修复的临界大小的颅骨缺损模型脂肪间充质干细胞的收获Lipoaspirate

Summary

该协议描述了隔离的脂肪组织的基质细胞从lipoaspirate 4毫米的临界大小的颅骨缺损，以评估骨骼的再生和创造的。

Abstract

颅面骨骼的修复和再生的细胞为基础的方法，利用干细胞通过重新组织形成提供了保证。脂肪基质细胞（ASCs）已被证明是一个丰富的来源，能够进行成骨细胞，软骨细胞，脂肪细胞和成肌细胞分化的多能干细胞。许多研究探讨了这些细胞在体内的成骨潜能细胞输送各种脚手架生物材料的使用。它已被证明，通过利用一个骨传导，以羟基磷灰石涂敷的聚（乳酸 - 共 - 羟基乙酸）（HA-PLGA）支架种子与先进的结构陶瓷，颅骨缺损的关键尺寸，其无法进行自发定义的缺陷，这会愈合的动物的整个生命周期，可有效地显示出强劲的骨再生。这在体内模型演示旨在再生的骨组织的基础上的平移的方法-在蜂窝成分和生物基质。这种方法的模型作为最终的临床应用祖细胞对一个特定的组织缺损的修复。

Protocol

1。细胞分离和扩增

1. 所有病人的同意和实验方案进行了审查，并批准由斯坦福大学的机构审查委员会（议定书＃2188，＃9999）。
2. 获取人体皮下脂肪组织从本地/全身麻醉下的的选修lipoaspiration程序。
3. 将有两个在lipoaspirate层（ 图1A）。将上清液包含处理后的多孔材料的绝大部分。底层主要是注射生理盐水。 脂肪衍生的基质细胞，可以从任一层收获，但产量从上清液中大得多。
4. 要隔离的基质血管级分（SVF），广泛的lipoaspirate洗，用等体积的磷酸盐缓冲盐水（PBS）含有2.5％聚乙烯吡咯酮碘（×2），然后由等体积的1X PBS（×1）不优碘1X。允许在洗涤沉淀。
5. 小心地保持无菌TEchnique在整个过程中可能发生污染加工的人体组织。
6. 吸的底层，每次冲洗后丢弃。
7. 分装15毫升到50毫升BD猎鹰锥形管的脂肪组织。
8. 消化的脂肪组织中，与等体积（15毫升），过滤的0.075％II型胶原酶在Hank氏平衡盐溶液（HBSS）中，在37℃下在水浴中60分钟，在恒定搅拌下（大约180摇动/分钟） - 各管通风，每15分钟。
9. 与15毫升PBS含有10％（胎儿牛血清）的FBS，并以1,000 rpm离心5分钟，在4℃，以获得一种高密度的SVF颗粒中和酶的活性。沉淀将脂肪衍生的基质细胞和红细胞的混合。
10. 弃上清，不破坏颗粒。
11. 将沉淀重悬于10毫升传统的生长培养基（Dulbecco改良的Eagle培养基[DMEM] / 10％FBS / 1％青霉素 - 链霉素溶液）。
12. 过滤悬浮液 SION通过100μm尼龙细胞过滤器，以除去细胞碎片。
13. 将3到一个干净的50 mL锥形管。在4℃下以1,000 rpm离心5分钟离心
14. 弃上清，不破坏颗粒。
15. 传统的生长培养基的5毫升，将沉淀重悬于
16. 结合两个50毫升conicals每1个10公分板或五50毫升的conicals一个15公分板。
17. 建立原代培养过夜，在37℃C/21％O _{2，5％CO 2。}
18. 培养过夜后，广泛用PBS清洗板以除去残余的非粘附的红血细胞。将得到的细胞群是脂肪组织衍生的基质细胞。
19. 保持在亚汇合的水平，以防止自发分化的细胞在37℃C/21％O _{2，5％CO 2}在生长介质。细胞通常需要分割在定时的生长培养基接种于50％汇合时，每三到四天。

