Summary
Een specifieke en gevoelige methode om inzicht te krijgen in de expressie profiel van glycosfingolipiden antigenen in het immuunsysteem organen en cellen wordt beschreven. De methode maakt gebruik van de ion trap massaspectrometrie waardoor stapsgewijze versnippering van glycosfingolipiden moleculen voor structurele analyse in vergelijking met chemisch gesynthetiseerde standaard.
Abstract
Glycosfingolipiden (GSL's) behoren tot de klasse van Glycoconjugaat biomacromoleculen die structurele informatie voor belangrijke biologische processen zoals embryonale ontwikkeling, signaaltransductie en immune receptorherkenning 1-2 dragen. Ze bevatten complex suikereenheden in de vorm van isomeren en lipide groepen met variaties zoals vet acyl ketenlengte, onverzadiging en hydroxylering. Zowel koolhydraten en ceramide delen kunnen basis van biologische betekenis. Bijvoorbeeld tri-hexosylceramides omvatten globotriaosylceramide (Galα4Galβ4Glcβ1Cer) en isoglobotriaosylceramide (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) die identieke moleculaire massa maar verschillende suikerkoppelingen van koolhydraatonderdeel verantwoordelijk voor totaal verschillende biologische functies hebben 3-4. In een ander voorbeeld is aangetoond dat modificatie van de ceramide van alpha-galactosylceramide, een krachtige agonist ligand voor invariant NKT cellen, verandert hun cytokine secretie profielen en functie in diermodellen van kanker en auto-immuunziekten 5. De moeilijkheid bij het uitvoeren van een structurele analyse van isomeren in immune organen en cellen dienen als een barrière voor het bepalen van vele biologische functies 6.
Hier geven we een gevisualiseerde uitvoeringsvorm van een werkwijze voor relatief eenvoudige, snelle en gevoelige analyse van glycosfingolipiden profielen in immuuncellen 7-9. Deze methode is gebaseerd op extractie en chemische modificatie (permethylation, zie figuur 5A hieronder, alle OH groepen zijn vervangen door hexose MeO na permethylation reactie) van glycosfingolipiden 10-15, gevolgd door daaropvolgende analyse met matrix-assisted laser desorptie / ionisatie time- of-flight massaspectrometrie (MALDI-TOF/MS) en ion trap massaspectrometrie. Deze methode vereist 50000000 immuuncellen voor een volledige analyse. De experimenten kan worden voltooid binnen een week. De relatieve hoeveelheden van de verschillende glycosfingolipiden worden afgebakend door vergelijking met synthetische normen. Deze methode heeft een gevoeligheid van 1% meten iGb3 onder Gb3 isomeren toen 2 fmol totale iGb3/Gb3 mengsel aanwezig 9.
Ion trap massaspectrometrie kan gebruikt worden om isomeren te analyseren. Bijvoorbeeld, de aanwezigheid van globotriaosylceramide en isoglobtriaosylceramide in hetzelfde monster te analyseren, kan men de fragmentatie van glycosfingolipiden moleculen structureel onderscheid tussen beide (zie hieronder figuur 5). Bovendien chemische modificatie van de suikergroepen (via een permethylation reactie) verbetert de ionisatie en fragmentatie efficiëntie voor een grotere gevoeligheid en specificiteit, en verhoogt de stabiliteit van siaalzuurresten. De extractie en chemische modificatie van glycosfingolipiden kan worden uitgevoerd in een gecertificeerde klassieke chemische afzuigkap en massaspectrometrie kan door kernfaciliteiten met ion trap MS instrumenten.
Protocol
1. Lab Bezorgdheid over veiligheid
- Alle organische oplosmiddelen moeten worden opgeslagen in specifieke gebieden met een duidelijk label. Zie labels door produceert voor soorten van de benodigde brandblussers.
- Gebruik gemaakt van verschillende reagentia zijn potentieel kankerverwekkend en kan depressie veroorzaken. Deze reagentia moeten worden behandeld in een chemische kap met ventilatie (zie tabel van specifieke reagentia en apparatuur voor bijzonderheden).
- Het wordt aanbevolen om bij het werken met organische oplosmiddelen en cellen, persoonlijke beschermingsmiddelen, zoals handschoenen, labjas, en oogbescherming worden gebruikt op elk moment.
