Summary
이 프로토콜은의 고립을 설명 지방 - 파생 lipoaspirate과 골격 재생을 평가하는 4mm 중요한 크기 calvarial 결함의 생성의 stromal 세포를.
Abstract
Craniofacial 골격 수리 및 재생은 줄기 세포를 이용한 세포 기반의 접근 방식을 통해 드 노보 조직 형성의 약속을 제공합니다. 지방 - 파생 stromal 세포는 (ASCs) osteogenic, chondrogenic adipogenic 및 myogenic 차별화를 진행 할 수 multipotent 줄기 세포의 풍부한 소스로 입증되었습니다. 많은 연구가 세포 전달을위한 다양한 비계의 biomaterials를 이용하여 생체에서 이러한 세포의 osteogenic 가능성을 살펴 보았다. 이 입증 된 그 osteoconductive, 히드 록시 아파타이트 코팅 폴리 (락트산 - 공동 glycolic 산성) (HA-PLGA) ASCs있는 발판 시드, 중요한 크기 calvarial 결함, 자연 받아야하기위한 무능력으로 정의됩니다 결함을 활용하여 , 동물의 수명 동안 치료하면 효율적으로 강력한 뼈의 재생을 표시 할 수 있습니다. 생체 모델에서이 뼈 조직을 다시 생성하기위한 병진 접근의 기초를 보여줍니다 - 세포구성 요소 및 생물학적 매트릭스. 이 방법은 특정 조직 결함의 수리에 대한 전구 세포의 궁극적 인 임상 응용 프로그램에 대한 모델 역할을합니다.
Protocol
1. 셀 절연 및 확장
- 모든 환자의 동의 및 실험 프로토콜은 스탠포드 대학 (Stanford University) 기관 검토위원회 (프로토콜 # 2188과 # 9999)에 의해 검토 및 승인되었습니다.
- 일반 / 국소 마취하에 선택 lipoaspiration 절차에서 인간의 피하 지방 조직을 가져옵니다.
- lipoaspirate 두 레이어 (그림 1A)이 될 것입니다. 표면에 뜨는는 가공 세포 물질의 대부분이 포함되어 있습니다. 아래 층은 대부분 stromal 세포가 어느 계층에서 수확 할 수 지방 - 유래. 생리 주입하지만, 수율은 표면에 뜨는에서 훨씬 더 있습니다.
- stromal 혈관 분율 (SVF)를 분리하려면, 1X의 동등한 볼륨 생리 (PBS)가 betadine없이 1X PBS (1 개)의 동등한 양에 이어 2.5 % betadine (X2)를 포함하는 인산염 버퍼와 깊이 lipoaspirate을 씻는다. 침전물을 세척 할 수 있습니다.
- 멸균 테를 유지하기 위해주의가공 인체 조직과 오염 등의 과정에서 chnique가 발생할 수 있습니다.
- 맨 아래 레이어를 기음과 각 세척 후에는 폐기합니다.
- 나누어지는 50 ML BD 팔콘 원뿔 튜브에 지방 조직의 15 ML.
- 37 번 행크의 균형 소금 솔루션의 필터링 0.075 % 유형 II collagenase의 동일한 볼륨 (15 ML) (HBSS) ° C 물 목욕에 60 분을위한 지속적인 교반 이하 (약 180 / 분을 흔드는)와 지방 조직을 소화 - 각 튜브마다 15 분 환기.
- 15 ML PBS는 ° C는 고밀도 SVF 펠릿을 얻기 위해 4시 5 분에 1,000 rpm으로 10 % (태아 소 혈청) FBS, 그리고 원심 분리기를 포함하는과 효소 활동을 중화. 펠렛은 지방 - 파생 stromal 세포와 적혈구가 혼합 된 것입니다.
- 펠렛을 방해하지 않고 표면에 뜨는 폐기하십시오.
- 기존의 성장 미디어 10 ML (Dulbecco의 수정 된 이글 매체 [DMEM] / 10 % FBS / 1퍼센트 페니실린 - 스트렙토 마이신 솔루션)에 펠렛을 Resuspend.
- 필터 suspen 세포 파편을 제거하는 100 μm 나일론 셀 스트레이너를 통해 시온.
- 한 번에 깊게 50 ML 원뿔에 3 관을 결합합니다. 4 ° C.에서 5 분 1,000 rpm으로 원심 분리기
- 펠렛을 방해하지 않고 표면에 뜨는 폐기하십시오.
