska ingreppet för fostrets IT-injektion avbildas. I ett första steg en livmoderhornet är exterioriseras. I ett nästa steg, är en handväska sträng sutur passerar genom livmoderväggen och fosterhinnorna (amnionmembran och parietala gulesäcken) över det område där senare på fostrets huvud kommer att exponeras genom. Därefter huvudet och halsen av fostret exterioriserades genom hysterotomi, varefter fostrets huvud hålls i hyperextension av en 5-0 polyglaktin 910 sutur på två pincetter mellan käftarna. Enligt stereoskopiska zoom mikroskopi (x10 förstoring) fostrets luftstrupen visualiseras genom att göra en vertikal hals incisjon med skarpa och dissektion. I ett sista steg, är en total volym av 30 | il av det injicerade ämnet in i luftstrupen under direkt syn genom den stereoskopiska zoom mikroskop.
Figur 2. Allmän översikt av försöket.
Figur 3. Bestämning av den optimala volymen för intratrakeal injektion. Att bestämma den optimala volymen för IT-injektion, 10, dimensionerad 20 eller 30 | il (n = 3/volume) av röda fluospheres 100 nm administrerades i E18 gamla foster och lungorna skördades 24 tim senare. Kärnor och aktin filament färgades med Hoechst 33258 och Alexa Fluor 488 falloidin respektive. Den relativa fluorescensen (förhållande rött till blå fluorescens representerande fluosphEres och nukleär färgning respektive) kvantifierades med ImageJ programvara online. Medelvärde ± SD, variansanalys, jämförelser för varje par med användning av Students t-test, * p <0,05, *** p <0,001.
Figur 4. Kvantitativ bedömning av fluospheres i lungvävnad och biodistribution till mag-tarmkanalen. Var 30 pl röda fluospheres levereras till fostrets muslunga efter (a) eller (b) lA injektion i E18 dräktiga NMRI-möss för att jämföra effektiviteten av målsökande fostrets muslunga. Obehandlade kontroll foster användes för normalisering av fluorescerande bakgrundssignal. Kärnor och aktin filament färgades med Hoechst 33258 och Alexa Fluor 488 falloidin, respektive. (C) Den relativa fluorescens (förhållandet mellan rött till blått fluorescens representerar fluospheres och nukleär färgning respektive) kvantifierades med ImageJ programvara online. (d) mag-tarmkanalen var positivt för både IT och IA injicerade djuren. Medelvärde ± SD, variansanalys, Students t-test, *** p <0,001. Klicka här för att se större bild .
Figur 5. Jämförelse av intratrakeal och inom fostervatten injektion efter rAAV2/6.2 medierad gen leverans i fostrets lunga. BLI signal vid 1 vecka efter injektion av rAAV2/6.2 (3 x 10 10 GC / foster CBA-Fluc) med motsvarande kvantifiering av total fotonflödet . Alla djur skannades, åtskilda av svarta partitioner, för att undvika spridning av fotoner till närliggande djur. Den pseudofärger skalan visar fotonflödet per sekund, Per kvadratcentimeter per steradian (P / S / cm 2 / sr). Mätningar erhölls i en 4,3 cm 2 rektangulärt område av intresse. Medelvärde ± SD, variansanalys, jämförelser för varje par med användning av Students t-test, * p <0,05. Figur anpassad från Carlon et al. 2010. Omtryckt med tillstånd från Macmillan Publishers Ltd: [Molecular Therapy] (doi: 10.1038/mt.2010.153), upphovsrätt (2010). Klicka här för att se större bild .
Figur 6. Skillnaden mellan en korrekt och en felaktig foster intratrakeal injektion efter rAAV2/6.2 medierad gen leverans i fostrets lunga. Kombinerad BL-MR-bilder förvärvades på flera djur injicerade IT med rAAV2/6.2 CBA-Fluc och CBA-LacZnls (3x10 10 GC / foster för varje Vector) vid en veckas ålder. BL avbildning avslöjade en signal som härrör från halsen och bröstkorg regionen. Samtidig registrering av MRT med BLI ligger luciferasgenen uttryck i lungorna området efter en riktig injektion (a), men i halsen och buken efter en felaktig injektion (b). Histologisk analys bekräftade in vivo co-registrering. Skala bar = 100 nm. Siffran anpassad från Carlon et al., 2010. Klicka här för att se större bild .