2. Extractie van glycosfingolipiden van Rat leukemiecellen
- Store RBL rat leukemiecellen 8 (10 miljoen tot 100 miljoen) in 16x100 mm glazen buizen onder -80 ° C omstandigheden. Cellen worden geteld door een hemocytometer na trypan blauw kleuring. Levensvatbaarheid van cellen moet hoger zijn dan 95%.
- Pak de lipiden met behulp van uitgebreide sonication vier keer voor elke 1-2 uur met gemengde oplosmiddelen polariteit. Gebruik 6 ml chloroform-methanol 1:1 (v / v) als de eerste en laatste oplosmiddel. Zes milliliter isopropanol: hexaan: H 2 O 55:25:20 (v / v / v, bovenste fase verwijderd door afzuiging voor gebruik) kan vervolgens worden gebruikt als de tweede en derde oplosmiddel. Dit oplosmiddel wordt bereid door isopropanol: hexaan: H 2 O in een verhouding 55:25:20 goed schudden, en waardoor een bovenste fase verschijnt, die zal worden verwijderd. Houd de onderste fase voor gebruik.
- Volg sonicatie met centrifugeren om het onoplosbare materiaal pellet. Zwembad de supernatanten. Drogen in een Speedvac gedurende 4 uur. Stikstofstroom of roterende verdamper kan worden gebruikt als Speedvac niet beschikbaar. Gebruik een goede koude val te verdampte organische oplosmiddelen bevatten. Verontreiniging van organisch oplosmiddel in vacuümpompolie zal degraderen de efficiency van de vacuümpomp.
- Voer een voorlopige analyse met high performance dunnelaagchromatografie (HPTLC). Om glycolipiden kwantificerenBereid een 0,2% orcinol in 50% zwavelzuur (100 mg in 50 ml) en een standaard Galactose (40 mg in 100 ml voorraadoplossing). Bereid in 30 pl reactievolume een serie verdunningen te gebruiken als standaard curve (van 0 g / l tot 20 g / L). Voeg 20 ul van elk Methanol verdunningsreeks monster. Los elk monster glycolipide in 200 pl methanol, ultrasone trillingen, en gebruik 20 ul van glycolipide hoeveelheidsmeting. In 1,5 ml Eppendorf buisjes met draad caps (Sarstedt, 72.692.005), voeg 0,4 ml 0,2% orcinol in 50% zwavelzuur aan elk monster met een reeks Galactose-H 2 O-Methanol oplossingen die dienen voor standaardcurve . Koken 5 min in verwarmingsblok bij 100 ° C. Lees optische dichtheid van kleur reactie bij 440 nm met behulp van Sunrise Tecan Microplate Reader. Uitvoeren HPTLC gebruikt chloroform: methanol: H 2 O 60:35:8 (v / v / v) als oplosmiddel voor de neutrale lipiden behandeld met chloroform-methanol 1:1 (v / v). Gebruik isopropanol: hexaan: H 2 O 55:25:20 (v / v / v) alshet oplosmiddel voor het zuur lipiden (gangliosiden). Het geïsoleerde neutrale GSLs werd opgelost in 200 pi oplosmiddel chloroform: methanol 1:1 (v / v) en geladen op Merck silicagel dunnelaagchromatografie plaatje Drummond microcaps. De platen werden in oplosmiddel chloroform: methanol: H 2 O 60:35:8 (v / v / v) en gedroogd. De glycosfingolipiden werden gevisualiseerd door orcinol-zwavelzuur bij 300 ° C.
- Om scheiden van de neutrale lipiden uit de zure lipiden, fractie van de neutrale en zure lipiden door anionenuitwisselingschromatografie op een kleine kolom van DEAE Sephadex A-25 [the DEAE Sephadex A25 hars kan worden bereid door het weken Sephadex A-25 hars poeder in chloroform: methanol: H 2 O 30:60:8 (v / v / v) gedurende een nacht. Zuig het supernatant tot de Sephadex A25 hars wordt alles wat overblijft. Voeg verse chloroform: methanol: H 2 O 30:60:8 (v / v / v) aan de hars te wassen. Herhaal dit drie keer om de negatief geladen resten te verwijderen van Sephadex A25 hars].
