Reparation av en kritisk storlek Calvarial Defekt modell med fett-härledda stromaceller skördas från Lipoaspirate

Summary

Detta protokoll beskriver isoleringen av fett-härledda stromaceller från lipoaspirate och skapandet av en 4 mm kritisk storlek calvarial defekt att utvärdera skelettet förnyelse.

Abstract

Kraniofaciala skelettet reparation och förnyelse erbjuder ett löfte om de novo vävnadsbildning genom en cell strategi använder stamceller. Adipos-härledda stromaceller (ASCs) har visat sig vara en rik källa av multipotenta stamceller med förmåga att undergå osteogena, kondrogena, adipogena och myogena differentiering. Många studier har utforskat den osteogena potentialen hos dessa celler in vivo med användning av olika ställningar biomaterial för cellulär leverans. Det har visats att genom att använda en osteokonduktivt, hydroxyapatit-belagd poly (mjölksyra-sam-glykolsyra) (HA-PLGA) byggnadsställning ympades med ASCs, en kritisk storlek calvarial defekt, ett fel som definieras av sin oförmåga att genomgå spontan helande under hela livstiden för djuret, kan effektivt visa robust bendefekter förnyelse. Detta in vivo-modell visar grunden för translationella metoder som syftar till att regenerera benvävnad - den cellulärakomponent och biologisk matris. Denna metod tjänar som en modell för den ultimata kliniska tillämpningen av en progenitorcell mot reparation av en specifik vävnad defekt.

Protocol

1. Cellisolering & utveckling

1. Alla patientens medgivande och experimentella protokoll granskades och godkändes av Stanford University Institutional Review Board (protokoll # 2188 och # 9999).
2. Skaffa mänskliga subkutan fettvävnad från elektiva lipoaspiration förfaranden enligt lokala / narkos.
3. Det kommer att finnas två lager i lipoaspirate (Figur 1A). Supernatanten innehåller den stora majoriteten av den bearbetade cellmaterialet. Bottenskiktet är mestadels injiceras saltlösning. Adipose härledda stromaceller kan skördas från endera skiktet, men utbytet är mycket större från supernatanten.
4. För att isolera den stromala vaskulära fraktionen (SVF), tvätta lipoaspirate utsträckning med lika volymer 1X fosfatbuffrad saltlösning (PBS) innehållande 2,5% Betadine (x2), följt av lika volym 1X PBS (x1) utan betadin. Låt tvätt till fällningen.
5. Var noga med att hålla steril technique hela processen som förorening med bearbetat mänsklig vävnad kan hända.
6. Aspirera bottenskiktet och kasseras efter varje tvätt.
7. Alikvotera 15 ml fettvävnad i 50 ml BD Falcon koniska rör.
8. Smälta fettvävnad med en lika stor volym (15 ml) av filtrerad 0,075% typ II kollagenas i Hanks balanserade saltlösning (HBSS) vid 37 ° C i ett vattenbad under 60 minuter under konstant omrörning (ca 180 skakningar / minut) - ventilera varje rör var 15 min.
9. Neutralisera enzymaktivitet med 15 ml PBS innehållande 10% (fetalt bovint serum) FBS, och centrifugera vid 1.000 rpm under 5 minuter vid 4 ° C för att erhålla en hög densitet SVF pelleten. Pelleten blir en blandning av fett som härrör-stromaceller och erytrocyter.
10. Kasta bort vätskefasen utan att störa pelleten.
11. Återsuspendera pelleten i 10 ml av traditionella tillväxtmedia (Dulbeccos modifierade Eagles medium [DMEM] / 10% FBS / 1% penicillin-streptomycin-lösning).
12. Filtrera upphävande sionen genom ett 100 nm nylon cell sil för att avlägsna cellrester.
13. Kombinera 3 rör i en ren 50 ml konisk. Centrifugera vid 1.000 rpm under 5 minuter vid 4 ° C.
14. Kasta bort vätskefasen utan att störa pelleten.
15. Återsuspendera pelleten i 5 ml traditionella odlingsmedier
16. Kombinera två 50 ml conicals per en 10 cm platta eller fem 50 ml conicals för en 15 cm platta.
17. Upprätta primära kulturer över natten vid 37 ° C/21% O _2, 5% CO _2.
18. Efter inkubation över natten, tvätta plattorna noggrant med PBS för att avlägsna kvarvarande icke-adherenta röda blodkroppar. De resulterande cellpopulationerna är adipösa-härledda stromaceller.
19. Behåll cellerna vid sub-konfluenta nivåer för att förhindra spontan differentiering vid 37 ° C/21% O _2, 5% CO ₂ i tillväxtmedium. Cellerna behöver i allmänhet delas var tre till fyra dagar i vanliga odlingsmedier vid pläterades vid 50% konfluens.

