Summary
Hemos desarrollado un enfoque quirúrgico novedoso para la administración intratraqueal de agentes bioactivos en el feto de ratón. La ruta de entrega es más eficiente en la orientación de los pulmones fetales de ratón que el comúnmente utilizado intraamniótica inyección. Este procedimiento hasta la fecha no se ha descrito en un modelo de ratón.
Abstract
Entrega Prenatal pulmonar de células, genes o agentes farmacológicos podrían ser la base de nuevas estrategias terapéuticas para una variedad de enfermedades genéticas y adquiridas. Aparte de las anomalías congénitas o heredadas con el requisito de que a largo plazo la expresión del gen entregado, varias organizaciones no heredadas afecciones perinatales, donde a corto plazo la expresión génica o la intervención farmacológica es suficiente para lograr efectos terapéuticos, son considerados como posibles indicaciones futuras de este tipo de enfoque. Enfermedades candidatas para la aplicación de la terapia a corto plazo prenatal podría ser la deficiencia neonatal transitoria de la proteína surfactante B causando neonatal 1,2 síndrome de dificultad respiratoria o lesiones hyperoxic del pulmón neonatal 3. Enfermedades candidatos para la corrección terapéutica permanente son la fibrosis quística (FQ) 4, 5 variantes genéticas de deficiencia de surfactante y α1-antitripsina 6.
<clase p = "jove_content"> En general, una ventaja importante de la terapia génica prenatal es la capacidad de iniciar una intervención terapéutica temprana en el desarrollo, en o incluso antes de que las manifestaciones clínicas en el paciente, evitando así daños irreparables a la persona. Además, los órganos fetales tienen una mayor tasa de proliferación celular en comparación con órganos de adultos, que podrían permitir un gen más eficiente o transferencia de células madre en el feto. Además, en la entrega de genes útero se realiza cuando el sistema inmune del individuo no es completamente maduro. Por lo tanto, el trasplante de células heterólogas o la suplementación de una proteína no funcional o ausente con una versión correcta no debería causar sensibilización inmune a la célula, el vector o producto transgénico, que ha sido recientemente demostrado ser el caso con las terapias celulares y genéticos 7 .En el presente estudio, se investigó el potencial para tratar directamente la tráquea fetal en un ratón modelo. Este procedimiento está en uso en modelos animales más grandes tales como conejos y ovejas 8, e incluso en un entorno clínico 9, pero hasta la fecha no se ha realizado antes en un modelo de ratón. Cuando se estudia el potencial de la terapia génica fetal de enfermedades genéticas tales como la fibrosis quística, el modelo de ratón es muy útil como una primera prueba de concepto a causa de la amplia disponibilidad de diferentes cepas de ratones transgénicos, la embriogénesis bien documentado y el desarrollo fetal, menos estrictos normas éticas, gestación corta y el tamaño de la camada de gran tamaño.
Diversas vías de acceso se han descrito para dirigir el pulmón fetal de roedores, incluyendo la inyección intra-amniótico 10-12, (guiada por ultrasonido) intrapulmonar 13,14 inyección y la administración intravenosa en los vasos del saco vitelino 15,16 o vena umbilical 17. Nuestro procedimiento quirúrgico novedoso permite a los investigadores para inyectar el agente de elección directamente en la tráquea fetal de ratón que permitepara una entrega más eficaz de las vías respiratorias que las técnicas existentes 18.
Protocol
1. El apareamiento de ratones obtener escenario deseado embarazo
Tiempo ratones NMRI compañero embarazadas de manera que sean de 18 días (E18) embarazadas (E19.5 de gestación total) en el momento de la cirugía. Antes y después de la cirugía que se alojan en jaulas filtro superior a la temperatura normal de la habitación y la luz del día normal, con libre acceso a agua y comida.
2. Fetal intratraqueal (IT) Inyección (Figura 1)
- Primero envíe la embarazada ratón NMRI a anestesia general con 1,5% de isoflurano en una mezcla de O 2 a 1,5 L / min. El nivel de isoflurano depende de la edad y la cepa del ratón, pero en general isoflurano debe estar a un nivel que pone a los animales en el estado anestésico. Luego ponga el ratón embarazada en una almohadilla de calefacción (37 ° C) para mantener la temperatura corporal durante cirugía.