ve_title“> 2。脚手架准备

1. 由李民博士在美国加州大学洛杉矶分校 - 牙科学院的支架。
2. PLGA支架，从85/15的聚（乳酸 - 共 - 乙醇酸）（固有粘度= 0.61分升/克，伯明翰聚合物）制成，通过溶剂浇铸和颗粒状浸出过程。
3. 200-300微米直径的蔗糖，PLGA /氯仿溶液混合，得到92％孔隙率（体积分数），并压制成薄片在Teflon模具。
4. 冷冻干燥过夜后，浸渍在双蒸馏水（dd）的H _{2 O的}三种变化支架以溶解蔗糖，并轻轻地从Teflon板与罚款小费抹刀除去。
5. 颗粒浸出后，所有棚架通过浸渍在50％，60％和70％乙醇消毒每次30分钟，然后由三个漂洗DDH _{2 O。}
6. 所有支架下干燥，在层流罩。
7. 后支架制作，S涂覆有磷灰石caffolds。
   1. 模拟体液（SBF）制备​​的溶液与离子浓度的5倍，人体血液，血浆。所有的解决方案是通过0.22μmPES膜（的Nalgene）无菌过滤。立即涂覆前的过程中，干燥，PLGA支架进行辉光放电，氩等离子体蚀刻（Harrick旅游Scientific）的改善润湿性和涂层的均匀性。
   2. 蚀刻PLGA支架在SBF培养在37°C水套式培养箱中培养12小时内，其次是^镁+和HCO ₃ ^- SBF 2张，另有12个小时，在37°C下轻轻搅拌。
   3. 被覆了的PLGA支架轻轻用无菌DDH _{2 O}漂洗，洗去多余的氯化钠溶液洗涤，在层流罩中干燥，并用70％乙醇消毒。
   4. 磷灰石涂层的完整性，用扫描电子显微镜（SEM）分析。磷灰石涂层的SCAffolds被安装在扫描电镜的存根（泰德培拉）和涂覆有提高导电性的碳。的二次电子模式期间施加SEM（FEI /菲利普斯XL-30）观察。能量色散X-射线谱，得到磷灰石结构确认元素的组合物。

3。细胞接种

1. 达到合流子的水平后，洗涤细胞，用PBS（×2）和trypsinize。
2. 细胞计数，以量化为播种
3. 种子到预先切割的8.0毫米直径的支架用1.5×10 ^5个细胞。
   1. 地点个别支架成孔的96 - 孔板
   2. 重新悬浮细胞定时的生长介质中的浓度大约为1.5×10 ^5个细胞每20μl的媒体
   3. 吸取20μL直接上支架，并放入细胞培养孵化器30分钟。
   4. 30分钟后，加入200μl的介质，并允许细胞孵育在脚手架上过夜，手术前
   5. 这是没有必要的，以确保粘附播种足够数量的细胞的细胞上的支架，将确保多数将附加到支架。在我们的实验室已证实在体内生物发光和组织学分析。

4。颅骨缺损， 植入体内的创建

1. 麻醉成年（60日龄）CD-1裸鼠麻醉剂鸡尾酒。 （氯胺酮/甲苯​​噻嗪/乙酰丙嗪）在浓度为50％（1:1稀释的0.9％NaCl），或每推荐的麻醉方案每个机构协议。这些老鼠是裸鼠，所以hASCs不会引起免疫反应。
   1. 用量：氯胺酮盐酸盐（80毫克/公斤），二甲苯胺噻嗪（2.5毫克/千克）乙酰丙嗪（2.5毫克/公斤）
   2. 效果持续时间：约30分钟
2. 手术垂坠的动物和消毒的手术聚维酮碘和酒精的网站（X3）和鼠标的眼睛软膏之前矢状切口在头皮上的动物暴露的右顶骨。删除从右侧顶骨的骨膜用钝的刮（ 图1B）。
3. 必须格外小心，注意不要打扰基础硬脑膜（图1B）的小鼠颅骨厚度创建一个单方面4毫米的厚度在正确的相关的非缝合顶骨缺损，用无菌环钻金刚石涂层位。是<0.3毫米。
4. 在注入之前，冲洗用无菌PBS支架中衍生的生长因子，以防止传输。
5. 将支架入缺陷。
6. 最后，缝合皮肤和监控动物按照既定术后协议。
7. 建立镇痛，手术后- 例如需要动物保健协议。丁丙诺啡0.1毫克/ K克。