- 기존의 성장 미디어의 5 ML에있는 펠릿을 Resuspend
- 한 10cm 판 또는 15cm 접시를위한 다섯 50 ML conicals 당 50 ML conicals 조화를 이루고 있습니다.
- 37 ° C/21 % O 2, 5 % CO 2에서 밤새 차 문화를 설정합니다.
- 박 부화 후, 잔여 비 점착성의 적혈구를 제거하는 PBS로 광범위하게 판을 씻는다. 그 결과 세포 인구는 지방 - 파생 stromal 세포입니다.
- 37 ° C/21 % O 2, 5 % CO 성장 미디어의 2 자연 차별화를 방지하기 위해 하위 합류 수준에서 세포를 유지하고 있습니다. 세포는 일반적으로 50 % 합류에 도금 할 때 정기적 인 성장 미디어의 모든 3~4일 분할해야합니다.
- 치과의 학교 - 공사장 공중 발판는 캘리포니아 대학에서 박사 민 리, 로스 앤젤레스에 의해 만들어졌다.
- PLGA의 공사장 공중 발판은 용매 캐스팅와 미립자 침출 과정에서 15분의 85 폴리 (락트산 - 공동 glycolic 산성) (고유 점도 = 0.61 DL / g, 버밍엄 (Birmingham)의 폴리머)에서 가공되었습니다.
- PLGA / 클로로포름 솔루션은 92% 다공성 (볼륨 분율) 및 테플론 금형의 얇은 시트로 압축을 얻기 위해 200-300 μm 직경 자당과 혼합되었다.
- 밤새 동결 건조 후, 공사장 공중 발판은 자당을 분해 두 번 증류 (DD) H 2 O의 세 변화에 익숙해했고, 부드럽게 미세 팁 주걱으로 테플론 판에서 삭제되었습니다.
- 미립자 침출 후, 모든 공사장 공중 발판이 ddH 2 O. 세 린스 그 다음, 30 분 각 50 %, 60 % 및 70 % 에탄올에 빠져 소독 된
- 모든 공사장 공중 발판은 층류의 후드 아래에 건조되었다.
- 후 비계 제조, Scaffolds는 인회석으로 코팅했다.
- SBF (시뮬레이션 신체 유체) 솔루션은 그 인간 혈장의 5 배이었다 이온 농도로 준비했습니다. 모든 솔루션은 0.22 μm PES 멤브레인 (Nalgene)를 통해 필터링 무균했다. 바로 코팅 공정 전에 PLGA의 공사장 공중 발판이 으러 및 코팅 균일 성을 향상시키기 위해 글로우 방전, 아르곤 플라즈마 에칭 (Harrick 과학)를 받게되었다 건조.
- 에칭 PLGA의 공사장 공중 발판이 후 37 SBF에 incubated되었습니다 ° MG이 다음 12 시간에 물 외피 보육 내부 C, +와 HCO 3-37에서 다른 12 시간을 무료로 SBF 2 ° C 부드럽게 저어 아래에.
- 코팅 PLGA의 공사장 공중 발판은 층류 후드에 건조 및 70 % 에탄올로 소독을 초과 나트륨 염화물 솔루션을 씻어하기 위해 멸균 ddH 2 O로 부드럽게 헹구어했다.
- 인회석 코팅의 무결성은 스캔 전자 현미경 (SEM)으로 분석되었다. 인회석 코팅 SCAffolds는 SEM 명세서 (테드 펠라)에 장착하여 전도성을 향상시키기 위해 탄소로 코팅되었습니다. 보조 전자 모드는 SEM (페이 / 필립스 XL-30) 관찰 기간 동안 적용되었습니다. 에너지 분산 X-선 스펙트럼은 인회석 구조의 원소 구성을 확인하기 위해 얻은 것입니다.
3. 셀 심는
- 하위 합류 수준에 도달시, PBS (X2)으로 세포를 씻고 trypsinize.
- 퍼 뜨리고에 대한 수량화하기 위해 셀을 카운트
- 1.5 × 10 5 세포와 사전 컷 4.0 mm 직경의 공사장 공중 발판로 씨.
- 96 - 웰 플레이트 잘에 장소 개별 발판
- 미디어의 20 μl 당 약 1.5 × 10 5 세포의 농도와 일반 성장 미디어에서 다시 일시 중지 세포
- 30 분을위한 세포 배양 배양기에 Pipet 20 바로 발판 위에 μl과 장소를.