- El procedimiento quirúrgico se realiza todo por dos cirujanos. Un cirujano realiza la disección del ratón embarazada y su posterior exposición de the feto para la inyección intratraqueal. El segundo cirujano realizará la inyección intratraqueal fetal sí mismo. El procedimiento quirúrgico se lleva a cabo utilizando instrumentos estériles y una técnica aséptica.
- Desinfecte el abdomen con yoduro de povidona y realizar una laparotomía media para exponer el útero grávido. Exteriorizar un cuerno uterino a la vez y contar el número de sacos gestacionales. Un feto por la bocina está operado y elegidos en base a la posición óptima para la exteriorización de la cabeza fetal en los pasos subsiguientes. El feto más adecuado es seleccionado por visualización a través de la pared uterina. La nariz de la cabeza fetal debe apuntar hacia el cirujano que va a inyectar en la tráquea después de la exposición de la cabeza del feto y de fijación hacia atrás (como se explica en el paso subsiguiente 2,5).
- En primer lugar pasar un 6-0 polipropileno (Prolene) sutura en bolsa de aproximadamente 1 cm de diámetro a través de la pared del útero y las membranas fetales (amniótico membrane y parietal saco vitelino) sobre el área donde más tarde en la cabeza del feto se expone a través de. Esta sutura se mantiene fijo el feto dentro del útero a partir del los hombros. A continuación, hacer una incisión en el útero en el interior de la bolsa de tabaco de aproximadamente 0,8 cm con unas tijeras afiladas.
- Apriete suavemente la cabeza y el cuello del feto a través de la histerotomía. Tire de la sutura en bolsa suavemente apretado alrededor del cuello y lo fijan en posición con 2 Micro-Mosquito forceps. La cabeza fetal se mantiene en hiperextensión por un 5-0 poliglactina 910 (Vicryl) sutura en dos pinzas colocadas en la boca alrededor de la mandíbula superior.
- Bajo el microscopio estereoscópico zoom (ampliación x10) de la tráquea fetal se visualiza haciendo una incisión en el cuello vertical utilizando disección aguda y roma. La incisión en la región del cuello es de aproximadamente 5 mm de largo. Se trata de una incisión superficial, como el tejido subyacente se ve diseccionado utilizando disección roma para llegar a la tráquea.
- Para volver a colocar la cabeza en el útero, aplique una presión suave sobre la nariz. El cuello primero sigue en el útero, seguido por la cabeza. La nariz va en pasado. A continuación, cierre la histerotomía apretando la bolsa de tabaco. Después inyectar un total de aproximadamente 0,5 ml de solución fisiológica en la cavidad amniótica para prevenir oligohidramnios. Para ello, inserte una aguja en la incisión dentro de la bolsa de tabaco. A continuación, cerrar la sutura alrededor de la aguja, después de lo cual se inyecta solución salina. En una última etapa, retraer la aguja, seguido de cerrar completamente el pUrse cadena.
- Cierre la pared materna abdominal (el peritoneo y la capa muscular interna y externa) y de la piel con una sutura Vicryl 5-0 ejecuta en dos capas separadas. A partir de entonces, se infiltran en la incisión con 0,2% de xilocaína para el alivio del dolor post-operatorio. Se recomienda el uso de la buprenorfina (0,05 - 0,1 mg / kg SC o IP) para el alivio del dolor post-operatorio. Ni los tocolíticos profilácticos ni antibióticos se utilizan. Los ratones se mantienen en una almohadilla de calefacción (37 ° C) hasta que se recupere completamente (aproximadamente 1 hora).
3. Fetal intra-amniótica (IA) Inyección
- Ver 2.1
- Desinfecte el abdomen con yoduro de povidona y realizar una laparotomía media para exponer el útero grávido. Exteriorizar un cuerno uterino a la vez y contar el número de sacos gestacionales.