| Injektion ämne | Injektion metod | Överlevnad till leverans en | Överlevnad att främja b | Tidig neonatal överlevnad c |
| fluospheres | DET | 100 (8/8) </ Td> | na | na |
| IA | 100 (5/5) | na | na | |
| rAAV2/6.2 | DET | 85,3 (64/75) | 62,5 | 53,3 (40/75) |
| IA | 86,3 (44/51) | 86,4 | 74,5 (38/51) |
Tabell 1. Överlevnad efter FOSTER-intratrakealt och inom fostervatten injektion. En överlevnad till leverans, dvs efter fetal kirurgi och vid kejsarsnitt, innan främja. B Valpar bara var främjas om de var rosa, rör sig och andas normalt. C. Den tidiga neonatala överlevnaden uttryckt som en funktion av det ursprungliga antalet injicerade valpar. Förkortningar: IT intratrakeal injektion, IA Intra-fostervatten injektion, et ej tillämpligt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiska steg
- Det musstam vi valde att arbeta med är NMRI möss eftersom de har en riklig antal ungar (genomsnittlig kullstorlek 14,4 ± 1,8, egna uppgifter), tål interventioner väl och har goda mödrar egenskaper.
- Placering väskan strängen genom livmoderväggen och fosterhinnorna är ett kritiskt steg som du bara vill exponera fostrets huvud och inte axlarna, annars omplacering är nästan omöjligt utan att orsaka skada.
- En optimal position av fostrets huvud sträckte bakåt är väsentligt för att snittet precis ovanför luftstrupen så att du undviker de stora blodkärlen (jugularvenerna) löper parallellt med luftstrupen.
- Det är viktigt att visuellt följa införandet av nålen i fostrets luftstrupen under operationsmikroskop för att undvika felaktiga injektioner.
- Byta fostrets huvud i livmodern säcken utan att orsaka trauma är viktigt som duvill undvika att skada fostrets huvud, vilket skulle öka intrauterin eller postnatal mortalitet.
- Mamman dödas genom cervikal dislokation endast vid tidpunkten för kejsarsnitt, inte med första CO 2 kvävning, eftersom detta skulle negativt påverka lönsamheten av fostren.
- Cross-främja leder till en högre överlevnad hos de behandlade foster som naturligt vaginal leverans av opererade foster bara lett till en överlevnad på 18,6 ± 16,9% jämfört med 62 ± 14% för icke-injicerade ungar, i våra händer.
Begränsningar
- En fostrets IT injektion är mer tidskrävande att utföra jämfört med en IA injektion. Beroende på kirurgens erfarenhet kan 2-4 foster per gravida mus opereras för att undvika att de mor mössen är sövd mer än en timme.
- En volym av 30 ul är högst för att injicera i fostrets musen luftstrupen. Även om vissa läckage kan upptäckas immediately efter injektion, är den fluorescerande signalen i lungan högst efter injektion av 30 | il fluorescerande molekyler som visas i figur 3.
- Den slutliga överlevnad efter IT injektion är lägre än efter IA injektion (53,3% respektive 74,5%), men detta beror främst på en ökad förlust efter cross-främja. Den tidiga överlevnad indikerar att fetala kirurgiska proceduren väl tolereras både leveransvägar (85,3% och 86,3%).
Möjliga modifieringar och felsökning
- Det kan vara möjligt att utföra fetala IT injektioner vid tidigare tidpunkter än E18. Utföra fetal kirurgi vid tidigare tidpunkter kan vara fördelaktig eftersom den fetala immunsystemet kan vara mindre mogna, som främjar immuntolerans mot virala vektor, terapeutiska proteiner, etc. Vidare, expanderande stam-och stamfaderceller kan vara mer lättillgängliga. Inriktning dessa celler kan ge upphovtill permanent genetisk korrigering. Däremot kan utföra foster kirurgi vid tidigare tidpunkter ökar risken för utvecklingsstörningar avvikelser, som måste övervakas för.
