Multi-target Parallel Processing Aanpak voor Gene-to-structuur bepalen van de Influenza Polymerase PB2 Subunit

Summary

Structure-based drug design speelt een belangrijke rol in de ontwikkeling van geneesmiddelen. Nastreven van meerdere doelen tegelijkertijd verhoogt de kans op succes voor lood ontdekking. Het volgende artikel belicht hoe de Seattle Structural Genomics Centrum Infectieziektebestrijding maakt gebruik van een multi-target benadering voor gen-tot-structuur bepaling van de PB2 influenza A subunit.

Abstract

Pandemieën van zeer virulente stammen influenza kunnen overal morbiditeit en mortaliteit in menselijke populaties wereld veroorzaakt. In de Verenigde Staten alleen al gemiddeld 41.400 doden en 1.860.000 ziekenhuisopnames veroorzaakt door influenza virus infectie elk jaar ^1. Puntmutaties in het polymerase basisch eiwit subunit 2 (PB2) zijn gekoppeld aan de aanpassing van de virale infectie in mensen ^2. Resultaten van die studies hebben de biologische betekenis van PB2 geopenbaard als een virulentie factor, waardoor het potentieel benadrukken als een antivirale drug target.

De structurele genomics-programma naar voren gebracht door het Nationaal Instituut voor Allergie en Infectieziekten (NIAID) financiert Emerald Bio en drie andere Pacific Northwest instellingen die samen de Seattle Structural Genomics Centrum voor Infectieziektebestrijding (SSGCID). De SSGCID is gewijd aan het verstrekken van de wetenschappelijke gemeenschap met drielandene-dimensionale eiwitstructuren van NIAID categorie AC pathogenen. Maken van dergelijke structurele informatie beschikbaar voor de wetenschappelijke gemeenschap dient te structure-based drug design versnellen.

Structure-based drug design speelt een belangrijke rol in de ontwikkeling van geneesmiddelen. Nastreven van meerdere doelen tegelijkertijd verhoogt de kans op succes voor de nieuwe lead discovery door gericht op een pad of een hele eiwit familie. Emerald Bio heeft een high-throughput, multi-target parallel processing pipeline (MTPP) voor gen-tot-structuur vastberadenheid om het consortium te ondersteunen ontwikkelde. Hier beschrijven we de protocollen die worden gebruikt om de structuur van de PB2 subeenheid bepalen vanuit vier verschillende influenza A-stammen.

Protocol

Een overzicht van het protocol is weergegeven in figuur 1.

Moleculaire Biologie

1. Construct Ontwerp

Gebruik Gene Composer om eiwit construct codon gemanipuleerde synthetische gensequenties ontwerpen. Het gebruik van Gene Composer software is aangeboden elders uitvoerig ^3.

1. Gebruik de Alignment Viewer Module en Construct Ontwerp Module aan eiwit sequentievergelijkingen vergelijken en bepalen eiwit construct. Lijn doelaminozuursequentie aan de primaire en 3D structurele elementen van homologen in de Protein Data Bank (PDB), indien beschikbaar (figuur 2).
2. Gebruik uitlijning informatie aan structuur-begeleide construct ontwerpen te maken door te kiezen voor nieuwe termini gebaseerd op het behoud van de primaire structuur en de 3D-structuren van homologen.
3. Ontwerp insert PCR (iPCR) en vector PCR (vPCR) amplimeren (klem primers).
4. Met behulp van Gene Composer het eiwit naar DNA algoritme back-vertalen construct aminozuursequentie in codon engineered nucleïnezuursequentie.
5. Gebruik de juiste codongebruik tafel (CUT) om de sequentie te optimaliseren voor expressie in E. coli.
6. Vrijwel klonen inzetstuk in pET28 vector gemodificeerd om een ​​N-terminaal 6x histidine-tag en Smt3/SUMO fusie-eiwit dat zorgt voor eenvoudige reiniging nemen.
7. Plaats synthetisch gen om met DNA 2.0 en orde primers van Integrated DNA Technologies.