- Ontbinden, Ultrasone trillingen (niet langer dan 10 min) en de lipiden uit stap 2.1 in chloroform resuspenderen: methanol: H 2 O 30:60:8 (v / v / v) te leveren.
- Bereid een kleine DEAE Sephadex A25 (Cl-formulier) kolom met behulp van glaswol en een 9 "Pasteur pipet. Verpak de glaswol zorgvuldig, zodat harspoeder niet door de kolom. Voeg DEAE Sephadex A25 (Cl-formulier) hars aan de" nek "van de 9" Pasteur pipet zonder dat de kolom droog. Zorg ervoor dat u geen hars in eluens te zien. De monsters opgelost in chloroform: methanol: H 2 O 30:60:8 (v / v / v) opgelost. De neutrale lipide fractie is de doorstroom fractie.
- Elueer het zure lipidenfractie (gebonden aan de harsen) met 8 ml natriumacetaat in methanol. Droog zowel de neutrale en zure fracties, hen door dialyse ontzouten, droog ze door Speedvac en analyseren door HPTLC.
De zure fractie bevat gangliosiden, die kan worden gedialyseerd Stap 3 reactie direct.De neutrale fractie bevat niet alleen neutrale glycosfingolipiden, maar ook fosfolipiden (fosfatidylcholine en sfingomyeline), die moet worden verwijderd door een acetylering reactie.
In onze ervaring, de methode van dialyse cassette, efficiënter en gemakkelijker dan een dialysebuis of omgekeerde fase C18 kolomchromatografie.
- De volgende stap is het verwijderen van fosfolipiden uit neutrale glycosfingolipiden door een acetylering en peracetylation reactie. Droog de DEAE Sephadex A-25 doorvoer fractie in de Speedvac (met koeling) gedurende 4 uur. Nadat de monsters droog zijn, zet ze terug in de Speedvac en droog gedurende nog eens 4 uur. Zorg ervoor dat deze monsters helemaal droog zijn, omdat het resterende water zal de peracetylation reactie te voorkomen.
- Peracetylate de monsters met 1 ml pyridine en 0,5 ml azijnzuuranhydride in het donker bij kamertemperatuur of 37 ° C geïncubeerd. Deze hoeveelheid pyridine en azijnzuuranhydride is juist voor uptot 200 ug glycosfingolipiden. Deze reactie kan worden uitgevoerd bij 37 ° C, de GSLs hebben betere oplosbaarheid.
- Droog de geperacetyleerde materiaal door Speedvac gedurende 3 uur, met de toevoeging van 1 ml tolueen 3x (coevaporation) om volledige verdamping verzekeren. Als de monsters nog steeds niet helemaal droog, Speedvac tot het droog is.
- Bereid een Florisil (Sigma-Aldrich) kolom (30-60 mesh, 10 x 80 mm) in een Pasteur pipet met glaswol, met Florisil kralen. Florisil beads moet volledig worden gedroogd voor gebruik door incubatie in een 110 ° C oven. Vul de kralen in de Pasteur pipet tot de hals en equilibreer in 1,2-dichloorethaan-hexaan 4:1 (v / v).
Elutie van de Florisil kolom is zeer snel. Snelle volatiliteit van de oplosmiddelen kan leiden tot kolom drogen. Dus alle oplosmiddelmengsels worden bereid voor het uitvoeren van de kolom aangezien het niet mogelijk om de waarde stoppen tijdens de elutie.
- Breng de peracetylated monster in 1 ml 1,2-dichloorethaan-hexaan 4:1 (v / v), en was de kolom met 6 ml van hetzelfde oplosmiddel, gevolgd door 10 ml 1,2-dichloorethaan. Elueren neutrale geperacetyleerde GSLs met 6 ml 1,2-dichloorethaan-aceton 1:1 (v / v). Deze stap verwijdert de geperacetyleerde fosfolipiden van glycosfingolipiden, omdat de geperacetyleerde glycosfingolipiden binden aan de Florisil kolom, terwijl geperacetyleerde fosfolipiden niet.
- Droog de fracties door Speedvac gedurende 2 uur en deacetylate met 2 ml 0,5 M natriummethoxide [Sigma-Aldrich, 403067] in 2 ml methanol gedurende 3 uur bij kamertemperatuur.
