Summary
Questo protocollo descrive l'isolamento di adiposo cellule stromali di lipoaspirate e la creazione di un millimetro 4 critico imprese difetto cranica per valutare rigenerazione scheletrico.
Abstract
Craniofacciale scheletrica riparazione e rigenerazione offre la promessa di formazione de novo tessuto attraverso una cella approccio che utilizza cellule staminali. Derivate da tessuto adiposo cellule stromali (CSA) hanno dimostrato di essere una fonte abbondante di cellule staminali multipotenti in grado di subire osteogenico, differenziazione condrogenico, adipogenico e miogenico. Molti studi hanno esplorato il potenziale osteogenico di queste cellule in vivo con l'uso di biomateriali impalcature varie consegna cellulare. È stato dimostrato che utilizzando un osteoconduttiva, rivestimento in idrossiapatite poli (lattico-co-glicolico) (HA-PLGA) scaffold seminati con ASC, un difetto critico dimensioni cranica, un difetto che è definita dalla sua incapacità di subire spontanea guarigione sulla durata di vita dell'animale, può essere efficacemente mostrare robusta rigenerazione ossea. Questo modello in vivo dimostra la base di approcci translazionale volta la rigenerazione del tessuto osseo - il cellularecomponente e matrice biologica. Questo metodo serve da modello per l'applicazione clinico finale di una cellula progenitrice verso la riparazione di un difetto specifico tessuto.
Protocol
1. Cella di isolamento e di espansione
- Tutti consenso del paziente e protocolli sperimentali sono stati esaminati e approvati dalla Stanford University Institutional Review Board (protocollo # 2188 e # 9999).
- Ottenere umano tessuto adiposo sottocutaneo di procedure elettive di cui lipoaspirazione locale / anestesia generale.
- Ci saranno due strati nella lipoaspirate (Figura 1A). Il surnatante contiene la maggior parte del materiale trattato cellulare. Lo strato inferiore è principalmente iniettato salina. Adiposo cellule stromali può essere raccolta da uno strato, ma la resa è molto maggiore dal supernatante.
- Per isolare la frazione stromale vascolare (SVF), lavare il lipoaspirate ampiamente con uguali volumi di 1X tampone fosfato salino (PBS) contenente 2,5% betadine (x2), seguita da volume uguale di PBS 1X (x1) senza betadine. Lasciare che il lavaggio a precipitare.
- Fate attenzione a mantenere sterile technique tutto il processo, come contaminazione con tessuti umani trasformati può accadere.
- Aspirare lo strato inferiore e gettare dopo ogni lavaggio.
- Dispensare 15 ml di tessuto adiposo in 50 ml BD Falcon tubi conici.
- Digerire il tessuto adiposo con un volume uguale (15 ml) di filtrato 0,075% collagenasi di tipo II in soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) a 37 ° C a bagnomaria per 60 minuti con agitazione costante (circa 180 scuote / min) - ventilare ogni tubo ogni 15 min.
- Neutralizzare l'attività enzimatica con 15 ml di PBS contenente 10% (Fetal Bovine Serum) FBS, e centrifugare a 1000 rpm per 5 min a 4 ° C per ottenere una alta densità SVF pellet. Il pellet sarà un mix di derivate da tessuto adiposo cellule stromali ed eritrociti.
- Scartare il sopranatante senza disturbare il pellet.
- Risospendere il pellet in 10 ml di mezzo di crescita tradizionali (Eagle modificato da Dulbecco Medium [DMEM] / 10% FBS / 1% di penicillina-streptomicina soluzione).
- Filtro sospensione sione attraverso un filtro 100 micron cella in nylon per rimuovere i detriti cellulari.
- Combina 3 tubi in uno pulito da 50 ml. Centrifugare a 1000 rpm per 5 min a 4 ° C.
- Scartare il sopranatante senza disturbare il pellet.
- Risospendere il pellet in 5 ml di mezzo di crescita tradizionali
- Combina due conicals 50 ml per un 10 cm Piatto o cinque conicals 50 ml per una piastra di 15 cm.
- Stabilire colture primarie notte a 37 ° C/21% di O 2, 5% di CO 2.