5。类骨质形成的定量分析

1. 后微型电脑鼠标上执行，重建三维图像，如先前描述的¹使用MICROVIEW软件。
2. 使用Adobe Photoshop的图像大小的标准高度。
3. 使用“魔术棒”功能，像素测量颅骨缺损。
4. 通过随后的CT扫描测量颅骨缺损区域和确定象素数和将它除以原来的缺陷的像素数确定与愈合的缺陷百分率
5. 因此，如果微型电脑是不可用的，另一种方法是使用Adobe Photoshop和收获颅盖骨在确定的时间点组织学。
6. 使用组织学污渍如苯胺蓝及Pentachrome的表示的类骨质形成，多个部分沿跨度的缺陷应该是染色
7. 使用Adobe Photoshop，出露的所有领域，是不在颅骨缺损
8. 使用“魔棒”功能，并确定在该地区的缺陷从头骨形成的像素数和管制或其他变量进行比较。

6。代表性的成果

脂肪组织有可能成为一个重要的角色，代祖细胞的临床应用。脂肪组织具有独特的优势，有一个现成的电源，可以在一个相对简单的过程，涉及到最小的发病率和死亡率有所收获。一旦组织被收获和收集的，我们的协议是在图2中列出。脂肪组织衍生的基质细胞是通过一系列的洗涤步骤，胶原酶消化，和离心分离。一旦细胞被接种在培养的，它们可以被扩大，放入不同分化协议在体外 ， 在体内直接或放置。

在Creation 4毫米的关键颅骨缺损提供了一个方便，重现性好， 在体内的模型来测试我们的脂肪基质细胞成骨分化能力的。通过使用的微型电脑，我们能够，按照体内骨组织的形成和跟踪我们的干预的进展情况（ 图3）。关键的颅骨缺损不愈合的动物的生命周期内，我们看到大约90％的缺陷仍然专利8周左右。支架本身具有成骨细胞的电感特性（见讨论），并诱发一些骨再生的能力。支架放置无细胞的典型结果示出，周围的缺陷的三分之一，将有新生骨形成在第8周。随着脂肪组织衍生的基质细胞的增强作用，充分三分之二或更多的缺陷将显示在约8周的骨再生虽然存在的变量应对WTO每个动物和外科手术之间。骨组织的形成可以被量化通过组织学和典型的结果表明：通过苯胺蓝和Pentachrome的染色（ 图3C）的ASCs样品中的类骨质形成增加。此外，我们还表明，植入人体细胞的基本原发骨形成通过使用GFP-的标记hASCs，表明活体染色在2周附近地区的从头颅骨缺损的骨形成（ 图3D） 。此外，我们使用与人类特异性抗体的免疫组化，以显示中的缺陷的区域（ 图3E）的人类细胞的存活和贡献。

图1：A - lipoaspirate有两层。最上方的层中含有的脂肪细胞和大多数的processes多孔材料，而底部的层包含生理盐水期间使用的lipoaspiration程序。 B - 建立颅骨缺损，通过中线切口，在骨膜分离出4毫米的临界大小的颅骨缺损右顶骨，随后创建无中断的基础硬脑膜。

图2概述的收获和应用的lipoaspirate从隔离的脂肪组织衍生的基质细胞，以它们的扩张， 在体外和体内分化和使用。

A- 在体内应用先进的结构陶瓷的临界尺寸颅骨缺损愈合的微型电脑显示，通过液压图3。roxyapatitie支架（底行）。控制包括无支架和缺陷（上排）和缺陷位置的支架无细胞（中排）B - 定量分析的微型电脑骨愈合，愈合的ASC组明显增加。 C - 组织学类骨质形成增加的ASC组（下排）通过苯胺蓝和Pentachrome的染色。苯胺蓝的骨样污渍，深蓝色和Pentachrome的骨样污渍，黄色。 D - 与GFP hASCS标记，接种到支架上，并放置到一个颅骨缺损，牺牲在2周。用GFP标记的抗体，以促进再生的缺陷的面积中，显示的人体细胞进行染色。 E -人类细胞核抗原免疫组化显示人体细胞的患病率在该地区的缺陷在2周。 点击此处查看大图 。