2. Polymerase Onvolledige Primer Extension (PIPE) Cloning

1. Bereid Primers en Genen
   1. Centrifugeer de leverancier verstrekte platen met primers bij 1000 rpm gedurende 1 minuut.
   2. Breng primer concentratie 100 pM en voeg 50 ul TE-buffer.
   3. Verdun tot 10 uM primers met gedeïoniseerd (DI) water in een 96-well V-bodemplaat.
   4. Centrifugeer de leverancier verstrekte gen in een 1,5 ml buis bij 1300 rpm gedurende 1 minuut.
   5. In 1,5 ml buizen maken verdunningen van elke primer en 10 ng / ul.
   6. WINKEL primers en genen bij -20 ° C indien niet in gebruik.
2. Bereid Insert PCR (iPCR)
   1. Ontdooi een flacon van Pfu Master Mix op ijs; houden genen en primers bij kamertemperatuur.
   2. Een plaat kaart toewijzen putten een set van primers en construeren.
   3. Voeg 13 ul van DI water in elk putje van een 96-well PCR plaat.
   4. Voeg 5 ul van voorwaartse en 5 ui reverse primer aan elke reactie in de 96-well plaat volgens de plaat kaart, waardoor tips tussen elk putje veranderen.
   5. Voeg 2 pi van elk gen van volledige lengte zijn geschikt voor toepassing volgens de plaat kaart.
   6. Voeg 25 ul van Pfu master mix aan elk putje, zorgen om tips tussen elk putje te veranderen.
   7. Schakel de reacties met de volgende PCR-omstandigheden:
      1. 95 ° C 2 min 95 ° C 30 sec
      2. 50 ° C 45 sec
      3. 68 ° C 3 min
      4. 4 ° C ∞
   8. Herhaal de stappen bd voor 25 cycli.
   9. Breng 10 pl van elk iPCR reactie op een nieuwe 96-well PCR plaat.
   10. Voeg 3 ul van 6X lading kleurstof aan elk monster.
   11. Scheid elk monster op een 1% TAE agarose gel EtBr 110V naast een 100-500 bp DNA fragment amplificatie ladder te bevestigen.
   12. WINKEL iPCR product bij -20 ° C indien niet in gebruik (vermijd bevriezen ontdooien zoveel mogelijk).

3. Bereid Vector PCR (vPCR)

1. Begin overnacht cultuur van getransformeerde E. coli met pET28 vector plasmide.
   1. Inoculeer twee 5 ml tubes 2 YT-bouillon met 50 ug / ml kanamycine.
   2. Groeien kweken overnacht bij 37 ° C schudder bij 220 rpm.
2. Spin down culturen na groei gedurende de nacht door centrifugeren bij 3000 rpm gedurende 15 minuten.
3. Gebruik een Qiagen QIAprep Spin Miniprep Kit voor pET28 vector onttrekken bacteriële pellets volgens de instructies van de fabrikant.
4. Setup restrictie-enzym digesties van gewonnen pET28 plasmide.
   1. Voeg 2,2 ui 10X BamHI-buffer en 1 ui BamHI en HindIII 20 ui vector pET28.
   2. Incubeer reactiemengsel gedurende 1 uur bij 37 ° C.
5. Afzonderlijke digestieproduct op een gel.
   1. Raadpleeg stap 2.2.10.
   2. Gesneden vector band uit gel en zuiveren met behulp van de QIAquick Gel Extraction Kit volgens de instructies van de fabrikant.
6. Met behulp van een NanoDrop, kwantificeren DNA-concentratie.
7. Verdunnen cut vector tot 10 ng / ul. Bewaar bij -20 ° C indien niet in gebruik.
8. Bereid vPCR primers.
   1. Centrifugeer IDT geleverd oligonucliotides gedurende 1 min bij 1300 rpm.
   2. Breng concentratie tot 100 uM met DI-water.
   3. Bereid 10 uM verdunning van zowel voorwaartse en achterwaartse primers in een 1,5 ml buis.
   4. WINKEL primers en primer verdunningen bij -20 ° C.
9. Dooi Pfu Master Mix op ijs en dooi template en primers bij kamertemperatuur.
10. Setup vPCR reacties in een 96-wells PCR-plaat:
    1. In de eerste rij van een 96-well plaat combineren 60 ui voorwaartse en reverse primers vPCR en 24 gl gedigereerd pET28 matrijs (10 ng / ul).
    2. Met behulp van een 12-tip multichannel pipet 12 ul van de primer en een sjabloon master mix aan elk resterende putje van de plaat. Dit moet resulteren in 12 ul van primer en template master mix in elk putje van de plaat.
    3. Voeg 13 ul van DI water aan elk putje.
    4. Voeg 25 ul van Pfu Master Mix aan elk putje.
11. Cyclus van de reacties via de PCR-condities gebruikt in stap 2.2.7.
12. Pool alle vPCR reacties in een 15 ml Falcon buis.
13. Controleer fragment amplificatie door het scheiden 10 ui gepoolde PCR product op een gel (verwachte lengte van gedigereerde vector pET28ongeveer 6 kb).
    1. Raadpleeg stap 2.2.10.
14. Bereid samenvoegen platen.
    1. Aliquot 3 pl vPCR product in elk putje van een 96-well V-bodemplaat.
    2. WINKEL platen bij -20 ° C tot fusie met iPCR product.