- Dopo l'incubazione per una notte, lavare i piatti estesamente con PBS per rimuovere residui non aderenti globuli rossi. Le popolazioni di cellule risultanti sono derivate da tessuto adiposo cellule stromali.
- Mantenere le cellule a livello sub-confluenti livelli per evitare differenziazione spontanea a 37 ° C/21% O 2, 5% di CO 2 in terreni di coltura. Le cellule generalmente necessario dividere ogni tre o quattro giorni in terreni di crescita regolari quando piastrate al 50% di confluenza.
- Impalcature sono state fatte dal Dr. Min Lee presso l'Università di California, Los Angeles - Scuola di Odontoiatria.
- Ponteggi PLGA sono state fabbricate da 85/15 poli (lattico-co-glicolico) (viscosità intrinseca = 0,61 dl / g, Birmingham Polymers) mediante colata solvente ed un processo di lisciviazione particolato.
- PLGA / cloroformio soluzioni sono state miscelate con saccarosio diametro 200-300 micron per ottenere 92% di porosità (frazione di volume), e compressi in fogli sottili in uno stampo Teflon.
- Dopo liofilizzazione overnight, ponteggi sono stati immersi in tre cambi di bidistillata (dd) H 2 O per sciogliere il saccarosio, e delicatamente rimosso dalla piastra Teflon con un fine-punta di spatola.
- Dopo la percolazione particolato, tutti scaffold stati disinfettati per immersione nel 50%, 60% e 70% di etanolo per 30 minuti ciascuno, seguiti da tre risciacqui di DDH 2 O.
- Tutti i ponteggi sono stati essiccati sotto una cappa a flusso laminare.
- Dopo ponteggio fabbricazione, scaffolds stati rivestiti con apatite.
- SBF (fluido corporeo simulato) soluzione è stata preparata con concentrazioni di ioni che erano 5 volte quello del plasma umano. Tutte le soluzioni sono sterili filtrata attraverso una membrana da 0,22 micron PES (Nalgene). Immediatamente prima del processo di rivestimento, essiccato ponteggi PLGA sono stati sottoposti a scarica a bagliore, argon-plasma etching (Harrick scientifico) per migliorare la bagnatura e l'uniformità di rivestimento.
- Etched ponteggi PLGA sono state poi incubate in SBF a 37 ° C all'interno di una camicia d'acqua incubatore per 12 ore, seguita da Mg 2 + e HCO 3 - libera SBF 2 per un'altra hr 12 a 37 ° C sotto leggera agitazione.
- Rivestite ponteggi PLGA stati sciacquati delicatamente con sterile DDH 2 O per lavare via l'eccesso di soluzione di cloruro di sodio, essiccati in una cappa a flusso laminare e disinfettati con etanolo al 70%.
- Integrità del rivestimento di apatite è stata analizzata con un microscopio elettronico a scansione (SEM). Apatite rivestito scaffolds sono stati montati su stubs SEM (Ted Pella) e ricoperti di carbonio per migliorare la conducibilità. La modalità di elettroni secondari è stata applicata durante la SEM (FEI / Phillips XL-30) osservazione. Dispersione di energia dei raggi X dello spettro è stato ottenuto per confermare la composizione elementare delle strutture apatite.
3. Semina cellulare
- Giunti sub-confluenza livelli, lavare le cellule con PBS (x2) e Tripsinizzare.
- Contare le cellule di quantificare per la semina
- Seme sul pre-tagliati scaffold mm di diametro 4,0 con 1,5 x 10 5 cellule.
- Luogo individuale impalcatura in un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti
- Risospendere le cellule in terreno di crescita regolari con una concentrazione di circa 1,5 x 10 5 cellule per 20 l di supporti
- Dispensare 20 pl direttamente sul patibolo e il luogo in incubatore per colture cellulare per 30 minuti.
- Dopo 30 minuti, aggiungere 200 microlitri di media e permettere alle cellule di incubaresul patibolo notte prima dell'intervento
- Non è necessario per assicurare l'adesione delle cellule sull'impalcatura come seminare un numero sufficiente di cellule garantirà che la maggioranza si attaccherà sul ponteggio. Questo è stato validato nel nostro laboratorio in vivo con bioluminescenza e l'analisi istologica.
