Summary
We hebben een nieuwe chirurgische aanpak voor intratracheale toediening van bioactieve stoffen in de muis foetus. De levering route is efficiënter in het foetale richten muizenlongen dan de gebruikelijke intra-amniotische injectie. Deze procedure is tot op heden niet beschreven in een muismodel.
Abstract
Prenatale pulmonale toediening van cellen, genen of farmacologische middelen kunnen de basis vormen voor nieuwe therapeutische strategieën voor verschillende genetische en verworven ziekten. Naast congenitale of erfelijke afwijkingen met de vereiste lange termijn expressie van het afgeleverde gen, verscheidene niet-erfelijke perinatale omstandigheden, waarbij korte termijn genexpressie of farmacologische interventie voldoende is om therapeutische effecten te bereiken, worden beschouwd als potentiële toekomstige aanwijzingen voor soort benadering. Kandidaat ziekten voor de toepassing van de korte termijn prenatale therapie kan de voorbijgaande neonatale tekort aan surfactant proteïne B veroorzaakt neonatale respiratory distress syndrome 1,2 of hyperoxische verwondingen van de neonatale long 3 zijn. Kandidaat ziekten voor permanente therapeutische correctie zijn Cystic Fibrosis (CF) 4, genetische varianten van oppervlakte-actieve stof gebreken 5 en α1-antitrypsine-deficiëntie 6.
<p class = "jove_content"> algemeen is een belangrijk voordeel van prenatale gentherapie is de mogelijkheid om therapeutische interventie vroeg in ontwikkeling op of voorafgaand aan klinische manifestaties in de patiënt, waardoor onherstelbare schade aan het individu. Bovendien foetale organen een verhoogde celproliferatie in vergelijking tot volwassen organen, die een efficiëntere gen of stamcel overdracht naar de foetus kan leiden. Verder wordt in de baarmoeder gentherapie uitgevoerd wanneer de eigen afweersysteem niet helemaal volwassen. Daarom moet transplantatie van heterologe cellen of aanvullen van een niet-functioneel eiwit of afwezig een correcte versie niet leiden immuun sensibilisatie voor de cel, vector of transgene product, dat onlangs is het geval bewezen met zowel cellulaire als gentherapieën 7 .In de huidige studie onderzochten we de mogelijkheid om direct richten op de foetale luchtpijp in een muis model. Deze procedure wordt gebruikt in grotere diermodellen zoals konijnen, schapen 8 en zelfs in een klinische setting 9, maar is tot op heden niet uitgevoerd voordat in een muismodel. Als we de mogelijkheden van foetale gentherapie voor erfelijke ziekten zoals CF, het muizenmodel is bijzonder nuttig als een eerste proof-of-concept vanwege de grote beschikbaarheid van verschillende transgene muizenstammen, het goed gedocumenteerd embryogenese en foetale ontwikkeling, minder strenge ethische voorschriften, korte dracht en de grote worpgrootte.
Verschillende toegangswegen zijn beschreven om de foetale knaagdier long richten, met inbegrip van intra-amniotische injectie 10-12, (echogeleide) intrapulmonale injectie 13,14 en intraveneuze toediening in de dooierzak vaten 15,16 of navelstreng 17. Onze nieuwe chirurgische procedure stelt onderzoekers in staat om de agent van de keuze direct te injecteren in de foetale luchtpijp muis die het mogelijk maaktvoor een efficiëntere levering aan de luchtwegen dan bestaande technieken 18.
Protocol
1. Paring van Muizen tot de gewenste zwangerschap Stage verkrijgen
Tijd mate zwangere NMRI muizen zodat zij 18 dagen (E18) zwangere (totaal dracht E19.5) op het moment van de operatie. Voorafgaand aan en na de operatie worden ze gehuisvest in filteropzetstuk kooien bij normale kamertemperatuur en normaal daglicht met vrije toegang tot water en voer.
2. Foetale Intratracheaal (IT) injectie (figuur 1)
- Eerst bij de zwangere muis NMRI algemene anesthesie met 1,5% isofluraan in een mengsel van O2 van 1,5 L / min. Het niveau van isofluraan afhankelijk van de leeftijd en het type van de muis, maar in het algemeen isofluraan moet op een niveau brengt dat dieren in de anesthetische toestand. Dan de zwangere muis op een verwarmingselement (37 ° C) tot lichaamstemperatuur tijdens chirurgie.
- De gehele chirurgische procedure wordt uitgevoerd door twee chirurgen. Een chirurg voert de dissectie van de zwangere muis en de daaropvolgende blootstelling van the foetus voor intratracheale injectie. De tweede chirurg voert de foetus intratracheale injectie zelf. De chirurgische procedure wordt uitgevoerd met steriele instrumenten en een aseptische techniek.