4. Samenvoegen iPCR en vPCR Producten

1. Ontdooien iPCR producten en pre-porties vPCR 96 putjes samengevoegd bij kamertemperatuur.
2. Voeg 3 pi van elke iPCR product aan hun respectieve goed van de merge plaat.
3. Transformeren samenvoegen plaat in Top Tien chemisch competente cellen.
4. Voeg 2 pi van elke merge reactie in een 50 pl buis van vendor-geleverde chemisch competente cellen en ga verder met door de fabrikant geleverde protocol.
5. Bereid overnachtkweken voor elk construct van transformatie plaat.
6. Aliquot 5 ml TB bouillon (met 50 ug / ml kanamycine) uit een 25 ml steriele reservoir in elk putje van een diepe put blok.
7. Met behulp van sterile techniek, kies een geïsoleerde kolonie van elke transformatie bord en enten van de juiste bron van de diepe put blok.
8. Bedek het blok met een Airpore deksel.
9. Schud blok 220 rpm bij 37 ° C geïncubeerd.
10. Pellet cellen door centrifugeren van het blok gedurende 30 min bij 4000 rpm.
11. Giet het supernatant en dep de bovenkant van het blok droog met een papieren handdoek.
12. Mini-prep met een Qiagen 96 putjes vacuuminrichting volgens de instructies van de fabrikant.

5. Bereiden glycerol voorraden van succesvol Gekloonde Constructs

1. Transformatie met succes gekloneerde sequentie gevalideerd DNA in BL21 (DE3) chemisch competente cellen volgens de instructies van de fabrikant.
2. Voor elk construct, kies een afgelegen kolonie van de BL21 (DE3) transformatie en enten in 1 ml 2-YT bouillon (met 50 ug / ml kanamycine).
3. Schud kweken bij 220 rpm gedurende 3-4 uur bij 37 ° C.
4. Label een 1,5 mlschroefdop buis met de unieke constructie identificatienummer, celstam, en datum. Voeg 500 ul van 50% glycerol en 500 ul celkweek en zwenken meerdere malen. Onmiddellijk slaan glycerol voorraad op droog ijs of in een -80 ° C vriezer.

6. Expression Testen

Lysis Buffe r	Wash Buffer	Elution Buffer
50 mM NaH 2PO 4, pH 8,0 300 mM NaCl 10 mM imidazool 1% Tween 20 2 mM MgCl2 0,1 ul / ml Benzonase 1 mg / ml lysozym	50 mM NaH 2PO 4, pH 8,0 300 mM NaCl 20 mM imidazool 0,05% Tween 20	25 mM Tris, pH 8,0 300 mM NaCl 250 mM imidazool 0,05% Tween 20

* Benzonase toevoegen, lysozym,en protease inhibitor onmiddellijk vóór lyse.

1. Streak een monster uit glycerol voorraad op kanamycine selectieve agar en incubeer overnacht bij 37 ° C.
2. Start een niet-inducerende pre-culture in een 96-putjes met ronde bodem blok, ent 1,2 ml TB medium (met 50 mg / ml kanamycine) aangevuld met 0,5% glucose met vers gekweekte E. coli isoleren. Grow 's nachts schudden bij 220 tpm bij 37 ° C.
3. Na een nacht kweken, start inductie kweken door het enten van 1,2 ml TB medium (met 50 mg / ml kanamycine) gesupplementeerd met Novagen Overnight Express Systeem 1 (volgens het protocol van de fabrikant) met 40 ul van de pre-cultuur.
4. Grow de kleinschalige inductie kweken bij 20 ° C gedurende 48 uur, schudden bij 220 rpm.
5. Oogst cellen door centrifugeren bij 4000 rpm gedurende 15 min, giet supernatant en bewaar bij -20 ° C gedurende ten minste 1 uur vóór de verwerking.
6. In het 96-well blok, resuspendeer de celpellets in 300 pi lysisbuffer. Incubeer cellen in lysis buffer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten gevolgd door een mechanische lysis door schudden gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
7. Verduidelijken het ruwe lysaat door centrifugatie gedurende 30 minuten bij 4000 rpm bij 4 ° C.
8. Gebruik van een multi-channel pipet 200 ul van de geklaarde lysaat (oplosbare fractie) over aan een 96 putjes vlakke bodemplaat (Qiagen). Voor elk putje een monster, voeg 40 pl Ni-NTA magnetische korrels (Qiagen).
9. Schud voorzichtig de plaat op een rocker gedurende 1 uur bij 16 ° C.
10. Plaats de plaat op een magnetische paal plaat (Qiagen) en verwijder de ongebonden oplosbare fractie. Zorg om geen pipet uit een van de Ni-NTA beads.
11. Verwijder de plaat uit de post plaat en voorzichtig geresuspendeerd de kralen in 200 ul wasbuffer. Pipet op en neer gedurende 30 seconden en plaats de plaat terug op de post plaat.
12. Verwijder de wasbuffer en herhaal stap 6.12.
13. Verwijder de plaat uit post plaat en elueren de Ni-NTA gebonden target eiwit door wassen met 50 ul elutiebuffer gedurende 5 minuten.
14. Terug vlakke bodemplaat aan magnetische bericht plaat en breng de elutie om een ​​frisse 96-v-bodemplaat.
15. Breng 20 pl van de elutie om een ​​nieuwe 96-well V-bodemplaat en 1 pi ULP1 protease reageren.
16. Volgens protocol van de fabrikant, het analyseren van de geëlueerde en geëlueerd + Ulp1 fractie door capillaire elektroforese met een LabChip 90.
17. Alternatief kunnen alle fracties uit de expressie tests geanalyseerd via SDS-PAGE.