- Inyección IA se puede realizar en todos los fetos, ya que toma menos tiempo para realizar. Además, la posición del feto no es críticacal en comparación con la inyección intratraqueal. A medida que la pared uterina es semi-transparente, las estructuras fetales, como la cabeza, las extremidades y la posición de la cola y de la placenta son bien visibles.
- Usando la misma aguja y jeringa como anteriormente (2,7), inyectar 30 l de sustancia en las proximidades de la boca fetal. Esto se puede hacer más fácilmente, tanto entre la cabeza del feto y las extremidades anteriores, o entre los miembros inferiores y de la cola. La inyección se realiza solamente después de un examen cuidadoso de la posición de la aguja, para asegurar que no hay estructuras fetales están en contacto con la punta en el momento de la inyección.
- El útero se vuelve a colocar en el abdomen y la pared abdominal y la piel se cerró como se describió anteriormente (2,9).
4. Evaluación de fetos inyectados y el fomento de la Cruz-
- Mata a la presa usando un método aprobado eutanasia 36 horas después de la intervención fetal (en E19.5). La dislocación cervical sin adicionalanestesia sería el mejor método, ya que todas las demás formas de eutanasia que incluyen anestesia (por ejemplo, isoflurano, pentobarbital) será anestesiar o incluso matar a los fetos, que querría evitar en todo momento. Entregar los fetos operadas sobre por cesárea. Los fetos de accionamiento se identifican en el útero por su posición. Bolsas amnióticas se numeran a partir de finales de los ovarios al útero bicorne.
- Después del parto, los siguientes criterios se utilizan para evaluar la viabilidad de los fetos: la presencia de (1) un latido del corazón, (2) color de piel rosa (frente cianótico) y (3) los movimientos espontáneos. Coloque las crías sólo cumplían estos criterios en la cama de una madre adoptiva que contiene de un día de edad los cachorros. Por experiencia sabemos que los cachorros con un tiempo débil del corazón, color de la piel cianótica y / o mínimos movimientos espontáneos no suelen sobrevivir debido al rechazo de la basura de la madre de crianza o por canibalismo maternal.
- Después del parto ofa tinte visible a través de ella o inyección IA (por ejemplo, moléculas fluorescentes rojos), es posible asegurar una inyección correcta por la presencia de este colorante (color rosa de las fluospheres inyectados en rojo) en la torácica (por inyección directa en los pulmones después de que se inyección, o por inhalación en los pulmones después de la inyección IA) o de la cavidad abdominal (por ingestión). Esto es posible debido al hecho de que los ratones recién nacidos son semi-transparente que permite la evaluación in vivo de los pulmones y el estómago.
- Marque los cachorros correctamente inyectado con tinta china por vía subcutánea por encima de la base de la cola. Coloque todos los cachorros que cumplan los requisitos mencionados en el apartado 4.2 en la cama de la madre de crianza.
- Para asegurar la máxima aceptación y la supervivencia de las crías operadas en adelante, no dejan lugar a más de 10 crías en total en la cama de la madre de crianza (tanto propias sus crías 1 día de edad, así como a las crías cruzadas impulsadas). Antes de colocar el cachorro operadas ens en la cama de la madre adoptiva, cúbralas con material de cama de la madre adoptiva, que contiene tanto sus heces y orina para enmascarar los olores no familiares.
- Coloque la jaula en un entorno tranquilo y no molestar a la basura por lo menos durante 12 horas (durante la noche).
- Al día siguiente, evalúe cuidadosamente la tasa de supervivencia de fomentar contando todos los cachorros, por lo que la distinción entre las crías de la madre de crianza de las crías y operado-ON (marcado con tinta china y en promedio menor que los otros cachorros). Reducir al mínimo el tiempo de manipulación de estos cachorros para evitar el rechazo de la madre y para evitar la hipotermia. En general, si los cachorros no tienen nada de leche en el estómago (que es visible debido a la naturaleza semi-transparente de los cachorros recién nacidos), el pronóstico es muy malo para la supervivencia más allá de estos animales.
5. Los resultados representativos
El esquema general del experimento se muestra en la Figure 2.