- Ontsmet de buik met povidon jodium en het uitvoeren van een mediane laparotomie aan de zwangere baarmoeder bloot te leggen. Exterioriseren een baarmoedertak op een tijd en tel het aantal zwangerschapsduur zakken. Een foetus per hoorn wordt geopereerd en gekozen op basis van de optimale positie voor uittreding van het foetushoofd in opeenvolgende stappen. De meest geschikte foetus wordt geselecteerd door visualisatie door de baarmoederwand. De neus van de foetale hoofd moet naar de chirurg die zal in de luchtpijp spuiten na het blootstellen van de foetus hoofd en de vaststelling van het naar achteren (zoals uitgelegd in de volgende stap 2.5).
- Eerst langs een 6-0 polypropyleen (Prolene) purse koord hechting van ongeveer 1 cm in diameter door de baarmoederwand en de foetale membranen (vruchtwater membraame en pariëtale dooierzak) over het gebied waar later de foetushoofd wordt belicht door. Deze hechting zorgt ervoor dat de foetus vast in de baarmoeder van de schouders en later. Vervolgens maakt een sneetje in de baarmoeder in de portemonnee string van ongeveer 0,8 cm met een scherpe schaar.
- Knijp zachtjes in het hoofd en de nek van de foetus via de hysterotomie. Trek de portemonnee touwtje hechting zachtjes strak om de nek en zet hem op zijn plaats met 2 Micro-Mosquito tang. De foetale hoofd wordt gehouden in hyperextensie door een 5-0 polyglactine 910 (Vicryl) hechting op twee pincet geplaatst in de mond rond de bovenkaak.
- Onder stereoscopische zoom microscopie (x10 vergroting) van de foetale luchtpijp wordt gevisualiseerd door het maken van een verticale nek incisie met behulp van scherpe en stompe dissectie. De incisie in de nek is ongeveer 5 mm lang. Het is een oppervlakkige incisie, het onderliggende weefsel verder ontleed met stompe dissectie tot de trachea bereiken.
- Om het hoofd te vervangen in de baarmoeder, druk zachtjes op de neus. De hals gaat eerst terug in de baarmoeder, gevolgd door het hoofd. De neus gaat in de laatste. Vervolgens sluit u de hysterotomie vast door de portemonnee string. Vervolgens injecteren in totaal ongeveer 0,5 ml fysiologische oplossing in de amnionholte te oligohydramnion voorkomen. Om dit te doen, plaatst u een naald in de incisie in de portemonnee string. Vervolgens sluit de hechting rond de naald, waarna zoutoplossing geïnjecteerd. In een laatste stap intrekken van de naald, gevolgd door het volledig sluiten van de pUrse string.
- Sluit de maternale buikwand (peritoneum en binnenste en buitenste spierlaag) en huid met een 5-0 Vicryl lopende hechtdraad in twee afzonderlijke lagen. Daarna infiltreren de incisie met 0,2% xylocaine voor post-operatieve pijnvermindering. Het wordt aanbevolen om buprenorfine (0,05 - 0,1 mg / kg SC of IP) gebruiken voor postoperatieve pijn. Noch profylactische tocolyse of antibiotica gebruikt. De muizen worden gehouden op een verwarmingselement (37 ° C) totdat ze volledig hersteld (ongeveer 1 uur).
3. Foetale Intra-amniotische (IA) Injectie
- Zie 2.1
- Ontsmet de buik met povidon jodium en het uitvoeren van een mediane laparotomie aan de zwangere baarmoeder bloot te leggen. Exterioriseren een baarmoedertak op een tijd en tel het aantal zwangerschapsduur zakken.
- IA injectie kan worden uitgevoerd op alle foetussen neemt minder tijd uitvoeren. Bovendien is de positie van de foetus niet kritischcal opzichte intratracheale injectie. Omdat de baarmoederwand is semi-transparant, de foetale structuren zoals het hoofd, ledematen en staart en placenta positie zijn mooi zichtbaar.
- Met dezelfde naald en injectiespuit hierboven (2,7), 30 pl injecteren van de stof in de nabijheid van de foetale mond. Dit kan heel eenvoudig worden gedaan, hetzij tussen de foetale hoofd en voorpoten, of tussen de onderste ledematen en de staart. De injectie wordt alleen uitgevoerd na zorgvuldige bestudering van de positie van de naald te voorkomen dat foetale structuren in contact met het uiteinde op het moment van injectie.
- De baarmoeder wordt verplaatst in de buik en de buikwand en gesloten huid zoals hierboven beschreven (2.9).