7. Fermentatie op grote schaal

1. Gebruik een steriele pipet tip om een ​​schrapen verkrijgen uit een glycerol voorraad, enten 100 ml TB bouillon (met 50 mg / ml kanamycine) en groeien 's nachts. Schudden bij 220 rpm en 37 ° C.
2. Na een nacht groei, uitbreiding van pre-cultuur door het enten 1 L van TB bouillon met EMD autoinductie oplossingen (zie protocol van de fabrikant) (met 50 mg / ml kanamycine) in een 2 L chicanekolven met 10 ml van depre-cultuur (1:100 verdunning).
3. Schud de geëxpandeerde 1 L kweken bij 37 ° C, verandert de temperatuur van de incubator schudden tot 20 ° C bij een optische dichtheid van 0,6 (OD ₆₀₀₎ wordt bereikt.
4. Na een nacht groei, een representatief 10 ml aliquot van elk construct voor expressie testen.
5. Celpasta oogst door centrifugatie bij 5000 rpm gedurende 15 min en gooi supernatant.
6. Freeze cel plakken bij -80 ° C.

Eiwitzuivering

Buffers:

Lysis Buffer	Buffer A (Equilibration)	Buffer B (elutie)	Sizing Column Buffer
25 mM Tris, pH 8,0 200 mM NaCl 0,5% glycerol 0,02% CHAPS 10 mM imidazool 1 mM TCEP 50 mM Arginine 5 pl Benzonase 100 mg lysozym 3 Proteaseremmer Tabletten (EDTA-free)	25 mM Tris, pH 8,0 200 mM NaCl 10 mM imidazool 1 mM TCEP 50 mM Arginine 0.25% glycerol	25 mM Tris, pH 8,0 200 mM NaCl 200 mM imidazool 1 mM TCEP	25 mM Tris, pH 8,0 200 mM NaCl 1% glycerol 1 mM TCEP

* Voeg Benzonase, lysozym, en proteaseremmer tabletten u elke 150 ml monster onmiddellijk voor lysis.

8. Cell Lysis

1. Voeg 2 L lysis buffer, niet lysozym, protease inhibitor tabletten of benzonase (elk monster afzonderlijk gelyseerd in 150 ml lysis buffer) toegevoegd.
2. Ontdooien en resuspendeer celpasta in lysis buffer op 01:05 gewicht: volume verhouding door krachtig roeren gedurende 30 minuten bij 4 ° C. Breken brokken los van zijkanten van de beker met een schone spatel. Gedurende deze periode bereiden Ni en Dialysis Buffers
3. Op ijs, lyseren van de cellen met een Misonix sonicator (70% vermogen, 2 sec aan / 1 sec uit pulsen gedurende 3 min) en container voorzichtig zwenken om oververhitting te voorkomen. Sla een klein (200 pl) hoeveelheid van ruw lysaat voor toekomstige analyse.
4. Verduidelijken het ruwe lysaat door centrifugatie bij 18.000 xg gedurende 35 min bij 4 ° C, verzamel de supernatant en slaan een kleine (200 ul) aliquot voor toekomstige analyse. WINKEL pellet bij 4 ° C totdat het wordt bevestigd eiwit gelyseerd in de oplosbare fractie.

9. Pre-run Protein Maker Setup

1. Met het eiwit maker aangezet en de software te openen, initialiseren van het instrument.
2. Eenmaal geïnitialiseerd, plak een 5,0 ml GE Healthcare HisTrap FF Nikkel-chelaatkolom (Ni column) op een aparte lijn van het portaal voor elk van de monsters.
3. Run 3-4 kolomvolumes (CV) van equilibreerbuffer door elke kolom.
4. Primen het evenwicht en elutiebuffer lijnen.
5. Equilibrat de kolommen opzuigen buffer A door de kolom eenmaal.