- Postoperativ vård av ungar som genomgick IT injektion som ett foster, kan optimeras ytterligare för att minska förlusten av djur på grund av kannibalism efter att placera dem i fosterhem boet. Ändra musstam av fostermodern kan hjälpa. Vi valde NMRI för sina goda mödrar egenskaper men andra musstammar såsom schweiziska möss kan utföra ännu bättre för att främja ändamål.
Framtida tillämpningar
- Den nya kirurgiska proceduren för att rikta den fetala muslunga genom IT-injektion kan användas för fostrets genterapi av monogena dödliga sjukdomar såsom cystisk fibros, ytaktivt brist och α-1-antitrypsinbrist. Prenatal terapi skulle vara fördelaktigt i dessa fall, eftersom behandlingen påbörjasföre uppkomsten av sjukdomen och kan förhindra oåterkallelig skada. Dessutom, om stam eller progenitorceller kan riktas, kan en livslång korrigering teoretiskt erhållas, eftersom dessa celler skulle kontinuerligt förse avkomma som uttrycker felet proteinet.
- Bortsett från genetiska sjukdomar som kräver en livslång korrigering skulle fostret interventioner som syftar till en övergående terapeutisk effekt vara till nytta för att studera möjliga behandlingsalternativ för prematuritet där de underutvecklade lungor kräver tillfällig genuttryck av tensid, VEGF (för lung mognad och neo-vaskularisering) eller anti-oxidant proteinerna t.ex. superoxiddismutas.
- Detta förfarande kan dessutom användas för att leverera föreningar eller toxiner i livmodern för att generera sjukdomsmodeller. Till exempel,, lipopolysackarid behandling efterliknar intrauterin infektion, kan ges in utero för störa fetal lunga utveckling, vilket leder till en minskad POStnatal lungfunktion på grund av ihållande kronisk inflammation och strukturella anomalier 19.
Betydelse av tekniken i förhållande till befintliga metoder
- På grund av den specifika inriktning av fostrets luftvägarna, en högre transduktion effektivitet i luftvägarna och alveolerna kan erhållas efter injektion av virala vektorer, jämfört med den nuvarande IA injektion metod. När viral vektor titrar begränsande (t.ex. med lentivirala vektorer), kommer IT-injektion att förhindra utspädning av den injicerade vektorn i fostervattnet att maximera mängden vektorpartiklar i lungorna.
- Undvika utspädning efter fostrets leverans är också fördelaktigt för andra bioaktiva ämnen såsom rekombinant protein eller stamceller som kostnader kan minskas på grund av den mindre mängd bioaktivt ämne som behövs för IT injektion jämfört med IA injektion.
- Fetal IT injection är oberoende av fetal andningsrörelser, som börjar att uppträda vid E14, men varierar mellan individuella djur 20. Detta ger upphov till en hel del variation i upptag mellan de injicerade IA foster, som kan minskas genom IT-injektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
MC och AVdP är docs finansierats med bidrag från Institutet för främjande av innovation genom vetenskap och teknik i Flandern (IWT-Vlaanderen). JT har en deltid Clinical Research Fellowship (Koor) från UZ Leuven. DV är doktorand stöds av ett bidrag från KU Leuven, DBOF/10/062. MMDC är doktorand stöds av ett bidrag från Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento (CNPq) och Erasmus Mundus. Forskningen har finansierats av IWT-Vlaanderen, av EG bidraget Dimi (LSHB-CT-2005 till 512.146) och in vivo Molecular Imaging Research Group (IMIR) från KU Leuven. Vi vill erkänna UPenn vektor Kärna grundades av James M. Wilson för deras vänliga gåva AAV6.2 förpackningar plasmiden för rAAV vektor produktion.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NMRI mice | Janvier, Le Genest St Isle, France | ||
| Isoflurane | Isoba, Intervet / Schering-Plough Animal Health, Milton Keynes, UK | ||
| Prolene 6-0 | Ethicon, Groot Bijgaarden, Belgium | ||
| Vicryl 5-0 | Ethicon, Groot Bijgaarden, Belgium | ||
| 50 μl Hamilton Glass Syringe, Model 1710.5 TLLX SYR | Hamilton, Reno, NV, USA | 5495-20 | |
| 30G sharp needle | Hamilton, Reno, NV, USA | 7762-03 | |
| 2% xylocaine | AstraZeneca, Zoetermeer, The Netherlands |
References
- Willson, D. F., Notter, R. H. The future of exogenous surfactant therapy. Respir. Care. 56, 1369-1388 (2011).