4. Beoordeling van Injected foetussen en Cross-het bevorderen van
- Dood de dam met behulp van een goedgekeurde euthanasie methode 36 uur na de foetale interventie (op E19.5). Cervicale dislocatie zonder extraanesthesie zou de beste methode zijn, zoals alle andere vormen van euthanasie dat anesthesie (bijvoorbeeld isofluraan, pentobarbital) bevatten, zullen verdoven of zelfs doden van de foetussen, die je zou willen te allen tijde voorkomen. Lever de bediende-op foetussen met een keizersnede. De bediende foetussen worden in de baarmoeder van hun positie. Amniotische sacs zijn genummerd vanaf het einde van de eierstokken bicornuate uterus.
- Na levering worden de volgende criteria gebruikt om de levensvatbaarheid van de foetus te beoordelen: de aanwezigheid van (1) een hartslag, (2) roze huidskleur (versus cyanotisch) en (3) spontane bewegingen. Plaats alleen pups met deze criteria in het zwerfafval een pleeggezin moeder die een dag oud pups. Uit ervaring weten we dat pups met een zwak hart beat, cyanotisch huidskleur en / of minimale spontane bewegingen vaak niet overleven als gevolg van afwijzing van zwerfvuil de pleegmoeder of door maternale kannibalisme.
- Na levering ofa zichtbare kleurstof of via IT IA injectie (bijvoorbeeld rood fluorescerende moleculen), is het mogelijk om een correcte injectie verzekeren door de aanwezigheid van deze kleurstof (roze kleur van de geïnjecteerde rode fluospheres) in de borst (door directe injectie in de longen na IT injectie of door inhalatie in de longen na IA injectie) of buikholte (door inname). Dit is mogelijk dankzij het feit dat pasgeboren muizen semi-transparant waardoor in vivo beoordeling van de longen en de maag.
- Markeer de juiste manier ingespoten pups met Chinese inkt subcutaan boven de staart basis. Plaats alle pups, die aan de eisen genoemd in 4.2 in het zwerfafval de pleegmoeder te vervullen.
- Om maximale acceptatie en de overleving van de geopereerde-over pups te verzekeren, laat niet meer dan 10 pups in totaal in het zwerfafval de pleegmoeder's (zowel haar eigen 1 dag oud pups, evenals de cross-bevorderd pups). Voor het plaatsen van de geopereerde-op pups in het zwerfafval de pleegmoeder is, dek ze af met strooisel uit de pleegmoeder, die zowel haar uitwerpselen en urine op een niet-vertrouwde geuren te maskeren.
- Plaats de kooi in een rustige omgeving en niet storen het nest voor ten minste 12 uur ('s nachts).
- De volgende dag, zorgvuldig beoordelen de overlevingskans van het bevorderen van door het tellen van alle pups, zodat het verschil tussen pups de pleegmoeder en de bediende-over pups (gemarkeerd met Chinese inkt en gemiddeld kleiner dan de andere pups). Minimaliseer de manipulatie tijd van deze pups tot afwijzing door de moeder te vermijden en om onderkoeling te voorkomen. In het algemeen, als pups niet van aard zijn om melk in hun maag (die zichtbaar is als gevolg van de semi-transparante karakter van de pasgeboren pups), de prognose is erg slecht voor de verdere overleving van deze dieren.
5. Representatieve resultaten
De algehele opzet van het experiment is weergegeven in Figure 2.
Bepalen van de optimale hoeveelheid voor intratracheale injectie
Om de optimale volume IT injectie bepalen we empirisch gekozen verschillende volumes tussen 10 20 tot 30 pi (n = 3/volume). Voor een eenvoudige detectie, kozen we ervoor om rode fluorescerende moleculen (fluospheres, Molecular Probes, Leiden, Nederland) sized 100 nm injecteren. Na injectie in E18 oude foetussen werden de longen 24 uur later geoogst, gefixeerd in 4% paraformaldehyde gedurende de nacht bij 4 ° C en 6 urn bevroren secties werden. Kernen en actine filamenten werden gekleurd met Hoechst 33258 (Sigma-Aldrich, Bornem, België) en Alexa Fluor 488 phalloidin (Invitrogen, Merelbeke, België) respectievelijk 20 min bij kamertemperatuur. Confocale beelden werden gemaakt met behulp van een Biorad Radiance 2100 Confocale microscoop met LaserSharp2000.6 software van Carl Zeiss. De relatieve fluorescentie (verhouding van rood naar blauw fluorescentie die fluospheres en nucleaire staining, respectievelijk) werd gekwantificeerd met behulp ImageJ online software (figuur 3). Hoewel bij de foetale chirurgie, terugstroomt gedetecteerd na injectie van 30 ul, waarin een overmaat geïnjecteerde vloeistoffen, 30 pi gaf de hoogste hoeveelheid fluorescerend signaal in het longparenchym zoals gekwantificeerd door de relatieve fluorescentie (variantieanalyse , vergelijkingen voor elk paar met Student's t-test, * p <0,05, *** p <0,001).