10. Nikkel 1 (Ni1) Column

1. Wassen elke kolom met 20 ml Milli-Q water tot opslag buffer te verwijderen. Run 5 ml buffer B en 25 ml buffer A voor evenwicht.
2. Laad de geklaarde lysaat bevattende oplosbaar eiwit in de kolommen met een snelheid van 2 ml / min daarna volgen door een 15 ml wassing met buffer A.
3. Elueren van het gebonden eiwit in een stap verloop met buffers A en B door de volgende verhoudingen respectvol: 5 ml 95:5, 5 ml 60:40, 10 ml 0:100. Verzamel elk elutiefractie afzonderlijk.
4. Analyseren: geëlueerde fracties, ruw lysaat, verduidelijkt lysaat en doorstroming door SDS-PAGE. Pool fracties die het eiwit en gebruikt een Nanodrop meten A ₂₈₀ tot ongeveer het bedrag aanwezig eiwit.

11. ULP1 Splitsing

1. Houd een kleine hoeveelheid (250 pl) van de Ni1 kolom zwembad voor latere gelanalyse. Breng de restvan de Ni1 zwembad tot 10 ml en voeg ubiquitine-achtige protease 1 (ULP1) op 1 pl / 5 mg totaal eiwit aan het His-Smt affiniteitslabel verwijderen.
2. Dialyseer de Ni1 pool + ULP1 tegen 2 L buffer A gedurende 4 uur bij 4 ° C in een 10 kDa moleculair gewicht cutoff (MWCO) op een roerplaat bij 4 ° C.
3. Na de dialyse uitvoeren SDS-PAGE van Ni1 zwembad en Ni1 zwembad + ULP1 om te bepalen of ULP1 decollete succesvol was.

12. Nikkel 2 (Ni2) Column

1. Laad gekloofd eiwit over dezelfde kolom Ni en herhaal stap 9.3 tegen een gereduceerd debiet van 1 ml / min. Het gesplitste off tag zal binden aan de kolom en de tagless doelproteïne stroomt nu-door. Verzamel de doorstroming in een nieuwe container.
2. Was Ni kolom met 3 ml buffer A, gevolgd door 5 ml buffer B tot alle His-tag en specifiek gebonden eiwit elueert. Verzamel elke fractie afzonderlijk.
3. Run SDS-PAGE van Ni2 doorstroom, wassen en Ni2 elutiefracties om ULP1 decollete controleren en dat protein aanwezig in de doorstroom. Gebruik Nanodrop meten A ₂₈₀ om de aanwezigheid van eiwit ruwweg bepalen.

13. Concentreren

1. Concentreer de Ni2 doorstroom (en Ni2 elutie of eiwit aanwezig is) om een ​​Amicon Ultra 10 kDa MWCO centrifugebuis 5 ml. Spin in 10 min intervallen bij 4.000 tpm bij 4 ° C. Meng met een pipet tussen elke draai om eiwitten te voorkomen over-concentratie langs membraan.

14. Maat-uitsluiting chromatografie (SEC)

1. Stel een Sephacryl S-100 10/30 GL kolom (GE gezondheidszorg) door equilibreren met 200 ml SEC buffer met een stroomsnelheid van 0,5 ml / min op AKTApurifier systeem (GE Healthcare).
2. Bereid 10 ml superloops voor gebruik op de kolom SEC volgens de instructies van de fabrikant.
3. Met behulp van een 5 ml spuit, laden monsters op superloops en beginnen de SEC run.
4. Toezien op de UV-absorptie trace bij 280 nm, terwijl het verzamelen klein volume fracties.
5. Voer SEC fracties via SDS-PAGE.
6. Zwembad de SEC fracties met de hoogste intensiteit bands.
7. Concentreer gepoolde SEC fracties. Zie stap 13.1.
8. Aliquot eiwit in 100 ul monsters, flash bevriezen in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 ° C.

KRISTALLISATIE

15. Eiwit Kristallisatie

1. Pre-fill elk reservoir van een 96-well Compact Jr kristallisatie (Emerald Bio) met 80 ul van kristallisatie scherm (Emerald Bio) naar keuze.
2. Verdunnen eiwit met dimensionering buffer tot 2-20 mg / ml en op te slaan op ijs.
3. Doseer 0,4 ul van eiwitten en 0,4 ul van de kristallisatie scherm in elk van de 96-wells en bedek met kristalhelder afdichtingsband (Manco).
4. Bewaar de plaat bij 16 ° C, terwijl het controleren op eiwitkristallisatie periodiek de komende weken onder een dissectie microscoop.