4. Creazione di difetti cranica e impianto in vivo
- Anesthetize adulti (60 giorni di età) CD-1 topi nudi con cocktail anestetico. (Ketamina / xilazina / acepromazina) al 50% di concentrazione (diluizione 1:1 con 0,9% NaCl) o per raccomandata regime anestetico per i protocolli delle istituzioni. Questi topi sono atimico in modo che i hASCs non provocare una reazione immunitaria.
- Dosaggio: ketamina cloridrato (80 mg / kg), xilazina (2,5 mg / kg) Acepromazine (2,5 mg / kg)
- Durata di entrata in vigore: circa 30 min
- Chirurgicamente drappo l'animale e sterilizzare l'chirurgicasito con Betadine e alcool (x3) e coprire gli occhi di topo con unguento prima di fare una incisione mediana sagittale nel cuoio capelluto dell'animale per esporre l'osso parietale destra. Rimuovere il pericranium dal parietale destro con raschiatura smussato (Figura 1B).
- Creare un unilaterale da 4 mm a tutto spessore difetto il diritto non sutura parietale associata utilizzando una sterile diamantata punta trapano. Estrema cautela deve essere presa per non disturbare la sottostante dura mater (Figura 1B), come lo spessore del mouse cranica è <0,3 millimetri.
- Prima dell'impianto, risciacquare scaffold con PBS sterile per impedire il trasferimento di medie fattori di crescita derivati.
- Posizionare il patibolo nel difetto.
- Infine, suturare la pelle chiusa e monitorare l'animale per stabiliti protocolli post-operatorie.
- Utilizzare analgesia stabilito come indicato dai protocolli animali vostra cura, se necessario dopo l'intervento-per esempio. buprenorfina 0,1 mg / kg.
5. Quantificazione di Formazione osteoide
- Dopo microCT stata eseguita sul mouse, l'immagine tridimensionale è stata ricostruita utilizzando software MicroView come descritto in precedenza 1.
- Utilizzo di Adobe Photoshop, le immagini erano dimensionati per una altezza standard.
- Utilizzando la funzione di bacchetta magica, i pixel sono stati misurati del difetto cranica.
- Guarigione percentuale del difetto è stata determinata mediante successive scansioni CT misurare la superficie cranica difetto e determinare il numero di pixel e dividendolo per il numero di pixel del difetto originale
- Di conseguenza, se il microCT non è disponibile, in alternativa si utilizza Adobe Photoshop e raccogliendo il calvaria a tempi determinati per istologia.
- Utilizzando le macchie istologiche come anilina blu e Pentachrome che denotano la formazione osteoide, più sezioni lungo l'arco del difetto deve essere macchiato
- Utilizzo di Adobe Photoshop, ritagliare tutte le aree che non sononel difetto cranica
- Utilizzare la funzione di bacchetta magica e determinare il numero di pixel di formazione ossea de novo nella zona del difetto e confrontare ai controlli o altre variabili.
6. Risultati rappresentativi
Il tessuto adiposo è in grado di servire un ruolo fondamentale nella generazione di cellule progenitrici per l'applicazione clinica. Tessuto adiposo ha un vantaggio unico in quanto vi è una fornitura prontamente disponibile che può essere raccolta in una procedura relativamente semplice che coinvolge minima morbilità e mortalità. Una volta che il tessuto è raccolto e raccolto, il nostro protocollo è descritto nella Figura 2. Adipose cellule stromali sono isolate attraverso una serie di fasi di lavaggio, digestione con collagenasi e centrifugazione. Una volta che le cellule vengono piastrate in coltura, possono essere espansi, inseriti in vari protocolli di differenziazione in vitro, oppure direttamente in vivo.