Discussion

由于隔离脂肪衍生的基质细胞从lipoaspirate ^2，这些细胞已分化成各种各样的细胞谱系。脂肪组织是来自中胚层的起源，因此，多能的脂肪组织衍生的基质细胞将可能是最有效的应用向中胚层谱系。生成骨组织的能力是特别重要的，因为短缺的自体移植的供区和合成材料固有的局限性，包括感染，排斥反应，随着时间的推移和故障^3。脂肪间充质干细胞提供了一个潜在的自体多能细胞系外科收获有比较大的收益率^4％。

的基质血管级分和脂肪细胞组织在该处理期间，重要的是要保持良好的无菌技术。有一个大的污染风险的原代培养的体积性质的lipoaspirate洗涤，消化，和离心的步骤以外的无菌细胞培养罩的多个步骤的结合。一旦颗粒被的培养皿上的菜，可见的单元格的大部分将eyrthrocytes。这些都可以用无菌PBS洗掉一旦脂肪衍生的基质细胞粘附到板或红血细胞溶解缓冲液可以添加。重要的是，所述细胞是相对汇合上，以确保适当的生长和分化的初始电镀步骤。

如何准确地界定脂肪间充质干细胞有没有达成共识。虽然有研究试图确定这些人口的细胞，通过流式细胞仪检测细胞表面标志物的基础上，已经很难找到一组已定义或标记。这可能是由于患者人群中的变异性和表型漂移的经验，这些细胞在体外不同的细胞培养环境下，在PAS的变化圣人的数字。国际细胞治疗协会指出，间充质干细胞在最低限度，必须有一定的特点，包括表达CD105，CD90，CD73，而缺乏CD45，CD34，CD14，CD11b的，CD79α，CD19，和HLA-DR ^5。多有力的性质，这些细胞的原始定义来自于他们的能力，分化成中胚层谱系的细胞在体外培养 ，这些协议都是现成的。

的临界尺寸的颅骨缺损模型已经通过验证作为模型来研究骨骼再生使用两个小鼠脂肪组织衍生的基质细胞⁶和人来源的脂肪衍生的基质细胞^1。创造4毫米的缺陷在右侧的顶颅骨的鼠标不会愈合的动物的寿命。因此，看到的是任何形式的治疗由于放置在颅骨缺损的治疗。在手术过程中，尤其重要的是不仁州重的基础硬脑膜。硬脑膜本身可以刺激成骨和任何损伤可显着妨碍愈合过程中的颅骨缺损^7。

的使用f支架的作为传送的机制，干细胞是特别重要的，在世界的骨骼工程。骨骼组织的功能是唯一相关的三维结构体的宏观环境。正确的脚手架不仅可以帮助体内的干细胞输送，但也通过增加成骨增强成骨细胞的支架本身的属性。我们的实验室采用羟基磷灰石，钙衍生物，由于该材料的骨诱导和骨传导到PLGA骨干。但是，也有许多其他的选择脚手架创建，可以有很强的骨诱导和骨传导性能^8，9。此外，也可以使用的支架来提供强大的佐剂，例如作为小分子^{，10日，11日}和载体击倒或上调的基因目标^{，12，13。}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lipoaspirate Harvest
PBS	Gibco	10010-023
Hank's Balanced Salt Solution	Cellgro	21-023-CV
Collagenase	Sigma	C6885-500MG
Cell Strainer 100 μm	BD Falcon	352360
Steri-top 500 ml .22 μm filter	Millipore	SCGPT05RE
Calvarial Defect
Z500 Brushless MicromotorsUM50C	NSK	NSKZ500
Circular Knife 4.0 mm	Xemax Surgical	CK40