16. Crystal Oogsten </ P>

1. Maak een cryoprotectant van de moederloog en ethyleenglycol. Snijd de duidelijke tape op de goed bij de doelgroep eiwit kristal. Een lege well 1.6 ul van de desbetreffende aandoening en kristalliserende combineren met 0,4 gl ethyleenglycol waardoor een eindconcentratie van 20% ethyleenglycol en 80% kristalliseren conditie. Opmerking: voor kristaldiffractie optimaliseren proberen verschillende cryobeschermingsmiddelen zoals glycerol, oliën, lage MW polyethyleenglycolen en / of variërende percentages van het koude beschermend middel.
2. Voor de oogst afkoelen een ALS-stijl puck in een Dewar gevuld met vloeibare stikstof en dek af met deksel.
3. Oogst de kristallen door een CryoLoop de binnendiameter overeenkomt met de grootte van het kristal op een magnetische Crystal Wand (Hampton Research) en schep het rechtstreeks uit de bron oplossing.
4. Onmiddellijk dip de CryoLoop met de geoogste kristal in de cryoprotectant vervolgens onderdompelen in de ALS-stijl puck te knipperen bevriezen de crystal. Herhalen voor een gewenst aantal kristallen.

17. Crystal Screening / Data Collection

1. Zodra oogsten is voltooid gebruik een puck toverstok om de magnetische cryo puck deksel leggen op de ALS puck. Met gebogen tang, flip de puck op zijn kop.
2. Breng de puck naar een Rigaku ACTEUR Dewar, schroef een Puck Pusher op de puck, en pons het deksel eraf verlaten van het in de Dewar met pennen naar boven.
3. Met behulp JDirector software, scherm elk kristal onder de volgende parameters: beam spleet ingesteld op 0,5 graden, detector afstand ingesteld op 50 mm, image stap naar 70 graden, en de lengte belichting ingesteld op 30 sec.
4. Draaien Mosflm op de test beelden die u opnam met JDirector te bepalen wat de beste kristal en strategie is voor het verzamelen van gegevens.
5. Verzamel een volledige dataset op basis van uw resultaten uit Mosflm.

18. Data Processing / structuurbepaling

1. Run XDS / XSCALE ⁴ op de dataset te verwerken.
2. Open de CCP4 suite software.
   1. Run Phaser ⁵ een moleculaire vervangende oplossing om met een hoge homologie zoeken model, indien beschikbaar berekenen. In dit geval hebben we de PDBID 3CW4 als een zoektocht model ^6.
   2. Run Refmac ⁷ om uw moleculair model te verfijnen tegen de waargenomen reflectie in de dataset verzameld. Definitieve oplossing moet worden gebaseerd off van de hoogste schaal en wordt bepaald door de volgende parameters: R-factor> 50%, I / sigma> 2 en volledigheid> 90%.
3. Bouw een 3-dimensionale elektronendichtheid model met de moleculaire grafische software COOT ^8.
4. Vóór de neerlegging van de structuur van het VOB valideren met MolProbity ⁹ software om die kwaliteit van de structuur controleren is geschikt voor depositie.

Representative Results

De volgende resultaten illustreren de verwachte resultaten van de beschreven protocol, en bij PB2, de waargenomen resultaten.

Gebruik Gene Composer, vijf full-length doelwit aminozuursequenties van het influenzavirus PB2 polymerase subunit werden ontworpen (Figuur 2). De PB2 sequenties werden terugvertaald en onderworpen aan vele technische stappen ^3, resulterend in codon geharmoniseerde sequenties geoptimaliseerd voor expressie in E. coli. Uit de iPCR producten (figuur 3b), een totaal van vierendertig constructen werden succesvol gekloneerd in een gemodificeerde vector pET28 systeem ¹⁰ met een N-terminaal 6x His-tag fusie Smt middels PIPE klonering ³ zoals getoond in figuur 3a. Een samenvatting van de klonen workflow wordt weergegeven in figuur 4.

Na succesvolle klonen, werd micro-schaal eiwit expressie van elk construct in BL21 (DE3) E. getestcoli cellen. Cellen werden gekweekt in TB-medium aangevuld met Novagen Overnight Express 1 medium (volgens het protocol van de fabrikant) gedurende 48 uur bij 20 ° C in een schuddend incubator ingesteld op 220 rpm. Na groei werden de cellen geoogst en getest op oplosbare proteïne expressie met behulp van capillaire elektroforese met een schuifmaat LabChip 90. Veertien van de vierendertig PB2 constructen tot oplosbaar doelwiteiwit en opgenomen grootschalige fermentatie. Grootschalige kweken van elk construct werden gekweekt in TB-medium aangevuld met Novagen de Overnight Express 1 Medium volgens protocol van de fabrikant. Na groei werden de cellen geoogst door centrifugatie en opgeslagen bij -80 ° C. Grootschalige eiwitexpressie van elke kweek werd bevestigd via SDS-PAGE-analyse (figuur 5) alvorens grootschalige zuivering.