Determinación del volumen óptimo para la inyección intratraqueal
Para determinar el volumen óptimo para la inyección IT, se eligió empíricamente volúmenes diferentes que van desde 10, 20 hasta 30 l (n = 3/volume). Para la detección fácil, se optó por inyectar moléculas fluorescentes (rojo fluospheres, Molecular Probes, Leiden, Países Bajos) tamaño mediano de 100 nm. Después de la inyección IT en E18 fetos viejos, los pulmones se cosecharon 24 horas más tarde, se fijaron en paraformaldehído al 4% durante la noche a 4 ° C y 6 micras secciones congeladas se hicieron. Filamentos de actina y los núcleos se tiñeron con Hoechst 33258 (Sigma-Aldrich, Bornem, Bélgica) y Alexa Fluor 488 phalloidin (Invitrogen, Merelbeke, Bélgica), respectivamente, durante 20 min a temperatura ambiente. Confocal de imágenes se realizaron utilizando un Resplandor Biorad 2100 microscopio confocal con LaserSharp2000.6 software por Carl Zeiss. La fluorescencia relativa (relación de rojo a azul fluospheres de fluorescencia que representan y stainin nuclearg, respectivamente) fue cuantificado usando ImageJ software en línea (Figura 3). Aunque en el momento de la cirugía fetal, un flujo de retorno sólo se detectó después de la inyección de 30 l, lo que indica un exceso de fluidos inyectados, 30 l dio la mayor cantidad de señal fluorescente en el parénquima pulmonar tal como se cuantifica mediante la medición de la fluorescencia relativa (análisis de varianza , comparaciones para cada par utilizando la t de Student prueba, * p <0,05, *** p <0,001).
La evaluación cuantitativa de fluospheres en el tejido pulmonar y la biodistribución en el tracto gastro-intestinal
A continuación, hemos querido comparar la eficiencia de la focalización del pulmón fetal de ratón después de IT versus inyección IA. Para ello, 30 l de fluospheres fueron entregados al pulmón de ratón fetal después de IT o inyección IA E18 en embarazadas ratones NMRI (n = 5 por grupo). IT inyección resultó en una entrega significativamente mayor de fluospheres al pulmón fetal en comparación con la AI. ruta (1,43 ± 0,56 y 0,05 ± 0,02 fluorescencia relativa (relación de fluospheres a Hoechst respectivamente, el análisis de la varianza, t de Student prueba, *** p <0,001) (Figuras 4 ac). fetos control sin tratar se utiliza para la normalización de fluorescente la señal de fondo. el tracto gastro-intestinal fue positiva tanto para la IT y los animales inyectados (Figura IA 4 d). No se observó fluorescencia roja en otros tejidos de los fetos tratados o en los animales de control negativos (datos no presentados).
Comparación de la inyección intratraqueal e intra-amniótico después de la entrega de genes mediada por rAAV2/6.2 en el pulmón fetal
Después de comparar ambos métodos de entrega mediante la inyección de moléculas fluorescentes, hemos querido evaluar la eficiencia de la transducción viral y la expresión génica posterior después de la inyección IA de TI y el uso de vectores rAAV. rAAV2/6.2 codifica la luciferasa de luciérnaga (fluctuaciones) (3x10 10 GC / feto)bajo el control de la pollo-β-actina (CBA), el promotor se inyectó IT (n = 8) o IA (n = 6) en ratones NMRI fetal en E18. Después de la cesárea y el fomento, sobreviviendo cachorros fueron seguidas por imágenes de bioluminiscencia no invasiva (BLI) y seguimiento de la actividad Fluc (fotones / segundo, p / s) a 1 semana de edad (Figura 5). El flujo total de fotones para el grupo de TI fue significativamente mayor que en el grupo IA y el control negativo (análisis de la varianza, comparaciones para cada par utilizando la t de Student prueba, * p <0,05). El promedio de la señal BLI en el grupo IA no fue significativamente mayor que en el grupo control negativo.