Il cREAZIONE DI 4 mm critico-dimensione dei difetti cranica fornisce una facilmente accessibile e riproducibile nel modello in vivo per testare la capacità osteogenico differenziazione dei nostri derivate da tessuto adiposo cellule stromali. Attraverso l'uso di microCT, siamo in grado di seguire la formazione di tessuto scheletrico in vivo e monitorare l'avanzamento dei nostri interventi (Figura 3). Il critico-dimensione dei difetti cranica non guarirà entro la durata di vita degli animali e si vede circa il 90% del difetto rimane brevetto circa 8 settimane. Lo stesso ponteggio (vedi la discussione) ha osteogeniche proprietà induttivi e ha dimostrato la capacità di indurre un po 'di rigenerazione ossea. I risultati tipici di posizionamento scaffold senza cellule mostra che circa un terzo del difetto avrà de novo formazione ossea a 8 settimane. Con l'aumento della adipose cellule stromali, completamente due terzi o più del difetto mostrerà la rigenerazione ossea a circa 8 settimane anche se vi è Variability tra ogni animale e chirurgia. La formazione di tessuto scheletrico può essere quantificata mediante istologia e risultati tipici mostrano una eccessiva formazione di osteoide in campioni con ASC in blu di anilina e la colorazione Pentachrome (Figura 3C). Inoltre, abbiamo dimostrato che le cellule impiantate umani contribuiscono alla sottostante de novo formazione ossea attraverso l'uso di hASCs GFP-marcati che mostrano colorazione in vivo dopo 2 settimane vicino alla zona di formazione ossea de novo nel difetto cranica (Figura 3D) . Inoltre, utilizziamo immunoistochimica con anticorpo umano specifico per dimostrare la sopravvivenza delle cellule umane e contributo nella zona del difetto (Figura 3E).
Figura 1 A -. La lipoaspirate ha due strati. Lo strato superiore contiene gli adipociti e la maggior parte del prprocessa materiale cellulare, mentre lo strato inferiore contiene la soluzione salina utilizzata durante la procedura di lipoaspirazione. B - la creazione del difetto cranica attraverso una incisione sulla linea mediana pericranium per isolare l'osso parietale destro, successiva creazione di un 4 mm critica difetto imprese cranica senza interruzioni della dura sottostante dura.
Figura 2. Panoramica della raccolta e applicazione lipoaspirate dall'isolamento del adipose cellule stromali alla loro espansione, la differenziazione e l'uso in vitro e in vivo.
Figura 3. A-microCT che mostra in vivo la guarigione del difetto dimensione critica cranica con l'applicazione di ASC attraverso un hydroxyapatitie ponteggio (riga in basso). I controlli includono nessuna impalcatura e difetti (riga in alto) e il difetto con il posizionamento del ponteggio senza celle (riga centrale) B - Quantificazione di guarigione ossea dal microCT mostra guarigione significativamente aumentata nel gruppo ASC. C - Istologia mostrando una eccessiva formazione di osteoide del gruppo ASC (riga in basso) con blu di anilina e colorazione Pentachrome. Per anilina blu, le macchie osteoidi blu scuro e per Pentachrome, le macchie osteoidi giallo. D - hASCS marcate con GFP sono state seminate su un ponteggio e posta in un difetto cranica e sacrificati dopo 2 settimane. La colorazione è stata eseguita con un GFP anticorpo marcato per mostrare le cellule umane che contribuiscono alla rigenerazione nella zona del difetto. E -. Umano immunoistochimica dell'antigene nucleare che mostra la prevalenza di cellule umane nella zona del difetto a 2 settimane Clicca qui per ingrandire la figura .
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Discussion
Poiché l'isolamento di adiposo cellule stromali 2 da lipoaspirate, queste cellule sono state differenziate in una varietà di linee cellulari. Il tessuto adiposo è di origine mesodermica e, quindi, cellule stromali multipotenti derivate da tessuto adiposo sarà probabilmente più efficace con l'applicazione nei confronti di un lignaggio mesodermica. La capacità di generare tessuto scheletrico è particolarmente importante data la carenza di siti donatori per un innesto di osso autologo e le limitazioni intrinseche del materiale sintetico tra cui l'infezione, il rifiuto, e la ripartizione nel tempo 3. Cellule stromali derivate da tessuto adiposo autologo offrono un potenziale linea di cellule multipotenti con un 4 resa relativamente grande per ogni raccolto chirurgico.