- Neutraliseer het mengsel met 3 ml van azijnzuur [azijnzuur / methanol 15/85 v / v], drogen Speedvac, ontzouten door dialyse [Los het gedroogde produkten in 3 ml water, en injecteer in de Slide-A-Lyzer Dialyse Cassette, dialyseren tegen water gedurende 24 uur. Ververs het water ten minste twee keer]. Droog de gedialyseerde GSLs (in water oplossing) door Speedvac totdat de monsters helemaal droog zijn.
3. Chemische modificatie (Permethylation) van glycosfingolipiden 13
- Introduceren GSLs (1-20 ug) naar een glazen buis met schroefdop en Teflon liner en voeg dimethylsulfoxide (150 pl) zonder speciale droogomstandigheden of inert gas atmosfeer.
- Bereid poedervormige natriumhydroxide (40-60 mg) van natriumhydroxide deeltjes door vermalen in een chemische mortier met een stamper. Zorg ervoor dat de poeders op te slaan in een zeer droge omgeving en voorzichtig zijn om het slijpen in de chemische kap te doen om te voorkomen dat het ademen van de poeders zijn.
- Voeg vervolgens de natriumhydroxide poeder aan de monsteroplossing met een spatel. Voeg joodmethaan (80 pl) met 100 microliter Halmilton spuit [of 100 microliter VWR gekalibreerde pipet verbonden met een spuit door rubber slangen kunnen worden gebruikt] en schud het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
- Quench de methylering reactie met water (2 ml). Pak de permethylated producten 3 keer doorde toevoeging van dichloormethaan (2 ml) [glycolipiden zijn in de dichloormethaanfase, de onderste fase, zodat de bovenste fase kan worden overgebracht naar een nieuwe glazen buis en geëxtraheerd met dichloormethaan opnieuw].
- Was de gecombineerde dichloormethaanextracten 3 maal met 2 ml water [de bovenste fase, die het water, kan vervolgens worden verwijderd]. Na de laatste wassing, breng de monsters naar een nieuwe buis en droog met de Speedvac.
- Monsters kunnen vervolgens worden opgelost in 100 tot 200 pl methanol voor ESI-MS analyse.
4. MALDI-TOF analyse van de Permethylated Gycosphingolipids
- Voer MALDI-TOF-MS en MALDI-TOF/TOF-MS/MS experimenten op MALDI TOF-TOF massaspectrometer (Applied Biosystems 4700, Foster City, CA). Bereid de matrix door het mengen van 50% volume van 10 mg / ml dihydroxybenzoëzuur (DHB) in acetonitril en 50% volume van 0,1% trifluorazijnzuur (TFA) in water.
- De DHB matrix kan worden gespot op de MALDI target (1 pi), gevolgd door 1 pi (bevattende 100 ng GSLs) spot monster opgelost in methanol. Breng langzaam en laat ze drogen voor de analyse.
5. Ion Trap MS analyse van Permethylated glycosfingolipiden
- Voer massaspectrometrie op een lineaire ion trap massaspectrometer (LTQ, ThermoScientific, San Jose, CA) met een Nanoelectrospray bron, 0,30 pl / min debiet bij 230 ° C capillaire temperatuur in positieve ionmodus met 30-50% botsingsenergie. Stel botsing energieën tot een minimale residuele overvloed aan precursorion verlaten. Detecteer alle ionen zoals natrium-adducten.
- Identificeer de iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) in een mengsel van isobare Gb3 (Galα4Galβ4Glcβ1Cer) en iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) normen door vergelijking van de verschillende patronen van MS 4 product ionen uit de sodiated molecuulion via de glycan fragment m / z 667 en de terminal disaccharide 1 - buteen ion m / z 445 (dat wil zeggenX → 667 → 445 →, X betekent dat de moleculaire ion gedetecteerd bij MS 1) van zuivere permethylated iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) normen via ESI-LIT-MS met die van permethylated Gb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer).