Kwantitatieve beoordeling van fluospheres in longweefsel en biodistributie de maagdarmkanaal
Vervolgens wilden we de doelmatigheid van de foetale gericht muizenlong na versus IA injectie vergelijken. Hiervoor werd 30 ul fluospheres die aan de foetale muizenlong na ofwel IT of IA injectie in E18 zwangere NMRI muizen (n = 5 per groep). IT injectie resulteerde in een significant hogere opbrengst van fluospheres de foetale long opzichte van de IA. route (1,43 ± 0,56 en 0,05 ± 0,02 relatieve fluorescentie (verhouding fluospheres aan Hoechst respectievelijk variantieanalyse, Student's t-test, *** p <0,001) (figuren 4 ac). Onbehandelde controle foetussen werden gebruikt voor normalisatie van fluorescent achtergrondsignaal. het maagdarmkanaal positief was voor zowel de IT en IA geïnjecteerde dieren (figuur 4 d). geen rode fluorescentie waargenomen in andere weefsels van behandelde foetussen en in de negatieve controle dieren (gegevens niet getoond).
Vergelijking van intratracheale en intra-amniotische injectie na rAAV2/6.2 gemedieerde gentherapie in de foetale long
Na vergelijking van beide verzendwijzen door injectie fluorescerende moleculen, wilden we de efficiëntie van virale transductie en daaropvolgende genexpressie evalueren na IT en IA injectie met rAAV vectoren. rAAV2/6.2 codering vuurvlieg luciferase (Fluc) (3x10 10 GC / foetus)onder controle van de kip-β-actine (CBA) promoter werd geïnjecteerd (n = 8) of IA (n = 6) in foetale NMRI muizen op E18. Na een keizersnede en het bevorderen van, overlevende pups werden opgevolgd door niet-invasieve bioluminescentie beeldvorming (BLI) en gecontroleerd op schommelingen activiteit (fotonen / seconde, p / s) op 1 week oud (figuur 5). De totale foton flux voor de IT was significant hoger dan in de groep IA en de negatieve controle (variantieanalyse vergelijkingen voor elk paar met Student's t-test, * p <0,05). De gemiddelde BLI signaal in de IA groep niet significant hoger dan in de negatieve controlegroep.
Onderscheid tussen een correcte en een onjuiste foetale intratracheale injectie
Onderscheid tussen een correcte en een incorrectI.T. injectie kan worden beoordeeld op verschillende niveaus. Op het tijdstip van de operatie, tijdens injectie in de foetale trachea zal geen weerstand worden opgemerkt wanneer de needle is gepositioneerd in de trachea. Echter een hogere weerstand opgemerkt bij het injecteren in de paratracheale ruimte. Tweede plaats, keizersnede de foetus semi-transparant is mogelijk om de longen en vervolgens de aanwezigheid van een zichtbare kleurstof (bijvoorbeeld Chinese inkt, fluorescerende moleculen). Een laatste optie om een correcte injectie te beoordelen is door optische beeldvorming en meer bepaald bioluminescentie beeldvorming. BLI is een elegant systeem voor niet-invasieve opvolging genexpressie van het reportergen vuurvlieg luciferase, maar de ruimtelijke resolutie en anatomische informatie beperkt. Magnetic resonance imaging (MRI) biedt een hoge resolutie, tomografische beelden met gedetailleerde anatomische informatie. Daarom onderzochten we de combinatie van BLI met MRI een overlaybeeld dat de oppervlakte BLI signaal met een visualisatie van de diepere anatomische structuren (organen) combineert verkrijgen. Ons doel was het verkrijgen van gedetailleerde informatie in vivo van de lokalenisatie van genexpressie kunnen een correcte onderscheiden van een verkeerde IT injectie.
Gecombineerde BL-MR beelden werden verkregen van verschillende dieren geïnjecteerd met rAAV2/6.2 CBA-fluctuaties en CBA-LacZnls (3x10 10 GC / foetus voor elke vector, n = 10) op een week oud (Figuur 6). BL beeldvorming bleek een signaal afkomstig van de nek en de thoracale regio. Co-registratie van MRI met BLI gelegen luciferase genexpressie in de pulmonaire regio na een correcte injectie (figuur 6 a), maar in de nek en buikgebied na een onjuiste injectie (figuur 6 b). Histologische analyse door X-gal kleuring bevestigd in vivo co-registratie.