Durante il trattamento della frazione stromale vascolare e tessuto adipociti, è importante mantenere un'eccellente tecnica sterile. Vi è un grande rischio di contaminazione della coltura principale data la natura grosso del lipoaspirate in combinazione con le fasi multiple di lavaggio, la digestione, e centrifugazione con gradini al di fuori della cappa sterile coltura cellulare. Una volta che il pellet è placcato sul piatto, la maggior parte delle celle visibili saranno eyrthrocytes. Questi possono essere lavati con PBS sterile volta adiposo cellule stromali hanno aderito alla piastra o globuli rossi del sangue tampone di lisi può essere aggiunto. È importante che le cellule sono relativamente confluenti sul gradino placcatura iniziale al fine di garantire la corretta crescita e differenziazione.
Non vi è consenso sul modo di definire con precisione le cellule stromali derivate da tessuto adiposo. Mentre ci sono stati studi cercando di definire questi popolazione di cellule basato su marcatori di superficie cellulare mediante citometria a flusso, trovare un insieme definito o marcatori è stato difficile. Questo è probabilmente dovuto alla variabilità nella popolazione di pazienti e la deriva fenotipica che queste esperienze cellule in vitro in diversi ambienti di coltura cellulare e variabilità nel pasnumeri di salvia. La Società Internazionale per la terapia cellulare ha dichiarato che, al minimo, una cellula staminale mesenchimale deve avere determinate caratteristiche tra cui l'espressione di CD105, CD90, CD73, in mancanza di CD45, CD34, CD14, CD11b, CD79α, CD19 e HLA-DR 5. La definizione originale del più potente natura di queste cellule è venuto dalla loro capacità di differenziarsi in cellule di linee mesodermiche in vitro e questi protocolli sono facilmente disponibili.
La critica di dimensioni modello difetto cranica è stato convalidato come modello per studiare la rigenerazione dello scheletro con entrambe le murine cellule stromali derivate da tessuto adiposo 6 e le cellule di derivazione umana derivate da tessuto adiposo stromali 1. La creazione di un difetto 4 mm calvaria parietale destro del mouse non guarirà nella vita dell'animale. Pertanto, qualsiasi guarigione visto è dovuto al trattamento collocato all'interno del difetto cranica. Durante il processo chirurgico, è particolarmente importante non Injunuovamente la dura dura sottostante. La dura madre si è in grado di stimolare l'osteogenesi e l'eventuale pregiudizio può ostacolare in modo significativo il processo di guarigione al difetto cranica 7.
Il f uso il patibolo come un meccanismo di consegna per le cellule staminali è particolarmente importante nel mondo dell'ingegneria scheletrico. La funzione del tessuto scheletrico è univocamente legato alla struttura tridimensionale del macro-ambiente. Il ponteggio non corretta può aiutare nella fornitura di cellule staminali in vivo, ma anche aumentare osteogenesi attraverso le migliorate proprietà osteogeniche del ponteggio stesso. Nostro laboratorio comprende idrossiapatite, un derivato di calcio, sul backbone PLGA causa delle proprietà osteoinduttrici e osteoconduttiva di questo materiale. Tuttavia, vi sono molte altre opzioni per la creazione scaffold che possono avere forti proprietà osteoinduttrici e osteoconduttiva 8, 9. Inoltre, l'impalcatura può anche essere usati per fornire tali adiuvanti potenticome piccole molecole 10, 11 e vettori di abbattere o upregulate obiettivi gene 12, 13.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare il Dott. Commons George e il Dr. Dean Vistnes per il loro sostegno e la collaborazione della nostra ricerca. Questo lavoro è supportato dal National Institute of Dental Research e borse di craniofacciale 1 R21 DE019274-01, R01EB009689 e RC2 DE020771-02, la Fondazione di quercia e Hagey Laboratorio di Medicina Rigenerativa di Pediatric MTL Dr. Hyun è supportato dal San Giuseppe Mercy Hospital GME .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipoaspirate Harvest | |||
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Cellgro | 21-023-CV | |
| Collagenase | Sigma | C6885-500MG | |
| Cell Strainer 100 μm | BD Falcon | 352360 | |
| Steri-top 500 ml .22 μm filter | Millipore | SCGPT05RE | |
| Calvarial Defect | |||
| Z500 Brushless MicromotorsUM50C | NSK | NSKZ500 | |
| Circular Knife 4.0 mm | Xemax Surgical | CK40 | |
References
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