Distinción entre una correcta y una incorrecta inyección intratraqueal fetal
Distinción entre una correcta y incorrectI.T un archivo. inyección puede ser evaluado en varios niveles. En el punto de tiempo de la cirugía, durante la inyección en la tráquea fetal, ni resistencia se notará cuando el Needle está colocado en la tráquea. Sin embargo, una mayor resistencia se notará cuando se inyecta en el espacio paratraqueal. En segundo lugar, en la cesárea ya que el feto es semi-transparente, es posible ver los pulmones y posteriormente la presencia de un colorante visible (por ejemplo, tinta china, moléculas fluorescentes). La última opción de evaluar una inyección correcta es por imágenes ópticas y más concretamente imágenes de bioluminiscencia. BLI es un elegante sistema de manera no invasiva la expresión de genes de seguimiento del gen de la luciferasa de luciérnaga reportero, pero la resolución espacial y la información anatómica son limitados. La resonancia magnética (RM) ofrece alta resolución, imágenes tomográficas con información anatómica detallada. Por lo tanto, se investigó la combinación de BLI con resonancia magnética para obtener una imagen de superposición, que combina la señal de BLI superficie con una visualización de las estructuras más profundas anatómicos (órganos internos). Nuestro objetivo era obtener información más detallada en vivo de los localesción de la expresión génica para ser capaz de distinguir un correcto desde un mal inyección IT.
Combinado BL-MR imágenes fueron adquiridas en varios animales inyectados con IT rAAV2/6.2 CBA-Fluc y LacZnls CBA-(3x10 10 GC / feto para cada vector, n = 10) con una semana de edad (Figura 6). BL imágenes reveló una señal que emana desde el cuello y en la región torácica. Co-registro de IRM con BLI encuentra la expresión del gen de la luciferasa en la región pulmonar después de una inyección correcta (Figura 6 a), pero en el cuello y la zona abdominal después de una inyección incorrecto (Figura 6 b). El análisis histológico de X-gal tinción confirmado in vivo la co-registro.
La supervivencia después de la inyección intratraqueal e intra-amniótico
- Fluoroesferas
La supervivencia de la entrega de E18 fetos viejos NMRI inyectado TI o IA con 30 l 100 nm rojo FLUORESCENmoléculas de t fue del 100% en ambos grupos y se definió como el número de fetos vivos inyectados en el momento de la cosecha, 24 hr después del procedimiento quirúrgico fetal (Tabla 1). - rAAV vector
La supervivencia de la entrega de los fetos inyecta IT o IA con rAAV2/6.2, que se define como el número de fetos vivos en el punto de tiempo después de la inyección de cesárea 36h fetal, era 85,3% y 86,3%, respectivamente (Tabla 1). La tasa de supervivencia neonatal temprana fue de 53,3% (IT) y 74,5% (IA), respectivamente, y se calculó mediante la correlación del número de crías vivas 1 día después de la promoción con el número inicial de fetos inyectados. Para obtener estas tasas de supervivencia final, se optimiza la quirúrgica perioperatoria protocolo procedimiento mediante el uso de (1) como anestesia de inhalación de isoflurano en lugar de la administración de una mezcla de ketamina (75 mg / kg IP) y medetomidina (1 mg / kg IP) , (2) una almohadilla caliente para prevenir la hipotermia durante la cirugía, (3),un microscopio estereoscópico zoom y (4) los operadores obtener más experiencia con el procedimiento quirúrgico.
Figura 1. Inyección intratraqueal en ratones fetales E18. En esta figura, los principales pasos del procedimiento quirúrgico para la inyección IT fetal se representan. En un primer paso de un cuerno uterino se exterioriza. En un siguiente paso, una sutura en bolsa se pasa a través de la pared uterina y las membranas fetales (membrana amniótica y parietal saco vitelino) sobre el área donde más tarde en la cabeza del feto se expone a través de. A continuación, la cabeza y el cuello del feto se exteriorizó a través de la histerotomía, después de lo cual la cabeza del feto se mantiene en hiperextensión por un 5-0 poliglactina 910 de sutura en dos pinzas entre las mordazas. Bajo el microscopio estereoscópico zoom (ampliación x10) de la tráquea fetal se visualiza al hacer una incis cuello verticalesion con disección cortante y contundente. En una última etapa, un volumen total de 30 l de sustancia se inyecta en la tráquea bajo visión directa a través del microscopio estereoscópico zoom.
Figura 2. Panorama general del experimento.