ve_title "> 2. Scaffold Förberedelse

1. Ställningar gjordes av Dr Min Lee vid University of California, Los Angeles - Tandläkarhögskolan.
2. PLGA ställningar tillverkades från 85/15 poly (mjölk-sam-glykolsyra) (inre viskositet = 0,61 dl / g, Birmingham Polymers) genom lösningsmedelsgjutning och ett partikelformigt lakningsprocessen.
3. PLGA / kloroform lösningarna blandades med 200-300 ^ m diameter sackaros för att erhålla 92% porositet (volymfraktion), och komprimeras till tunna ark i en Teflon-form.
4. Efter frystorkning över natten, byggnadsställningar nedsänktes i tre byten av dubbeldestillerat (dd) H ₂ O för att upplösa sackaros, och försiktigt avlägsnas från Teflon plattan med en fin spets spatel.
5. Efter partikelformigt urlakning, var alla ställningar desinficerats genom nedsänkning i 50%, 60% och 70% etanol under 30 min vardera, följt av tre sköljningar av Ddh ₂ O.
6. Alla ställningar torkades under ett laminärt flöde huva.
7. Efter byggnadsställning tillverkning, scaffolds belades med apatit.
   1. SBF (simulerad kroppsvätska) framställdes med jonkoncentrationer som var 5 gånger högre än för mänsklig blodplasma. Alla lösningar sterilfiltrerades genom en 0,22 pm membran PES (Nalgene). Omedelbart före beläggningsprocessen, torkades PLGA ställningar utsattes för glimurladdning, argon-plasmaetsning (Harrick Scientific) för att förbättra vätning och beläggning likformighet.
   2. Etsade PLGA ställningar inkuberades sedan i SBF vid 37 ° C inuti en vattenmantlad inkubator för 12 timmar, följt av Mg ^{2 +} och HCO ₃ ^- fri SBF 2 för ytterligare 12 h vid 37 ° C under varsam omröring.
   3. Belagda PLGA ställningar sköljdes försiktigt med steril DDH ₂ O för att tvätta bort överskott av natriumkloridlösning, torkades i en huv med laminärt flöde och desinficeras med 70% etanol.
   4. Integritet apatit beläggningen analyserades med ett svepelektronmikroskop (SEM). Apatit-belagd scaffolds monterades på SEM stubbar (Ted Pella) och överdragen med kol för att förbättra ledningsförmågan. Den sekundära elektron-läget tillämpades under SEM (FEI / Phillips XL-30) observation. Energi dispersionen röntgenspektrum erhölls för att bekräfta elementärt sammansättning apatit strukturerna.