- 30 분 후, 미디어 200 μl를 추가하고 셀 품다 할 수수술에 대한 발판에서 하루 아침에 전
- 그것은 세포의 충분한 숫자를 퍼 뜨리고로 발판 위에 세포의 접착력은 대부분의 발판에 첨부 할 수 있도록합니다 보장 할 필요는 없습니다. 이것은 bioluminescence와 조직 학적 분석 생체에 우리가 실험실에서 검증되었습니다.
4. Calvarial 결함 및 생체 주입에서의 창조
- 마취 성인 (60 하루 미만) 마취 칵테일 CD-1 누드 마우스. (케타민 / xylazine / acepromazine) 50 % 농도 (0.9 % NaCl로 1시 1분 희석)에서 또는 기관 프로토콜 당 권장 마취 처방 당. hASCs가 면역 반응을 일으키지 않도록 이러한 마우스는 athymic 있습니다.
- 용량 : 케타민 염산염 (80 MG / kg), Xylazine (2.5 밀리그램 / kg) Acepromazine (2.5 밀리그램 / kg)
- 효과의 기간 : 약 30 분
- 수술 동물을 내리면 t 수술을 소독betadine과 알코올 (X3)와 사이트 전에 오른쪽 정수리 뼈를 노출 동물의 두피에 중간 선 시상 절개에 연고를 마우스 눈을 다룹니다. 무딘 해주세요 (그림 1B)와 오른쪽 정수리 뼈에서 머리를 제거합니다.
- 살균 다이아몬드 코팅 trephine 드릴 비트를 사용하여 오른쪽 비 봉합 관련 정수리 뼈의 일방적 인 4 mm 전체 두께 결함을 만듭니다. 익스트림주의는 마우스 calvarial 두께로 기본 경질의 팀 이잖아요 (그림 1B)를 방해하지 않도록해야합니다 <0.3 mm입니다.
- 주입하기 전에 중간 유래 성장 인자의 전달을 방지하기 위해 멸균 PBS로 공사장 공중 발판을 씻어.
- 결함에 비계를 놓으십시오.
- 마지막으로, 피부가 폐쇄 봉합 및 설립 수술 프로토콜을 당 동물을 모니터링 할 수 있습니다.
- 포스트 operatively - 예를 들어 필요에 따라 동물 보호 프로토콜의 지시에 따라 설립 진통제를 사용합니다. buprenorphine 0.1 MG / Kg.
5. 뼈 같은 형성의 정량화
- MicroCT는 마우스에서 수행 된 후, 3 차원 이미지는 이전에 다음 1에 설명 된대로 MicroView 소프트웨어를 사용하여 복원되었습니다.
- 어도비 포토샵을 사용하여 이미지의 표준 높이로 크기있었습니다.
- 마술 지팡이 기능을 사용하면, 픽셀이 calvarial 결함 측정 하였다.
- 결함의 비율 치료는 이후 중부 표준시 스캔은 calvarial 결함 영역을 측정 및 픽셀 수를 결정하고 원래 결함의 픽셀 수로 나누어 계산 한
- MicroCT를 사용할 수없는 경우 따라서, 대안은 어도비 포토샵을 사용하고 조직학에 대한 결정 시간 지점에서 calvaria를 수확하고 있습니다.
- 뼈 같은 형성을 나타냅니다 아닐린 블루와 Pentachrome 같은 조직 학적 얼룩을 사용하여 결함의 범위를 따라 여러 섹션 스테인드해야
- 어도비 포토샵이 아닌 모든 영역에서 자르기를 사용하여calvarial 결함에
- 마법의 지팡이 기능을 사용하여 결함의 영역에 드 노보 뼈 형성 픽셀 수를 결정하고 컨트롤 또는 기타 변수를 비교합니다.
6. 대표 결과
지방 조직은 임상 응용 프로그램에 대한 전구 세포의 생성에 중요한 역할을 제공 할 수있는 가능성이 있습니다. 지방 조직은 최소한의 병적 상태와 사망률과 관련된 비교적 간단한 절차에 수확 할 수있는 즉시 사용할 수 공급이 점에서 독특한 장점이 있습니다. 조직 수확 및 수집되면, 우리의 프로토콜은 그림 2에 설명되어 있습니다. 지방 - 파생 stromal 세포 세척 단계 시리즈 collagenase를 소화하고, 원심 분리를 통해 분리되어 있습니다. 세포 문화에 도금되면, 그것들은, 확장 체외에서 다양한 차별화 프로토콜에 배치하거나, 생체에 직접 배치 할 수 있습니다.