Representative Results
Een voorbeeld van een MALDI MS analyse van de glycosfingolipiden van rat leukemiecellijn RBL (een antigen presenterende cel die het glycosfingolipiden antigenen presenteert NKT cellen) wordt getoond in Figuur 3. De ionen kunnen worden toegewezen aan specifieke glycosfingolipiden structuren (Figuur 3A). In RBL-cellen behandeld met NB-DGJ 16, een geneesmiddel dat glycosfingolipiden synthese significante reductie van alle glycosfingolipiden waargenomen (Figuur 3B) remt. Structuurisomeren niet kan worden onderscheiden. De MS / MS capaciteit van de Applied Biosystems 4700 kan fragmentatie van ionen MS1 MS 2 fragmenten, waardoor beperkte structurele informatie te genereren. Echter MS2 analyse vaak niet voldoende om oligosaccharide isomeren discrimineren.
De Ion Trap-MS analyse van glycosfingolipiden maakt de studie van isomeren, zoals iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) en Gb3 (Galα4Galβ4Glcβ1Cer) die voorkomen als de trihexosylceramide ionen gedetecteerd in figuur 3A. Om dergelijke isomeren detecteren werden standaard iGb3 en Gb3 geanalyseerd door meerdere rondes van fragmentatie tot verschillen gevonden (Figuur 4A en 4B). In het voorbeeld hier gepresenteerd (figuur 5C) iGb3 en Gb3 kan worden gediscrimineerd door het vergelijken van de standaard iGb3 en Gb3.
Figuur 1. Stroomschema van de glycosfingolipiden extractieprocedure en chemische modificatie van glycosfingolipiden (permethylation). Glycosfingolipiden werden uit cellen door organische oplosmiddelen. Als u niet-glycosfingolipiden te verwijderen, kan lipiden zijn geperacetyleerde en gedeacetyleerd. Tweede glycosfingolipiden chemisch zijn gemodificeerd door een permethylation reactie die verbeterd gevoeligheid en specificiteit van MS detection. Tenslotte werden de glycosfingolipiden profielen bepaald met MALDI-TOF massaspectrometrie en ion trap massaspectrometrie.
Figuur 2. Glycosfingolipiden Kwantificatie door orcinol zwavelzuurmethode: Kwantificering van glycosfingolipiden toepassing van een 0,2% orcinol in 50% zwavelzuur en Glucose standaardcurve.
Figuur 3. Glycosphingolipidomics van rat leukemiecellen A. Representative MALDI massaspectrum;. Elk ion vormt een specifieke glycosfingolipiden structuur kunnen structurele isomeren niet te onderscheiden B. NB-DGJ, een medicijn dat glycosfingolipiden synthese s remt.ignificantly reduceert alle glycosfingolipiden geproduceerd in RBL-cellen.
Figuur 4. Tandem Massaspectrometrie van isomeren van glycosfingolipiden. A. Kenmerkend ontbinding trajecten voor positieve modus ion trap massaspectrometrie van permethylated GSLs Gb 3 Cer en IGB 3 Cer. Gb 3 en IGB 3 duidelijk gescheiden door hun fragmentatiepatronen. De verschillen in koppeling worden in de MS 4 product ionen in overeenstemming met de isobare m / z 445 precursors. B. Representatieve resultaten geeft iGB3 kan worden gemeten in een mengsel van isomeren iGb3/Gb3. Sterren geven diagnostische ionen voor iGb3 alleen. Klik hier omfoto voor vergroting figuur.
Figuur 5. Ion trap MS maakt analyse van isomeren van glycosfingolipiden. A. Standaard iGb3 en Gb3 tonen verschil van fragmentatie profiel na 4 rondes van fragmentatie in een ionenval LTQ massaspectrometer. B. Kenmerk MS 4 profiel van ionen afkomstig van iGb3 of Gb3. C. Trihexosyleramides zijn mengsels van iGb3 en Gb3 isomeren die kunnen worden geïdentificeerd door ion trap MS methode (figuur door Dapeng Zhou). Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Discussion
De glycome, een term die in analogie met het genoom en proteoom, verwijst naar alle saccharide structuren van een organisme. Om volledig te begrijpen het spruitstuk functies van glycosylering vereist een geïntegreerde aanpak waarin zowel functionele en structurele glycomics studies. Beide worden gecompliceerd door de non-template gerichte aard van glycan biosynthese de resulterende complexiteit en diversiteit van glycaanstructuren, er vaak van aglycone structuur moduleren glycan ligand-receptor interacties op moleculair niveau en het functionele belang van lage abundantie liganden.