Figura 3. Determinación del volumen óptimo para la inyección intratraqueal. Para determinar el volumen óptimo para la inyección IT, 10, 20 o 30 l (n = 3/volume) de fluospheres rojos de tamaño 100 nm se administraron en E18 fetos viejos y los pulmones se cosecharon 24 h más tarde. Filamentos de actina y núcleos se tiñeron con Hoechst 33258 y Alexa Fluor 488 phalloidin respectivamente. La fluorescencia relativa (relación entre la fluorescencia roja a azul que representa fluosphEres y tinción nuclear, respectivamente) se cuantificó usando ImageJ software en línea. Media ± SD, análisis de varianza, comparaciones para cada par utilizando la t de Student prueba, * p <0,05, *** p <0,001.
Figura 4. La evaluación cuantitativa de fluospheres en el tejido pulmonar y la biodistribución en el tracto gastro-intestinal. 30 l de fluospheres rojos fueron entregados al pulmón fetal de ratón después de (a) o (b) la inyección IA en E18 embarazadas ratones NMRI para comparar la eficiencia de la focalización el pulmón fetal de ratón. Fetos control sin tratar se utiliza para la normalización de la señal de fondo fluorescente. Filamentos de actina y los núcleos se tiñeron con Hoechst 33258 y Alexa Fluor 488 phalloidin, respectivamente. (C) La fluorescencia relativa (relación de rojo a la fluorescencia azul que representa fluospheres y la tinción nuclear, respectivamente) se cuantificó usando el software ImageJ en línea. (d) El tracto gastro-intestinal fue positiva tanto para la TI y de los animales inyectados IA. La media ± desviación estándar, análisis de varianza, t de Student-test, *** p <0,001. Haga clic aquí para ampliar la cifra .
Figura 5. Comparación de la inyección intratraqueal e intra-amniótico después de la entrega de genes mediada por rAAV2/6.2 en el pulmón fetal. Señal BLI menos 1 semana después de la inyección de rAAV2/6.2 (3 x 10 10 GC / feto CBA-Fluc) con cuantificación correspondiente de flujo total de fotones . Todos los animales fueron escaneados, separados por particiones negro, para evitar la dispersión de los fotones para los animales vecinos. La escala pseudocolor representa el flujo de fotones por segundo, Por centímetro cuadrado por estereorradián (p / s / cm 2 / sr). Las mediciones se obtuvieron en un 4,3 cm 2 región rectangular de interés. Media ± SD, análisis de varianza, comparaciones para cada par utilizando la t de Student prueba, * p <0,05. Figura adaptada de Carlon et al., 2010. Reproducido con permiso de Macmillan Publishers Ltd: [Terapia Molecular] (doi: 10.1038/mt.2010.153), derecho de autor (2010). Haga clic aquí para ampliar la cifra .
Figura 6. Distinción entre una correcta y una incorrecta inyección intratraqueal fetal después de la entrega de genes mediada rAAV2/6.2 en el pulmón fetal. Combinado BL-MR imágenes fueron adquiridas en varios animales inyectados con IT rAAV2/6.2 CBA-Fluc y CBA-LacZnls (3x10 10 GC / feto para cada vector) en una semana de edad. BL imágenes reveló una señal que emana desde el cuello y en la región torácica. Co-registro de IRM con BLI encuentra la expresión del gen de la luciferasa en la región pulmonar después de una inyección correcta (a), pero en el cuello y la zona abdominal después de una inyección incorrecta (b). El análisis histológico confirmó la in vivo co-registro. Barra de escala = 100 micras. Figura adaptada de Carlon et al., 2010. Haga clic aquí para ampliar la cifra .
| Inyección de sustancia | Inyección método | La supervivencia a un parto | Tasa de supervivencia de fomentar b | Neonatal precoz tasa de supervivencia c |
| fluospheres | Informática | 100 (8.8) </ Td> | na | na |
| IA | 100 (5/5) | na | na | |
| rAAV2/6.2 | Informática | 85,3 (64/75) | 62,5 | 53,3 (40/75) |
| IA | 86,3 (44/51) | 86,4 | 74,5 (38/51) |
Tabla 1. La supervivencia después de la inyección intratraqueal FETAL Y intra-amniótica. Una supervivencia de la entrega, es decir, después de la cirugía fetal y en la cesárea, antes de acogimiento. Pups b se fomentaron sólo si eran de color rosa, moviéndose y respirando normalmente. C La tasa de supervivencia neonatal precoz se expresa como una función del número inicial de las crías inyectados. Abreviaturas: IT inyección intratraqueal, IA intra-amniótica de la inyección; na no aplicable.