C4mm 중요한 크기 calvarial 결함 reation은 우리의 지방 유래 stromal 세포의 osteogenic 차별화 능력을 테스트하는 생체 모델에서 쉽게 접근 할 수와 재현 제공합니다. MicroCT의 사용을 통해, 우리는 생체에서 골격 조직의 형성에 따라 우리의 개입의 진행 상황 (그림 3)을 추적 할 수 있습니다. 중요한 크기 calvarial 결함 동물의 수명 내에 치유되지 않으며, 우리는 결함의 약 90 %가 팔주 주위에 특허 유지를 참조하십시오. 비계 자체가 (토론 참조) osteogenic 유도 특성을 가지고 있으며 일부 뼈 재생을 유도 할 수있는 능력을 보여 주었다. 세포가없는 비계 배치의 전형적인 결과는 결함의 삼분의 일을 주위에 팔주에 드 노보 뼈 형성을해야합니다 것으로 나타났습니다. variab가 있지만 지방 - 파생 stromal 세포의 확대로 완전히 결함의 3 분의 2 이상은 8 주변 주에서 뼈의 재생을 보여줍니다각 동물과 수술 사이 ility. 골격 조직의 형성은 조직 학적 소견을 통해 정량, 전형적인 결과는 아닐린 블루와 Pentachrome의 착색 (그림 3C)를 통해 ASCs과 샘플의 증가 뼈 같은 형성을 표시 할 수 있습니다. 또한, 우리는 (그림 3D) 주입 된 인간의 세포가 calvarial 결함에 드 노보 뼈 형성 지역 근처에 이주에 생체에 착색을 보여 GFP-라벨 hASCs의 사용을 통해 기본 드 노보 뼈의 형성에 기여하는 것을 보여 . 또한, 우리는 결함의 영역 (그림 3E)에 인간의 세포 생존과 기여를 보여 인간의 특정 항체와 immunohistochemistry를 사용합니다.
그림 1 A -. lipoaspirate은 두 층이 있습니다. 상단 층은 adipocytes와 PR의 대부분을 포함아래 층은 lipoaspiration 과정에서 사용 된 염분을 포함하는 동안 세포 자료를 ocesses. B - 기본 경질 한 학교의 중단없이 오른쪽 정수리 뼈, 4mm 중요한 크기 calvarial 결함의 후속 작성을 분리 할 수있는 머리를 통해 중간 선 절개를 통해 calvarial 결함의 생성.
그림 2.의 확장, 차별화 및 체외 및 생체 내 사용에 지방 - 파생 stromal 세포의 분리에서 lipoaspirate의 수확 및 응용 프로그램의 개요.
그림 3. hyd을 통해 ASCs의 응용 프로그램과 함께 중요한 크기 calvarial 결함 생체 치료에 게재 A-MicroCTroxyapatitie 비계 (하단 행). ASC 그룹에서 크게 증가 치유를 표시하는 MicroCT에서 뼈의 치유의 정량화 - 컨트롤 세포 (중간 행) B없는 발판의 위치를 가진 비계 및 결함 (상단 행) 및 결함을 포함하지 않습니다. C - 조직학은 아닐린 블루와 Pentachrome 염색을 통해 ASC 그룹 (하단 행)의 증가 뼈 같은 형성을 보여주고 있습니다. 아닐린 블루를 들어, 뼈 같은 얼룩 푸른 색과 어두운 Pentachrome, 뼈 같은 얼룩 노란색하십시오. D - GFP으로 표시 hASCS는 비계에 놓는와 배치 calvarial 결함으로와 이주에 희생되었다. 얼룩은 결함의 영역에서 재생에 기여 인간의 세포를 게재 할 수 GFP 표시 항체로 이루어졌다. E -. 이주의 결함의 영역에서 인간 세포의 유행을 보여주는 인간 핵 항원 immunohistochemistry은 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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Discussion
의 고립 때문에 지방은 - 파생 lipoaspirate에서 stromal 세포 2를,이 세포는 세포 lineages 다양한으로 차별화되었습니다. 지방 조직은 mesodermal 기원에서이므로, multipotent 지방 파생 stromal 세포 가능성이 mesodermal 계보 (Lineage)에 대한 응용 프로그램 가장 효과적입니다. 골격 조직을 생성하는 기능을 기증 autograft에 대한 사이트 및 감염, 거부, 시간 3 이상 고장 등의 합성 재료의 고유 제한 부족 주어진 특히 중요합니다. 지방 파생 stromal 세포는 수술 수확 당 상대적으로 큰 항복 4 잠재적 인 자생 multipotent 세포 라인을 제공합니다.