De Protein Maker werd gebruikt om parallelle zuivering van de veertien PB2 constructen voeren. Het geklaarde lysaten van all veertien constructies werden uitgevoerd door middel van een nikkel-chelaat kolom. Na het bepalen welke fracties doeleiwit door SDS-PAGE bevatten, werden de overeenkomstige fracties samengevoegd voor elk monster en de concentratie van elk werd bepaald door een _A280 lezing. Verwijdering van de 6x His-tag Smt werd uitgevoerd door toevoeging van ULP1 gevolgd door dialyse gedurende de nacht en een tweede kolom nikkel. Bevestiging van de His-tag Smt verwijdering werd uitgevoerd door SDS-PAGE (figuur 6), en elk monster werd geconcentreerd met een 10 kDa Amicon Ultra centrifugebuis. Na concentratie met behulp van de Amicon Ultra centrifuge buizen, werd elk monster overreden een sizing kolom kristallografische zuiverheid te bereiken. Een tweede concentratie werd uitgevoerd om de eiwitconcentratie te verhogen tot een niveau dat nodig is voor kristallisatie. Alle veertien constructen werden met succes gezuiverd en kwamen in kristallisatie onderzoeken.

Kristallisatie werd geïnitieerd door het ontdooien van de eerder frOzen eiwit. Kristallisatie werd uitgevoerd in een geconditioneerde ruimte bij 16 ° C met aangepaste platen (Emerald Bio) te zitten druppeldampdiffusie diffusie (figuur 7). Eerste screening werd uitgevoerd met vier sparse-matrix schermen; JCSG +, Pact, Wizard Volledig en CryoFull (Emerald Bio), na een langdurige Newman strategie. 0.4 ul eiwitoplossing werd vervolgens gemengd met 0,4 gl crystallant (of reservoiroplossing) van de overeenkomstige reservoir met 96 putjes Compact Jr kristallisatie platen (Emerald Bio). Van de veertien gezuiverde monsters negen van hen gaf kristallen geschikt voor diffractie studies (figuur 8). Een in-house diffractie data set werd verzameld op vijf van de negen constructen gekristalliseerd bij Cu Ka-frequentieband met een Rigaku SuperBright FR-E + roterende-anode X-ray generator uitgerust met Osmic varimax HF-lens en een Saturn 944 + CCD-detector (figuur 9 ). Elke dataset is verwerkt met XDS / XSCALE ^{4 <} / Sup> en geschaald tot een definitieve oplossing. Pogingen om de structuren te lossen door moleculaire vervanging werden met Phaser ⁵ uitgevoerd vanaf de CCP4 suite ^7. De laatste modellen werden verkregen na verfijning in REFMAC ⁷ en handmatige herbouw met Meerkoet ^11. De structuren werden beoordeeld en gecorrigeerd voor geometrie en fitness met MolProbity ^9. Een totaal van vier structuren van het PB2 subunit werden bepaald (figuur 10) en gestort in het VOB. Figuur 11 illustreert het algemene resultaat in elk stadium van de MTPP pijplijn.

Figuur 1. Overzicht van de SSGCID target-tot-structuur route voor Multi-target parallelle verwerking bij Emerald Bio.

Inhoud "fo: keep-together.within-page =" altijd ">
Figuur 2. Uitlijning Viewer en Protein Construct Ontwerp Module in Gene Composer software. Aminozuur basis constructie van doel worden in groen (middelste venster) en de structuur geleide inkortingen van alternatieve constructen zijn weergegeven in goud (onderste venster). Een uitlijning van meerdere sequenties Flu virale PB2 wordt vergeleken met de sequentie en secundaire structuurelementen het C-terminale domein van PDBID 3CW4. Kennis van het domein structuur en de secundaire structuur elementen maakt N-terminale inkortingen te kiezen binnen de Gene Composer Ontwerp Module door met de rechtermuisknop te klikken op de gewenste aminozuur residu. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 3a. PIPE klonen wordt geïllustreerd waarbij het ​​synthetisch gen insert (oranje) wordt versterkt door voorwaarts gemaakt (rood-oranje lijnen) en achteruit (oranje-blauwe lijnen) primers voor het genereren voegen PCR materiaal. De expressie vector wordt versterkt met omgekeerde (rood-zwarte lijnen ) en forward (blauw-zwarte lijnen) primers voor PCR vector materiaal te genereren. De terminale sequenties iPCR producten zijn complementair aan de terminale sequenties van vPCR producten (rood van iPCR aanvulling rood van vPCR en blauw van iPCR aanvulling blauw van vPCR). Dit maakt het iPCR en vPCR producten te gloeien om plasmiden die worden gerepliceerd na transformatie in gastheercellen BL21 (DE3) chemisch competente E. vormen coli cellen.