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Discussion
Los pasos críticos
- La cepa de ratón se optó por trabajar con ratones NMRI es porque tienen un abundante número de crías (tamaño medio de la camada 14,4 ± 1,8, datos propios), tolerar intervenciones bien y tienen buenas características maternas.
- Colocación del cordón de bolsa a través de la pared del útero y las membranas fetales es un paso fundamental, ya que sólo quieren exponer la cabeza del feto y no los hombros, de lo contrario es casi imposible reposición sin causar trauma.
- Una posición óptima de la cabeza fetal se extendía hacia atrás es esencial para hacer la incisión exactamente por encima de la tráquea para que evitar los grandes vasos sanguíneos (venas yugulares) paralela a la tráquea.
- Es importante seguir visualmente la inserción de la aguja en la tráquea fetal bajo el microscopio quirúrgico para evitar inyecciones incorrectas.
- Reemplazo de la cabeza del feto en el saco uterino sin causar trauma es fundamental, ya quequieren evitar lesiones de la cabeza fetal, lo que aumentaría la mortalidad intrauterina o postnatal.
- La madre se sacrificaron por dislocación cervical sólo en el punto momento de la cesárea, no con CO 2 inicial asfixia, ya que esto podría influir negativamente en la viabilidad de los fetos.
- Adopción cruzada conduce a una mayor supervivencia de los fetos tratados como el parto normal vaginal de fetos operados sólo condujo a una tasa de supervivencia del 18,6 ± 16,9% frente a 62 ± 14% para los no inyectados cachorros, en nuestras manos.
Limitaciones
- Una inyección fetal TI requiere más tiempo para llevar a cabo frente a una inyección IA. Dependiendo de la experiencia del cirujano, 2-4 fetos por ratón embarazada puede ser operado para evitar que los ratones anestesiados ser madre durante más de una hora.
- Un volumen de 30 l es un máximo para inyectar en la tráquea fetal de ratón. Aunque algo de filtración pueden ser detectados immediately después de la inyección, la señal fluorescente en el pulmón después de la inyección es mayor de 30 moléculas fluorescentes mu l como se muestra en la figura 3.
- La tasa de supervivencia final después de que la inyección es menor que después de la inyección IA (53,3% y 74,5%), pero esto se debe principalmente a un aumento de la pérdida después de adopción cruzada. La tasa de supervivencia temprana indica que el procedimiento quirúrgico fetal es bien tolerado para ambas rutas de entrega (85,3% y% 86,3).
Las posibles modificaciones y resolución de problemas
- Puede ser que sea posible llevar a cabo fetales TI inyecciones en puntos de tiempo anteriores que E18. Realización de la cirugía fetal en puntos de tiempo anteriores podría ser ventajoso ya que el sistema inmune fetal podría ser menos madura, que promueve la tolerancia inmune contra vectores virales, proteínas terapéuticas, etc Además, la expansión de las células madre y progenitoras pueden ser más fácilmente accesibles. Orientación de estas células puede dar lugarpara la corrección genética permanente. Sin embargo, la realización de la cirugía fetal en puntos de tiempo anteriores podría aumentar el riesgo de aberraciones de desarrollo, que tiene que ser controlada para.
- El cuidado postoperatorio de las crías que se sometieron a inyección IT como un feto, se podría optimizar aún más a reducir la pérdida de los animales debido al canibalismo después de colocarlas en un nido de crianza. Cambio de la cepa de ratón de la madre adoptiva podría ayudar. Elegimos NMRI por sus cualidades maternas buenas pero otras cepas de ratón, como los ratones suizos podría ser aún más eficaces para fomentar los propósitos.