Het is algemeen aanvaard dat massaspectrometrie (MS) is een onmisbare methode voor structurele studies glycomics, met name voor het identificeren en karakteriseren lage abundantie liganden. Om glycanen of glycoconjugaten als moleculaire species te observeren, maken we vaak gebruik van een zeer efficiënte, lage energie ionisatie methode, genaamd electrospray ionisatie (ESI). Meer detscheelde karakterisering van glycan structuur, is het essentieel om individuele moleculaire species selecteren en de glycanen breken in kleinere stukken. Dit wordt meestal gedaan door middel van botsing-geïnduceerde dissociatie, wat inhoudt dat het activeren van de glycanen door botsing met inert gas moleculen. De toegenomen energie induceert band breuk, en systematische analyse van de resulterende fragmenten geeft informatie over de moleculaire structuur van de glycan. Vaak kunnen "handtekening" fragmenten worden gegenereerd dat diagnostische zijn voor bepaalde glycan structurele kenmerken. Samen met de molecuulmassa Deze fragmenten kunnen soms voldoende voor het identificeren glycanen, maar in het verleden veel informatie nodig om volledig te karakteriseren, vooral als de structuur roman. Deze methoden bestaan uit suiker samenstelling analyse, gaschromatografie massaspectrometrie analyse van gedeeltelijk gemethyleerde alditol acetaten voor linkage analyse en specifieke glycosidase spijsvertering 17.
18-19, meerdere ronden van lage energie fragmentatie, die effectief kan worden uitgevoerd in een ion-trap massaspectrometer (IT-MS), verbetert de opbrengst van informatie glycan massaspectrale analyse . Met vier of vijf keer fragmentatie (die niet kan worden gedaan met andere MS instrumenten), is te onderscheiden isomere glycanen die dezelfde suikercomponenten gerangschikt in verschillende suikerkoppelingen bevatten, zelfs wanneer deze samen aanwezig in mengsels van componenten met dezelfde moleculaire massa (isobaren). Voor deze analyse de glycanen werden gederivatiseerd, ter vervanging van alle vrije hydroxylgroepen met methylgroepen met permethylation. Terwijl structurele toewijzing van de glycanen is mogelijk zonder permethylation, de permethylation verhoogt de gevoeligheid 17.
Levery en Zhou, hebben samen alle potentiële voordelen van IT-MS methode, zoals de detectie van isomere structures met signature diagnostische ionen, die slechts in 4 en MS MS spectra 5, voor de zeer gevoelige identificatie en kwantificering van glycosfingolipiden aanwezig in de vorm van meerdere isobare mengsels 7-9. In theorie kunnen we in staat zijn om elk bestaand glycolipide structuur te identificeren, in afwachting van de beschikbaarheid van standaard glycolipiden, die chemisch gesynthetiseerd kunnen worden.
De kritische stappen van deze analyse zijn de opbrengst van GSLs uit biologische monsters. Typisch 80 ug van GSL kan worden teruggevorderd van 100 miljoen tumorcellen, zoals RBL. Om voldoende moleculaire ionen voor meerdere ronden van fragmentatie in ion-trap massaspectrometers genereren, ten minste 10 microgram van tumor GSLs vereist. Lage opbrengst van GSLs gedurende zuivering leidt tot geringe hoeveelheden ionen, die niet konden worden onderworpen aan verdere fragmentatie. Het succes van de analyse is afhankelijk van de hoeveelheid GSLs die worden teruggewonnen. Typisch, eindconcentration van permethylated GSLs moet tot 1 mg / ml, opgelost in methanol, alvorens geanalyseerd op een nano-electrospray bron. De grens voor een grondige analyse MS n is afhankelijk van de hoeveelheden van specifieke ionen in MS 1 profiel. Een typische e 7 ion overvloed is voor een grondig MS 5 analyse. De lage opbrengst van GSLs tijdens zuivering kan worden veroorzaakt door verminderde GSLs tijdens peracetylation stap (waardoor de fosfolipiden), wanneer de per-geacetyleerde GSLs is gebonden aan Florisil hars chromatografiekolom, gewassen en vervolgens geëlueerd. De binding van per-geacetyleerd GSLs op silicagel waarborgen, moeten de monsters tweemaal geladen om de chromatografiekolom na doorstromen.