3. Cellsådd

1. Vid ankomsten till sub-sammanflödet nivåer, tvätta cellerna med PBS (x2) och Trypsinisera.
2. Räkna cellerna för att kvantifiera för ympning
3. Frö på förskurna 4,0 ställningar mm diameter med 1,5 x 10 ⁵ celler.
   1. Placera enskild byggnadsställning i en brunn av en 96-brunnars platta
   2. Återuppslamma celler i vanliga tillväxtmedium med en koncentration av ungefär 1,5 x 10 ⁵ celler per 20 pl av media
   3. Pipettera 20 | il direkt på ställningen och placera den i cellodling inkubator under 30 minuter.
   4. Efter 30 minuter, tillsätt 200 pl av media och tillåta cellerna att inkuberapå ställningen natten före operation
   5. Det är inte nödvändigt att säkerställa vidhäftning av celler på ställningen som sådd ett tillräckligt antal celler kommer att säkerställa att en majoritet kommer att fästa på ställningen. Detta har bekräftats i vårt labb in vivo med bioluminiscens och histologisk analys.

4. Skapande av Calvarial Fel och in vivo implantation

1. Bedöva vuxen (60 dagar gamla) CD-1 nakna möss med bedövningsmedel cocktail. (Ketamin / xylazin / acepromazin) vid 50% koncentration (1:1 spädning med 0,9% NaCI) eller per rekommenderad anestesimetod per institutionens protokoll. Dessa möss är atymiska så hASCs inte kommer att orsaka en immunreaktion.
   1. Dosering: Ketamin-hydroklorid (80 mg / kg), xylazin (2,5 mg / kg) Acepromazin (2,5 mg / kg)
   2. Varaktighet för ikraftträdande: ca 30 min
2. Kirurgiskt drapera djuret och sterilisera kirurgiskawebbplats med Betadine och alkohol (x3) och täcka mus ögon med salva innan du köper en mittlinje sagittal snitt i hårbotten av djuret för att exponera rätt parietala ben. Ta bort HUVUDSKÅLSHINNA från höger parietala ben med trubbiga skrapning (Figur 1B).
3. Skapa en ensidig 4-mm full tjocklek defekt i höger icke sutur tillhörande parietala ben med en steril diamantbelagd trefin borr. Extrem försiktighet måste iakttas för att inte störa den underliggande dura mater (Figur 1B) som musen calvarial tjocklek är <0,3 mm.
4. Före implantering, skölj ställningar med steril PBS för att förhindra överföring av medium-härledda tillväxtfaktorer.
5. Placera ställningen i defekten.
6. Slutligen, sutur huden stängd och övervaka djuret per etablerade postoperativa protokoll.
7. Använd etablerade analgesi enligt din protokoll djurskötsel som behövs postoperativt-ex. buprenorfin 0,1 mg / kg..

5. Kvantifiering av osteoid Bildning

1. Efter microCT utfördes på mus, den tredimensionella bilden rekonstrueras med användning MicroView programvara som tidigare beskrivits ^1.
2. Med hjälp av Adobe Photoshop, var bilderna storlek till en standard höjd.
3. Använda Trollstaven funktionen var pixlar mätt i calvarial defekten.
4. Procentuell läkning av defekten bestämdes genom efterföljande datortomografi mäta calvarial defekta området och fastställa antal pixlar och dividera det med det ursprungliga felet är antal pixlar
5. Följaktligen, om microCT är tillgänglig, är ett alternativ att använda Adobe Photoshop och skörda calvaria vid bestämda tidpunkter för histologi.
6. Använda histologiska fläckar som Anilin Blue och Pentachrome som betecknar osteoid bildning, bör flera sektioner längs loppet av felet färgas
7. Med hjälp av Adobe Photoshop, beskära ut alla de områden som inte äri calvarial defekten
8. Använd trollstaven funktionen och bestämma pixel antal de novo benbildning i området defekten och jämför med kontroller eller andra variabler.

6. Representativa resultat

Fettvävnad har potential att tjäna en viktig roll i genereringen av progenitorceller för klinisk tillämpning. Fettvävnad har en unik fördel i att det finns en lättillgänglig tillgång som kan skördas på ett relativt enkelt förfarande som innebär minimal morbiditet och mortalitet. När vävnaden skördas och uppsamlas, är vår protokoll som beskrivs i figur 2. Adipösa-härledda stromaceller isoleras genom en serie tvättsteg, kollagenasdigerering och centrifugering. När cellerna pläteras i odling, kan de expanderas, placeras i olika differentiering protokoll in vitro, eller placeras direkt in vivo.