Las aplicaciones futuras
- El procedimiento quirúrgico novedoso para dirigir el pulmón fetal de ratón por inyección IT se puede utilizar para la terapia génica fetal de trastornos monogénicos letales tales como la fibrosis quística, la deficiencia de agente tensioactivo y la deficiencia de α-1-antitripsina. Terapia prenatal sería beneficiosa en estos casos porque el tratamiento se iniciaantes de la aparición de la enfermedad y puede prevenir el daño irreversible. Además, si las células madre o progenitoras pueden ser dirigidos, una corrección permanente teóricamente se podría obtener, ya que estas células continuamente proporcionaría progenie que expresa la proteína defecto.
- Aparte de trastornos genéticos que requieren una corrección permanente, intervenciones fetales objeto de obtener un efecto terapéutico transitoria sería de uso para estudiar posibles opciones de tratamiento para la prematuridad cuando los pulmones subdesarrollados requieren la expresión génica temporal de tensioactivo, VEGF (para la maduración pulmonar y neo vascularización-), o anti-oxidantes, por ejemplo, proteínas de la superóxido dismutasa.
- Este procedimiento puede además ser utilizado para administrar compuestos o toxinas en el útero para la generación de modelos de enfermedad. Por ejemplo, el tratamiento lipopolisacárido, imitando la infección intrauterina, se puede dar en el útero para interferir con el desarrollo del pulmón fetal, lo que conduce a una disminución de postnatal función pulmonar debido a la inflamación crónica persistente y anomalías estructurales 19.
Importancia de la técnica con respecto a los métodos existentes
- Debido a la orientación específica de las vías respiratorias del feto, una eficiencia de transducción más alta de las vías respiratorias y los alvéolos se puede conseguir después de la inyección de vectores virales, en comparación con el método de inyección existente IA. Cuando los títulos virales del vector son limitados (por ejemplo, con vectores lentivirales), la inyección IT impedirá que la dilución del vector inyectado en el fluido amniótico para maximizar la cantidad de partículas de vector en los pulmones.
- Evitar la dilución después de la entrega fetal también es ventajoso para otros agentes bioactivos tales como proteína recombinante o de células madre como los costos pueden reducirse debido a la menor cantidad de sustancia bioactiva necesaria para la inyección IT en comparación con la inyección IA.
- Fetal IT injection es independiente de los movimientos respiratorios fetales, que comienzan a producirse a E14 pero son variables entre animales individuales 20. Esto da lugar a una gran cantidad de variación en la absorción entre los fetos IA inyectados, que pueden reducirse por inyección IT.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
MC y AVDP son becarios de doctorado apoyados por subvenciones del Instituto para el Fomento de la Innovación mediante la Ciencia y la Tecnología en Flandes (IWT-Vlaanderen). JT tiene una beca a tiempo parcial Investigación Clínica (KOOR) de UZ Leuven. DV es un compañero de doctorado con el apoyo de una subvención de KU Leuven, DBOF/10/062. MMDC es un compañero de doctorado con el apoyo de una subvención del Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento (CNPq) y Erasmus Mundus. La investigación fue financiada por IWT-Vlaanderen, por el DIMI CE subvención (LSHB-CT-2005 a 512,146) y por el In vivo Molecular Imaging Research grupo (Imir) de la KU Leuven. Nos gustaría agradecer el Core Vector UPenn fundada por James M. Wilson por su especie de regalo del embalaje AAV6.2 plásmido para la producción de vectores rAAV.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NMRI mice | Janvier, Le Genest St Isle, France | ||
| Isoflurane | Isoba, Intervet / Schering-Plough Animal Health, Milton Keynes, UK | ||
| Prolene 6-0 | Ethicon, Groot Bijgaarden, Belgium | ||
| Vicryl 5-0 | Ethicon, Groot Bijgaarden, Belgium | ||
| 50 μl Hamilton Glass Syringe, Model 1710.5 TLLX SYR | Hamilton, Reno, NV, USA | 5495-20 | |
| 30G sharp needle | Hamilton, Reno, NV, USA | 7762-03 | |
| 2% xylocaine | AstraZeneca, Zoetermeer, The Netherlands |
References
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