Disclosures
DZ is een consultant voor Biotex, Houston, TX, en een uitvinder die betrokken zijn bij patenten met betrekking tot technologieën genoemd in dit artikel, worden afgegeven of in de toepassing.
Acknowledgments
DZ wordt ondersteund door MD Anderson Cancer Center en NIH subsidies AI079232. MD Anderson Cancer Center wordt gedeeltelijk ondersteund door NIH subsidie CA16672.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2 Dichlor–thane | Sigma-Aldrich | 34872 | Carcinogenic |
| Acetic acid | VMR | JT9524-0 | |
| Acetic anhydride | Fluka | 45830 | |
| Acetone | Fischer | A18P-4 | |
| Chloroform | Fischer | C606-1 | Carcinogenic |
| DEAE Sephadex A25 (Cl Form) | GE Healthcare Biosciences | AB 17—170-01 | 100 gram |
| Decane (anhydrous): | Sigma-Aldrich | 457116 | 100 ml |
| Dichloroacetic acid | Sigma | D54702 | Carcinogenic |
| Dialysis cassette | Fischer(Pierce) | 66110 | Slide-A-Lyzer, 3500 MWCO, 3-12 ml |
| DMSO | Thermo Scientific | 20684 | |
| Ethyl acetate | Fischer | UN1173 | |
| Florisil | Fluka | 46384 | for packing chromatography column |
| Hexanes | EMD | HX0290-6 | |
| Iodomethane | Riedel de Haen, Germany | 03810 | stabilized with silver foil Carcinogenic |
| Methanol | VWR/EMD | MXO475-1 | |
| Neutral glycosphingolipid Qualmix | Matreya | 1505 | |
| Monosialganglioside mixture | Matreya | 1508 | |
| Disialoganglioside mixture | Matreya | 1509 | |
| Lactosyl ceramide and sialosylderivatives | Matreya | 1510 | |
| Gangliotetraosyl ceramide and sialosyl derivatives | Matreya | 1511 | |
| Pasteur pipettes | Fischer | 13-678-6A | 9"'' |
| Pyridine: | Sigma | 270407 | |
| Sodium Hydroxide: | BDH | 0292 | 500 gram |
| Sodium methoxide | Sigma | 404367 | 0.5 M solution in methanol |
| Toluene | J.T. Baker | 9351-03 | 4 L |
| Pasteur pipettes | Fischer | 13-678-6A | 9"'' |
| Fiber glass (glass wool) | Corning Incorporated | 3950 | Pyrex 9989 glass |
| 12x75 mm glass tubes | Fischer | 14-962-10B | |
| Calibrated pipettes (100 microlitter) | VMR | 53432-921 | |
| 16x100 mm disposible borosilicate tubes x1,000 | Fischer | 14-961-29 | With screw caps |
| Caps for glass tubes | Kimble | 40566C | size/13-415 |
| Merck TLC plates | Sigma | Z 29, 301-6 | |
| Glass tank for TLC | Sigma | Z 12,619-5 | |
| Drummond Microcaps | Drummond scientific company | 1-000-0100 | 10 μl, for loading of TLC samples |
| Sunrise Microplate Absorbance Reader | Tecan | A-5082 | |
| Whatman Chromatography Paper | Fischer | 05-716-3E | 18 cm x 34 cm For TLC Tank |
| Orcinol ferric chloride spray reagent | Sigma | O7875 | For detecting glycosphingolipids on TLC plates |
| Prevel Spray Unit | Sigma | Z 36,555-6 | |
| Sonicator | Fischer | FS20 | |
| Centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
| Speedvac | Savant | AS160 | With chemical trap for organic solvants |
| MALDI TOF-TOF Mass spectrometer | Applied Biosystems | Proteomics 4700 | |
| Ion Trap Mass spectrometer | Thermo | LTQ |
References
- Schnaar, R. L., Suzuki, A., Stanley, P. Chapter 10 Glycosphingolipids. Essentials of Glycobiology. Varki, A., Cummings, R. D., Esko, J. D., Freeze, H. H., Stanley, P., Bertozzi, C. R., Hart, G. W., Etzler, M. E. , 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2009).
- Bendelac, A. Chapter 17 NKT cells and other Innate-like T and B lineages. Fundamental Immunology. Paul, W. E. , 6th edition, Lippincott Williams & Wilkins. (2011).