Overleving na intratracheale en intra-amniotische injectie
- Fluorospheres
De overleving tot levering van E18 oude NMRI foetussen geïnjecteerd IT of IA met 30 ul 100 nm rode fluorescent moleculen was 100% in beide groepen werd gedefinieerd als het aantal geïnjecteerde foetussen levend ten tijde van de oogst, 24 uur na de foetale chirurgische procedure (tabel 1). - rAAV vector
De overleving tot levering van foetussen geïnjecteerd of met rAAV2/6.2 IA, die wordt gedefinieerd als het aantal foetussen leven op het tijdstip van keizersnede 36h na foetale injectie was 85,3% en 86,3%, respectievelijk (Tabel 1). De vroege neonatale overleving was 53,3% (IT) en 74,5% (IA) respectievelijk, en werd berekend door het correleren van het aantal levende pups 1 dag na stimuleren met het oorspronkelijke aantal foetussen geïnjecteerd. Zodat deze laatste overleving bekomen, geoptimaliseerd de chirurgische peri-operatieve procedure protocol met (1) inhalatie isofluraan anesthesie plaats als de toediening van een mengsel van ketamine (75 mg / kg IP) en medetomidine (1 mg / kg IP) , (2) een verwarmingselement om onderkoeling te voorkomen tijdens de operatie, (3),een stereoscopische zoom microscoop en (4) de exploitanten steeds meer ervaring met de chirurgische ingreep.
Figuur 1. Intratracheale injectie in muizen foetale E18. In deze figuur zijn de belangrijkste stappen van de chirurgische procedure voor foetale IT injectie afgebeeld. In een eerste stap een baarmoedertak is buiten genomen. In een volgende stap wordt een portemonnee koord hechting doorheen de baarmoederwand en de vliezen (amnionmembraan en pariëtale dooierzak) over het gebied waar later de foetushoofd wordt belicht door. Vervolgens worden de kop en de hals van de foetus buiten gebracht door de hysterotomie, waarna het foetushoofd gehouden in hyperextensie door een 5-0 polyglactin 910 hechting op twee forceps tussen de kaken. Onder stereoscopische zoom microscopie (x10 vergroting) van de foetale luchtpijp wordt gevisualiseerd door het maken van een verticale nek incision met behulp van scherpe en stompe dissectie. In een laatste stap wordt een totaal volume van 30 pl stof geïnjecteerd in de trachea onder direct zicht door de stereoscopische microscoop zoom.
Figuur 2. Algemeen overzicht van het experiment.
Figuur 3. Bepalen van de optimale hoeveelheid voor intratracheale injectie. Om de optimale volume IT injectie bepalen, 10, 20 of 30 pi (n = 3/volume) rode fluospheres sized 100 nm werden toegediend in E18 foetussen oude en de longen werden geoogst 24 uur later. Kernen en actine filamenten werden gekleurd met Hoechst 33258 en Alexa Fluor 488 phalloidin respectievelijk. De relatieve fluorescentie (verhouding van rood naar blauw fluorescentie die fluospheres en nucleaire kleuring respectievelijk) werd gekwantificeerd met behulp ImageJ online software. Gemiddelde ± SD, variantieanalyse, vergelijkingen voor elk paar met Student's t-test, * p <0,05, *** p <0,001.
Figuur 4. Kwantitatieve beoordeling van fluospheres in longweefsel en biodistributie de gastro-intestinale tractus. 30 pl rode fluospheres werden aan de foetale muizenlong na (a) IT of (b) IA injectie in E18 zwangere NMRI muizen om de efficiëntie van het richten vergelijken de foetale muizenlong. Onbehandelde controle foetussen werden gebruikt voor normalisatie van fluorescent achtergrondsignaal. Kernen en actine filamenten werden gekleurd met Hoechst 33258 en Alexa Fluor 488 phalloidin respectievelijk. (C) De relatieve fluorescentie (verhouding rode de blauwe fluorescentie die fluospheres en nucleaire kleuring respectievelijk) werd gekwantificeerd met behulp ImageJ online software. (d) het maag-darmkanaal positief was voor zowel de IT en IA geïnjecteerde dieren. Gemiddelde ± SD, variantie-analyse, Student's t-test, *** p <0,001. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 5. Vergelijking van intratracheale en intra-amniotische injectie na rAAV2/6.2 gemedieerde gentherapie in de foetale long. BLI signaal op 1 week na injectie van rAAV2/6.2 (3 × 10 10 GC / foetus CBA-Fluc) met bijbehorende kwantificering van het totaal foton flux . Alle dieren werden gescand, gescheiden door zwarte wanden, verstrooiing van fotonen te vermijden naburige dieren. De pseudocolor schaal toont de foton flux per seconde, Per vierkante centimeter per steradiaal (p / s / cm 2 / sr). Werden verkregen in een 4,3 cm 2 rechthoekige gebied van belang. Gemiddelde ± SD, variantieanalyse, vergelijkingen voor elk paar met Student's t-test, * p <0,05. Figuur aangepast van Carlon et al.., 2010. Herdrukt met toestemming van Macmillan Publishers Ltd: [Molecular Therapy] (doi: 10.1038/mt.2010.153), auteursrecht (2010). Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 6. Onderscheid tussen een correcte en een onjuiste foetale intratracheale injectie na rAAV2/6.2 gemedieerde gentherapie in de foetale long. Gecombineerd BL-MR-beelden werden verkregen op verschillende dieren geïnjecteerd met rAAV2/6.2 CBA-schommelingen en CBA-LacZnls (3x10 10 GC / foetus per vector) aan een week oud. BL beeldvorming bleek een signaal afkomstig van de nek en de thoracale regio. Co-registratie van MRI met BLI gelegen luciferase genexpressie in de pulmonaire regio na een injectie correct (a), maar in de nek en buikgebied na een onjuiste injectie (b). Histologische analyse bevestigde de in vivo co-registratie. Schaal bar = 100 urn. Figure aangepast van Carlon et al.., 2010. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
| Injectie stof | Injectiemethode | Survival tot levering van een | Overlevingskans van het bevorderen van b | Vroege neonatale overlevingskans c |
| fluospheres | IT | 100 (8/8) </ Td> | na | na |
| IA | 100 (5/5) | na | na | |
| rAAV2/6.2 | IT | 85,3 (64/75) | 62,5 | 53,3 (40/75) |
| IA | 86,3 (44/51) | 86,4 | 74,5 (38/51) |
Tabel 1. De overleving na FOETALE intratracheale EN intra-amniotische injectie. Een Survival tot levering, dat wil zeggen na de foetale chirurgie en bij een keizersnede, voordat het bevorderen van. B Pups werden alleen gestimuleerd als ze waren roze, bewegen en normaal ademt. C De vroege neonatale overlevingskans wordt uitgedrukt als functie van het initiële aantal geïnjecteerde pups. Afkortingen: IT intratracheale injectie; IA Intra-amniotische injectie; nb niet bruikbaar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritische stappen
- De muizenstam we ervoor gekozen om te werken met is NMRI muizen omdat ze een overvloedig aantal pups (gemiddelde nestgrootte 14,4 ± 1,8, eigen gegevens), goed verdragen interventies en hebben goede moederlijke eigenschappen.
- Het plaatsen van de portemonnee koord door de baarmoederwand en de foetale membranen is een cruciale stap als je alleen wilt het foetale hoofd en niet de schouders bloot, anders herpositionering is bijna onmogelijk zonder dat trauma.
- Een optimale positie van de foetushoofd uitgerekt achteren is essentieel om de incisie precies boven de trachea zodat voorkomen grote bloedvaten (halsaders) evenwijdig aan de trachea.
- Het is belangrijk om het inbrengen van de naald visueel volgen in de foetale trachea onder de chirurgische microscoop ingevuld injecties voorkomen.
- Het vervangen van de foetale hoofd in de baarmoeder weg zonder dat trauma is van cruciaal belang als jewillen niet te verwonden van de foetale hoofd, dat intra-uteriene of postnatale mortaliteit zou toenemen.
- De moeder wordt gedood door cervicale dislocatie pas op het tijdstip van de keizersnede, niet met de eerste CO 2 stikken, omdat dit een negatieve invloed hebben op de levensvatbaarheid van de foetussen.
- Cross-het bevorderen leidt tot een hogere overleving van de behandelde foetussen als natuurlijke vaginale bevalling van geopereerde foetussen alleen geleid tot een overlevingskans van 18,6 ± 16,9% ten opzichte van 62 ± 14% voor niet-gespoten pups, in onze handen.
Beperkingen
- Een foetale IT injectie meer tijdrovend te voeren in vergelijking met een IA injectie. Afhankelijk van de ervaring van de chirurg, kunnen 2-4 foetussen per zwangere muis worden gebruikt om te voorkomen dat de moeder muizen worden verdoofd voor meer dan een uur.
- Een volume van 30 pi een maximum te injecteren in de foetale muis trachea. Hoewel sommige lekkage kan worden gedetecteerd immediately na injectie de fluorescentiesignaal in de long hoogste na injectie van 30 pl fluorescerende moleculen zoals getoond in figuur 3.
- De uiteindelijke overleving na IT injectie is lager dan na IA injectie (53,3% en 74,5%), maar dit is vooral te wijten aan een toename van het verlies na cross-bevordering. De vroege overleving geeft aan dat de foetale chirurgische procedure goed verdragen zowel toedieningsroutes (85,3% en 86,3%).