The creation av 4 mm kritiska storlek calvarial fel ger en lättillgänglig och reproducerbar in vivo-modell för att testa osteogena differentiering förmåga våra adipos-härledda stromaceller. Genom att använda microCT, kan vi följa bildandet av benvävnad in vivo och följa utvecklingen av våra insatser (Figur 3). Den kritiska storlek calvarial fel kommer inte läker inom den tid djuret och vi ser omkring 90% av felet kvarstår patentet runt 8 veckor. Ställningen själv (se diskussion) har osteogena induktiva egenskaper och har visat förmåga att inducera några beniga förnyelse. De typiska resultat byggnadsställning placering utan celler visar att ungefär en tredjedel av felet kommer att ha de novo benbildning vid 8 veckor. Med förstärkning av fett som härrör-stromaceller, fullt två tredjedelar eller mer av felet visar bendefekter regenerering vid runt 8 veckor även om det finns variabbilitet mellan varje djur och kirurgi. Bildningen av benvävnad kan kvantifieras genom histologi och typiska resultat visar ökad osteoid bildning i prover med ASCs genom Anilin Blue och Pentachrome färgning (figur 3C). Dessutom visar vi att de implanterade humana cellerna bidra till det underliggande de novo bendefekter bildning genom användning av GFP-märkta hASCs som visar färgning in vivo vid 2 veckor nära området av de novo benbildning i calvarial defekten (Fig. 3D) . Dessutom använder vi immunohistokemi med human antikropp för att visa mänsklig cell överlevnad och bidrag inom defekten (Figur 3E).

Figur 1 A -. Det lipoaspirate har två skikt. Det övre skiktet innehåller adipocyter och majoriteten av processes cellulärt material medan bottenskiktet innehåller saltlösningen används under lipoaspiration förfarandet. B - skapandet av calvarial defekten genom en mittlinjeincision över HUVUDSKÅLSHINNA att isolera rätt parietal ben, därefter skapa en 4 mm kritisk storlek calvarial fel utan avbrott i den underliggande dura mater.

Figur 2. Översikt över skörd och tillämpningen av lipoaspirate från isoleringen av adipösa härledda-stromaceller för deras expansion, differentiering och användning in vitro och in vivo.

Figur 3. A-microCT visar in vivo läkning av den kritiska storlek calvarial defekt med tillämpning av ASCs genom hydroxyapatitie byggnadsställning (nedersta raden). Kontroller inkluderar inte ställningen och fel (övre raden) och defekt med placering av ställningen utan celler (Middle Row) B - Kvantifiering av bendefekter helande från microCT visar signifikant ökad läkning i ASC-gruppen. C - Histologi visar ökad osteoid bildandet av ASC-gruppen (nedre raden) genom Anilin Blue och Pentachrome färgning. För anilinblått de osteoidstrukturer fläckar mörkblå och Pentachrome de osteoidstrukturer fläckar gula. D - var hASCS märkta med GFP sås på en byggnadsställning och placeras i en calvarial fel och offrades vid 2 veckor. Färgning utfördes med en GFP märkt antikropp för att visa de humana cellerna bidrar till regenerering i området för defekten. E -. Human nukleär antigen immunohistokemi visar förekomsten av mänskliga celler i området defekten vid 2 veckor Klicka här för att se större bild .

Discussion

Eftersom isoleringen av adipos-härledda stromalceller ² från lipoaspirate, har dessa celler blivit differentieras till ett stort antal olika cellulära linjer. Fettvävnad är från mesodermala ursprung och därför kommer multipotenta adipos-härledda stromaceller troligen vara mest effektiva med tillämpning mot en mesodermala härstamning. Förmågan att generera skelettvävnad är särskilt kritisk med tanke på bristen på donerade platser för en autogent och de inneboende begränsningar syntetiskt material, inklusive infektion, avvisande och fördelning över tiden ^3. Adipos-härledda stromal celler erbjuder en potentiell autogen linje multipotenta cell med en relativt stor avkastning ⁴ per kirurgisk skörd.