- Abdel-Latif, M. E., Osborn, D. A. Intratracheal Clara cell secretory protein (CCSP) administration in preterm infants with or at risk of respiratory distress syndrome. Cochrane Database Syst. Rev. CD008308, (2011).
- Thebaud, B. Vascular endothelial growth factor gene therapy increases survival, promotes lung angiogenesis, and prevents alveolar damage in hyperoxia-induced lung injury: evidence that angiogenesis participates in alveolarization. Circulation. 112, 2477-2486 (2005).
- Griesenbach, U., Alton, E. W. Gene transfer to the lung: lessons learned from more than 2 decades of CF gene therapy. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 128-139 (2009).
- Aneja, M. K., Rudolph, C. Gene therapy of surfactant protein B deficiency. Curr. Opin. Mol. Ther. 8, 432-438 (2006).
- Flotte, T. R., Mueller, C. Gene therapy for alpha-1 antitrypsin deficiency. Hum. Mol. Genet. 20, R87-R92 (2011).
- Roybal, J. L., Santore, M. T., Flake, A. W. Stem cell and genetic therapies for the fetus. Semin Fetal Neonatal Med. 15, 46-51 (2010).
- Peebles, D. Widespread and efficient marker gene expression in the airway epithelia of fetal sheep after minimally invasive tracheal application of recombinant adenovirus in utero. Gene Ther. 11, 70-708 (2004).
- Deprest, J., Gratacos, E., Nicolaides, K. H. Fetoscopic tracheal occlusion (FETO) for severe congenital diaphragmatic hernia: evolution of a technique and preliminary results. Ultrasound Obstet. Gynecol. 24, 121-126 (2004).
- Buckley, S. M. Intra-amniotic delivery of CFTR-expressing adenovirus does not reverse cystic fibrosis phenotype in inbred CFTR-knockout mice. Mol. Ther. 16, 819-824 (2008).
- Davies, L. A. Adenovirus-mediated in utero expression of CFTR does not improve survival of CFTR knockout mice. Mol. Ther. 16, 812-818 (2008).
- Mitchell, M., Jerebtsova, M., Batshaw, M. L., Newman, K., Ye, X. Long-term gene transfer to mouse fetuses with recombinant adenovirus and adeno-associated virus (AAV) vectors. Gene Ther. 7, 1986-1992 (2000).
- Henriques-Coelho, T. Targeted gene transfer to fetal rat lung interstitium by ultrasound-guided intrapulmonary injection. Mol. Ther. 15, 340-347 (2007).
- Toelen, J. Fetal gene transfer with lentiviral vectors: long-term in vivo follow-up evaluation in a rat model. Am J Obstet Gynecol. 196, e1-e6 (2007).
- Waddington, S. N. Long-term transgene expression by administration of a lentivirus-based vector to the fetal circulation of immuno-competent mice. Gene Ther. 10, 1234-1240 (2003).
- Waddington, S. N. Permanent phenotypic correction of hemophilia B in immunocompetent mice by prenatal gene therapy. Blood. 104, 2714-2721 (2004).
- Senoo, M. Adenovirus-mediated in utero gene transfer in mice and guinea pigs: tissue distribution of recombinant adenovirus determined by quantitative TaqMan-polymerase chain reaction assay. Mol. Genet. Metab. 69, 269-276 (2000).
- Carlon, M. Efficient gene transfer into the mouse lung by fetal intratracheal injection of rAAV2/6.2. Mol. Ther. 18, 2130-2138 (2010).
- Schmiedl, A. Lipopolysaccharide-induced injury is more pronounced in fetal transgenic ErbB4-deleted lungs. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol Physiol. 301, L490-L499 (2011).
- Buckley, S. M. Factors influencing adenovirus-mediated airway transduction in fetal mice. Mol. Ther. 12, 484-492 (2005).