stromal 혈관 분수와 지방 세포 조직을 처리하는 동안, 그것은 뛰어난 살균 기술을 유지하는 것이 중요합니다. lipoa의 대량 자연 주어진 주요 문화의 오염의 큰 위험이 있습니다무균 세포 배양 후드 외부 단계 세척, 소화하고, 원심 분리의 여러 단계와 결합 spirate. 펠렛은 요리에 도금되면, 눈에 보이는 세포의 대부분이 eyrthrocytes 될 것입니다. 이 지방은 - 파생 stromal 세포가 판 또는 적혈구의 용해 버퍼에 준수이 추가 될 수 있습니다되면 이러한 멸균 PBS로 씻어 할 수 있습니다. 이것은 세포가 적절한 성장과 차별화를 보장하기 위해 초기 도금 단계에서 상대적으로 합류하는 것이 중요합니다.
정확히 지방 파생 stromal 세포를 정의하는 방법에 대한 의견 일치가 없습니다. 연구 유동 세포 계측법을 통해 세포 표면 마커에 따라 세포의 이러한 인구를 정의하는이 노력했지만, 정의 된 집합 또는 마커를 찾는 것은 어려운 일이었다. 이 가능성이 환자 인구의 변화와 phenotypic 드리프트로 인해입니다 이러한 세포의 다른 세포 배양 환경에 따라 체외에서 경험을 됐기에 다양성을현자 번호. CD45, CD34, CD14, CD11b, CD79α, CD19, 그리고 HLA-DR 5 부족하면서 세포 치료에 대한 국제 사회는 최소한 중간 엽 줄기 세포는 CD105의 표현, CD90, CD73 등의 특정 특성을 가지고 있어야하는 것으로 나타났습니다. 이러한 세포의 멀티 강력한 자연의 원래 정의는 체외에서 mesodermal lineages의 세포로 분화하는 능력에서 온 이러한 프로토콜 이용하실 수 있습니다.
중요한 크기 calvarial 결함 모델은 손쥐 지방 파생 stromal 세포 6 인간 유래 지방 파생 stromal 세포 하나를 사용하여 골격 재생을 공부하는 모델로 확인되었습니다. 마우스의 오른쪽 정수리 calvaria에서 4mm 결함의 생성은 동물의 수명에 치유되지 않습니다. 따라서, 본 적 치료는 calvarial 결함에 배치 치료 때문입니다. 수술 과정은 inju하지 않는 특히 중요합니다기본 경질 한 학교를 다시. 경질의 팀 이잖아요 자체는 osteogenesis을 자극 할 수 있으며 모든 부상은 크게 calvarial 결함 7 치유 과정을 방해 할 수 있습니다.
줄기 세포에 대한 전송 메커니즘으로 사용 F 발판은 골격 공학의 세계에서 특히 중요합니다. 골격 조직의 기능은 고유 매크로 환경의 3 차원 구조와 관련이 있습니다. 적절한 비계는 생체 내 줄기 세포 전달에 도움이뿐만 아니라 골격 자체의 강화 osteogenic 속성을 통해 osteogenesis를 증가 할 수 없습니다. 우리 연구소는이 자료의 osteoinductive 및 osteoconductive 특성으로 인해 PLGA 백본에, 히드 록시 아파타이트, 칼슘 파생을 포함한다. 그러나, 강력한 osteoinductive 및 osteoconductive 특성 8, 9를 가질 수 발판을 만드는 많은 다른 옵션이 있습니다. 또한, 비계는 또한 강력한 adjuvants를 제공하는 데 사용할 수 있습니다작은 분자 10, 11, 벡터 내리다 또는 유전자 타겟 12, 13를 upregulate 할 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
우리는 우리의 연구의 지원과 협력 박사 조지 커먼즈 박사 딘 Vistnes 감사드립니다. 세인트 조셉 머시 병원 GME에서 지원하는이 작품은 치과와 Craniofacial 연구 기금 1 R21 DE019274-01, R01EB009689 및 RC2 DE020771-02, MTL 박사 현에 소아 재생 의료에 대한 오크 재단과 Hagey 연구소의 국립 연구소에 의해 지원됩니다 .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipoaspirate Harvest | |||
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Cellgro | 21-023-CV | |
| Collagenase | Sigma | C6885-500MG | |
| Cell Strainer 100 μm | BD Falcon | 352360 | |
| Steri-top 500 ml .22 μm filter | Millipore | SCGPT05RE | |
| Calvarial Defect | |||
| Z500 Brushless MicromotorsUM50C | NSK | NSKZ500 | |
| Circular Knife 4.0 mm | Xemax Surgical | CK40 | |
References
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