Under behandlingen av den stromala fraktionen vaskulära och fettceller vävnad, är det viktigt att upprätthålla utmärkt steril teknik. Det finns en stor risk för kontaminering av den primära kulturen tanke huvuddelen natur lipoaspirate kombineras med flera steg av tvätt, matsmältning, och centrifugering med steg utanför den sterila cellkulturen huva. När pelleten pläteras på skålen, kommer majoriteten av de synliga cellerna vara eyrthrocytes. Dessa kan tvättas bort med steril PBS när adipos-härledda kan stromaceller har vidhäftat till plattan eller röda blodkroppar lysbuffert tillsättas. Det är viktigt att cellerna är relativt sammanflytande på den initiala pläteringssteget för att säkerställa god tillväxt och differentiering.

Det råder ingen enighet om hur man exakt definierar adipos-härledda stromaceller. Medan det har studier som försöker definiera dessa population av celler baserat på cellytmarkörer genom flödescytometri, har hitta en definierad uppsättning eller markörer varit svårt. Detta beror sannolikt på variabilitet i patientpopulationen och den fenotypiska avdrift att dessa celler erfarenhet in vitro under olika miljöer cellkultur och variabilitet i passalvia nummer. International Society for Cellular Therapy uppgav att vid minst måste en mesenkymal stamcell ha vissa egenskaper, inklusive uttrycket av CD105, CD90, CD73, medan saknar CD45, CD34, CD14, CD11b, CD79α, CD19 och HLA-DR ^5. Den ursprungliga definitionen av multi-potenta naturen hos dessa celler kom från deras förmåga att differentiera till celler av mesodermala utvecklingslinjer in vitro och dessa protokoll är lätt tillgängliga.

Den kritiska storlek calvarial defekt modell har validerats som modell för att studera skelett regenerering med både murina adipos-härledda stromaceller ⁶ och humanhärrörande adipos-härledda stromaceller ^1. Skapandet av en 4 mm defekt i höger parietal calvaria av en mus kommer inte att läka i livet av djuret. Därför är varje läkning ses på grund av behandlingen placeras i calvarial defekten. Under den kirurgiska processen, är det särskilt viktigt att inte personskadorre underliggande dura mater. Dura mater själv kan stimulera osteogenes och skada kan avsevärt försvåra läkningsprocessen till calvarial defekten ^7.

Användningen f ställningen som en leverans mekanism för stamceller är särskilt viktigt i världen av skelettet ingenjörskonst. Funktionen av benvävnad är unikt relaterat till den tredimensionella strukturen av makro-miljön. Den rätta ställningen kan inte bara stöd i stamceller leverans in vivo, men också öka osteogenes genom förbättrade osteogena egenskaper ställningen själv. Vårt laboratorium innefattar hydroxiapatit, en kalcium-derivat, på PLGA-huvudkedjan på grund av de osteoinduktiva och osteokonduktiva egenskaperna hos detta material. Men det finns många andra alternativ för byggnadsställning skapelse som kan ha starka osteoinduktiva och osteokonduktiva egenskaper ^{8, 9.} Dessutom, kan byggnadsställningen också användas för att leverera kraftfulla adjuvans sådanasom små molekyler ^{10, 11} och vektorer för att slå ner eller uppreglera gen mål ^{12, 13.}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lipoaspirate Harvest
PBS	Gibco	10010-023
Hank's Balanced Salt Solution	Cellgro	21-023-CV
Collagenase	Sigma	C6885-500MG
Cell Strainer 100 μm	BD Falcon	352360
Steri-top 500 ml .22 μm filter	Millipore	SCGPT05RE
Calvarial Defect
Z500 Brushless MicromotorsUM50C	NSK	NSKZ500
Circular Knife 4.0 mm	Xemax Surgical	CK40