Eventuele wijzigingen en trouble-shooting
- Het is wellicht mogelijk om foetale IT injecties uit te voeren op eerdere tijdstippen dan E18. Foetale chirurgie uitvoeren op eerdere tijdstippen kan voordelig zijn als de foetale immuunsysteem kunnen minder volwassen, die bovendien bevordert immunotolerantie tegen virale vector, therapeutische eiwitten, etc., groeiende stam-en progenitorcellen kan gemakkelijker toegankelijk. Targeting deze cellen zou aanleiding kunnen gevenpermanente genetische correctie. Echter kunnen uitvoeren foetale chirurgie op eerdere tijdstippen het risico op ontwikkeling afwijkingen, die moet worden gecontroleerd.
- Postoperatieve zorg pups IT injectie onderging een foetus, kan nog worden geoptimaliseerd om het verlies aan dieren door kannibalisme verminderen na plaatsing in een nest Foster. Het veranderen van de muis stam van de pleegmoeder zou kunnen helpen. We kozen voor NMRI voor hun goede moederlijke kwaliteiten, maar andere muis stammen zoals Zwitserse muizen misschien zelfs beter te presteren voor het bevorderen van doeleinden.
Toekomstige toepassingen
- De nieuwe chirurgische ingreep om de foetale muizenlong targeten IT injectie kan worden gebruikt voor foetale gentherapie van monogenetische dodelijke aandoeningen zoals Cystic Fibrosis, surfactant deficiëntie en α-1-antitrypsine deficiëntie. Prenatale therapie gunstig zou zijn in deze gevallen, omdat de behandeling wordt gestartvóór het begin van de ziekte en kan onomkeerbare schade. Voorts, indien stamcellen of voorlopercellen kan worden gericht, kan een permanente correctie theoretisch worden verkregen, aangezien deze cellen zou voortdurend bieden nakomelingen expressie het defect eiwit.
- Afgezien van genetische aandoeningen die een levenslange correctie, zou foetale interventies gericht op een tijdelijke therapeutisch effect van nut zijn voor mogelijke behandelingen studeren voor vroeggeboorte waar de onderontwikkelde longen behoefte aan een tijdelijke genexpressie van oppervlakte-actieve stof, VEGF (voor longrijping en neo-vascularisatie), of anti-oxidant eiwitten bijvoorbeeld superoxide dismutase.
- Deze procedure kan verder gebruikt worden om verbindingen of toxinen in utero leveren voor het genereren ziektemodellen. Bijvoorbeeld lipopolysaccharide behandeling nabootsen intra-uterine infectie, kan worden gegeven in utero te interfereren met foetale long, hetgeen zorgt voor een verminderde postnatal longfunctie te wijten aan aanhoudende chronische ontsteking en structurele afwijkingen 19.
Betekenis van de techniek met betrekking tot de bestaande methoden
- Door de specifieke targeting van de foetale luchtwegen, een hogere transductie efficiëntie van de luchtwegen en alveoli kan worden verkregen na injectie van virale vectoren, vergeleken met de bestaande IA injectiemethode. Wanneer virale vector titers beperkend (bijv. met lentivirale vectoren), IT injectie verdunning van de geïnjecteerde vector voorkomen in het vruchtwater om de hoeveelheid vector deeltjes in de longen te maximaliseren.
- Voorkomen na verdunning foetale productietijd is ook voordelig voor andere bioactieve middelen, zoals recombinant eiwit of stamcellen kunnen worden verlaagd vanwege de kleinere hoeveelheid bioactieve stof noodzakelijk is voor injectie in vergelijking met injectie IA.
- Foetale IT injection is onafhankelijk van foetale ademhalingsbewegingen, die beginnen te komen op E14, maar zijn variabel tussen individuele dieren 20. Dit leidt tot veel variatie in opname tussen de IA geïnjecteerd foetussen, die kan worden verminderd door IT injectie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
MC en AVDP zijn docs ondersteund door subsidies van het Instituut voor de Aanmoediging van Innovatie door Wetenschap en Technologie in Vlaanderen (IWT-Vlaanderen). JT heeft een part-time Clinical Research Fellowship (Koor) van UZ Leuven. DV is een doctoraal onderzoeker ondersteund door een subsidie van de KU Leuven, DBOF/10/062. MMDC is een doctoraal onderzoeker ondersteund door een subsidie van Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento (CNPq) en Erasmus Mundus. Onderzoek werd gefinancierd door IWT-Vlaanderen, door de EG-subsidie DIMI (LSHB-CT-2005-512.146 duizend) en door de in vivo moleculaire beeldvorming Onderzoeksgroep (Imir) van de KU Leuven. We willen graag de UPenn Vector Core opgericht door James M. Wilson voor hun vriendelijke gave van de AAV6.2 inpakplasmide voor rAAV vector productie te erkennen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NMRI mice | Janvier, Le Genest St Isle, France | ||
| Isoflurane | Isoba, Intervet / Schering-Plough Animal Health, Milton Keynes, UK | ||
| Prolene 6-0 | Ethicon, Groot Bijgaarden, Belgium | ||
| Vicryl 5-0 | Ethicon, Groot Bijgaarden, Belgium | ||
| 50 μl Hamilton Glass Syringe, Model 1710.5 TLLX SYR | Hamilton, Reno, NV, USA | 5495-20 | |
| 30G sharp needle | Hamilton, Reno, NV, USA | 7762-03 | |
| 2% xylocaine | AstraZeneca, Zoetermeer, The Netherlands |
References
- Willson, D. F., Notter, R. H. The future of exogenous surfactant therapy. Respir. Care. 56, 1369-1388 (2011).