- Jacewicz, M., Clausen, H., Nudelman, E., Donohue-Rolfe, A., Keusch, G. T. Pathogenesis of shigella diarrhea. XI. Isolation of a shigella toxin-binding glycolipid from rabbit jejunum and HeLa cells and its identification as globotriaosylceramide. J. Exp. Med. 163 (6), 1391-1404 (1986).
- Zhou, D. The immunological function of iGb3. Curr. Protein Pept. Sci. 7 (4), 325-333 (2006).
- Miyamoto, K., Miyake, S., Yamamura, T. A synthetic glycolipid prevents autoimmune encephalomyelitis by inducing TH2 bias of natural killer T cells. Nature. 413 (6855), 531-534 (2001).
- Zhou, D., Levery, S. B., Hsu, F. F., Wang, P. G., Teneberg, S., Almeida, I. C., Li, Y., Xu, H., Wang, L. X., Xia, C., Ibrahim, N. K., Michael, K. Immunologic mapping of glycomes: implications for cancer diagnosis and therapy. Frontiers in Bioscience. S3, 1520-1532 (2011).
- Li, Y., Thapa, P., Hawke, D., Kondo, Y., Furukawa, K., Furukawa, K., Hsu, F. F., Adlercreutz, D., Weadge, J., Palcic, M. M., Wang, P. G., Levery, S. B., Zhou, D. Immunologic glycosphingolipidomics and NKT cell development in mouse thymus. J. Proteome Res. 8 (6), 2740-2751 (2009).
- Li, Y., Zhou, D., Xia, C., Wang, P. G., Levery, S. B. Sensitive quantitation of isoglobotriaosylceramide in the presence of isobaric components using electrospray ionization-ion trap mass spectrometry. Glycobiology. 18 (2), 166-176 (2008).
- Li, Y., Teneberg, S., Thapa, P., Bendelac, A., Levery, S. B., Zhou, D. Sensitive detection of isoglobo and globo series tetraglycosylceramides in human thymus by ion trap mass spectrometry. Glycobiology. 18 (2), 158-165 (2008).
- Hakomori, S. I. A rapid permethylation of glycolipid, and polysaccharide catalyzed by methylsulfonyl carbanion in dimethyl sulfoxide. J. Biochem. (Tokyo). 55, 205 (1964).
- Ciucanu, I., Kerek, F. Rapid and simultaneous methylation of fatty and hydroxy fatty acids for gas-liquid chromatographic analysis. Carbohydr. Res. 131, 209 (1984).
- Kang, P., Mechref, Y., Klouckova, I., Novotny, M. V. Rapid Commun Mass Spectrom. 19 (23), 3421-3428 (2005).
- Levery, S. B., Hakomori, S. Microscale methylation analysis of glycolipids using capillary gas chromatography-chemical ionization mass fragmentography with selected ion monitoring. Methods Enzymol. 138, 13-25 (1987).
- Spooncer, E., Fukuda, M., Klock, J. C., Oates, J. E., Dell, A. Isolation and characterization of polyfucosylated lactosaminoglycan from human granulocytes. J. Biol. Chem. 259 (8), 4792-4801 (1984).
- Ciucanu, I., Costello, C. E. Elimination of oxidative degradation during the per-O-methylation of carbohydrates. J. Am. Chem. Soc. 125, 16213 (2003).
- Platt, F. M., Neises, G. R., Karlsson, G. B., Dwek, R. A., Butters, T. D. N-butyldeoxygalactonojirimycin inhibits glycolipid biosynthesis but does not affect N-linked oligosaccharide processing. J. Biol. Chem. 269 (43), 27108-27114 (1994).
- Mulloy, B., Hart, G. W., Stanley, P. Chapter 47 Structural Analysis of Glycans. Essentials of Glycobiology. Varki, A., Cummings, R. D., Esko, J. D., Freeze, H. H., Stanley, P., Bertozzi, C. R., Hart, G. W., Etzler, M. E. , 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2009).
- Ashline, D., Singh, S., Hanneman, A., Reinhold, V. Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 1. Mining structural details by MSn. Anal. Chem. 77 (19), 6250-6262 (2005).
- Zhang, H., Singh, S., Reinhold, V. N. Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 2. FragLib: an MSn spectral library. Anal. Chem. 77 (19), 6263-6270 (2005).