- Abdel-Latif, M. E., Osborn, D. A. Intratracheal Clara cell secretory protein (CCSP) administration in preterm infants with or at risk of respiratory distress syndrome. Cochrane Database Syst. Rev. CD008308, (2011).
- Thebaud, B. Vascular endothelial growth factor gene therapy increases survival, promotes lung angiogenesis, and prevents alveolar damage in hyperoxia-induced lung injury: evidence that angiogenesis participates in alveolarization. Circulation. 112, 2477-2486 (2005).
- Griesenbach, U., Alton, E. W. Gene transfer to the lung: lessons learned from more than 2 decades of CF gene therapy. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 128-139 (2009).
- Aneja, M. K., Rudolph, C. Gene therapy of surfactant protein B deficiency. Curr. Opin. Mol. Ther. 8, 432-438 (2006).
- Flotte, T. R., Mueller, C. Gene therapy for alpha-1 antitrypsin deficiency. Hum. Mol. Genet. 20, R87-R92 (2011).
- Roybal, J. L., Santore, M. T., Flake, A. W. Stem cell and genetic therapies for the fetus. Semin Fetal Neonatal Med. 15, 46-51 (2010).
- Peebles, D. Widespread and efficient marker gene expression in the airway epithelia of fetal sheep after minimally invasive tracheal application of recombinant adenovirus in utero. Gene Ther. 11, 70-708 (2004).
- Deprest, J., Gratacos, E., Nicolaides, K. H. Fetoscopic tracheal occlusion (FETO) for severe congenital diaphragmatic hernia: evolution of a technique and preliminary results. Ultrasound Obstet. Gynecol. 24, 121-126 (2004).
- Buckley, S. M. Intra-amniotic delivery of CFTR-expressing adenovirus does not reverse cystic fibrosis phenotype in inbred CFTR-knockout mice. Mol. Ther. 16, 819-824 (2008).
- Davies, L. A. Adenovirus-mediated in utero expression of CFTR does not improve survival of CFTR knockout mice. Mol. Ther. 16, 812-818 (2008).
- Mitchell, M., Jerebtsova, M., Batshaw, M. L., Newman, K., Ye, X. Long-term gene transfer to mouse fetuses with recombinant adenovirus and adeno-associated virus (AAV) vectors. Gene Ther. 7, 1986-1992 (2000).
- Henriques-Coelho, T. Targeted gene transfer to fetal rat lung interstitium by ultrasound-guided intrapulmonary injection. Mol. Ther. 15, 340-347 (2007).
- Toelen, J. Fetal gene transfer with lentiviral vectors: long-term in vivo follow-up evaluation in a rat model. Am J Obstet Gynecol. 196, e1-e6 (2007).
- Waddington, S. N. Long-term transgene expression by administration of a lentivirus-based vector to the fetal circulation of immuno-competent mice. Gene Ther. 10, 1234-1240 (2003).
- Waddington, S. N. Permanent phenotypic correction of hemophilia B in immunocompetent mice by prenatal gene therapy. Blood. 104, 2714-2721 (2004).
- Senoo, M. Adenovirus-mediated in utero gene transfer in mice and guinea pigs: tissue distribution of recombinant adenovirus determined by quantitative TaqMan-polymerase chain reaction assay. Mol. Genet. Metab. 69, 269-276 (2000).
- Carlon, M. Efficient gene transfer into the mouse lung by fetal intratracheal injection of rAAV2/6.2. Mol. Ther. 18, 2130-2138 (2010).
- Schmiedl, A. Lipopolysaccharide-induced injury is more pronounced in fetal transgenic ErbB4-deleted lungs. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol Physiol. 301, L490-L499 (2011).
- Buckley, S. M. Factors influencing adenovirus-mediated airway transduction in fetal mice. Mol. Ther. 12, 484-492 (2005).