Figuur 3b. Agarose gel analyse van iPCR productie ts van de PB2 subeenheid. iPCR storingen kan worden beschouwd als zwakke of smeary banden, terwijl succesvolle iPCR producten worden weergegeven door robuuste bands. iPCR productkwaliteit kan in het algemeen gecorreleerd met succes klonen. Molecuulgewichtsmerkers zijn kiloDalton. Figuur is overgenomen uit Raymond et al.., 2011 ^12.

Figuur 4. Gentechniek stappen doelwit eiwitten PB2 werden uitgevoerd met Gene Composer. Nadat de kunstmatige nucleïnezuur-sequentie werd vastgesteld voor elk doel, werden 6-7 alternatieve eiwit constructen voor elke. Multi-target parallelle verwerking in de eerste stappen van gen ontwerpen en klonering resulteerde in 34 constructen, waarvan 14 levensvatbaar waren doelen die oplosbare eiwitten in E. geproduceerd coli.

re 5 "src =" / files/ftp_upload/4225/4225fig5.jpg "/>
Figuur 5. Representatieve SDS-PAGE analyse van grootschalige fermentatie geeft sterke eiwitexpressie (verwachte grootte van 25,76 kDa), ongeveer 50% oplosbaar (baan 4) en ongeveer 50% splitsing van 6x His-tag van Smt geëlueerde eiwit (laan 7).

Figuur 6. SDS-PAGE resultaten voor drie constructen van de polymerase PB2 subeenheid Lane 1, molecuulgewicht merkers (aangeduid links in kDa). Lanen 2, 6 en 10, samengevoegd eiwit uit nikkel kolom 1, lanen 3, 7 en 11, doorstroom van gesplitste eiwit in buffer A van Nickel 2, lanen 4, 8 en 12, het verwijderen van 6x His-tag Smt in buffer B van Nickel 2.

d/4225/4225fig7.jpg "/>
Figuur 7. Een schema van dampdiffusie door de zittende neerzetten. De zittende neerzetten voor eiwitkristallisatie valt onder de categorie van de dampdiffusie. Deze methode is een gezuiverd monster van eiwit en neerslagmiddelen equilibreren met een groter reservoir dat vergelijkbare omstandigheden een hogere concentratie. Zoals water verdampt uit het eiwit monster en transfers naar het reservoir, de precipitant concentratie toeneemt tot een optimaal niveau voor eiwitkristallisatie.

Figuur 8. Eiwitkristal polymerase PB2 subeenheid van een stam van het influenzavirus.

Figuur 9. Röntgendiffractie beeld van de polymerase PB2 subeenheid van eenstam van het influenzavirus.

Figuur 10. Lint's van de moleculen in de asymmetrische eenheid van kristallografische 4 PB2 structuren. Secundaire structuren gekleurd in regenboog patroon met overeenkomstige VOB codes. (A) 3K2V (A/Yokohama/2017/2003/H3N2) (b) 3KHW (A / Mexico / InDRE4487/2009/H1N1) (c) 3KC6 (A/Vietnam/1203/2004/H5N1) (d) 3L56 (A/Vietnam/1203/2004/H5N1).

Figuur 11. Uitkomstanalyse voor influenza PB2 doelstellingen die door de beschreven methoden. De structure bepaling pijplijn wordt geïllustreerd in vijf stappen: Klonen, oplosbaarheid, zuivering, kristallisatie en structuurbepaling.

Discussion

Multi-Target Parallel Processing

Structure-based drug design speelt een belangrijke rol in drug discovery. De SSGCID is gewijd aan het verstrekken van de wetenschappelijke gemeenschap met de drie-dimensionale eiwitstructuren van NIAID categorie AC ziekteverwekkers. Maken van dergelijke structurele informatie op grote schaal beschikbaar zal uiteindelijk dienen om structuur-based drug design versnellen.

De eerste kritieke stap van de MTPP aanpak is construct ontwerp. Meerdere constructies van elk doelwit eiwit verhoogt de kans op een succesvolle structuurbepaling en verhoogt de ommekeer. Het is onvermijdelijk dat sommige eiwitconstructen zal falen tijdens stadia van de pijpleiding. Uitvoering van de PIPE kloonmethode ondersteunt MTPP methode doordat het genereren van vele constructies in 96-well formaat zonder arbeidsintensief zuiveringsstappen. Koppelen PIPE klonen met de mogelijkheid om proteïne-expressie te analyseren in dezelfde 96 putjes (Caliper LabChip 90) versnelt verder de totale stroom. De koppeling van deze werkwijzen maakt een snelle identificatie van constructen die oplosbaar eiwit dat het succes van grootschalige productie en zuivering eiwit zorgt produceren.

Essentieel voor het succes van de MTPP high-throughput is de Protein Maker (Amerikaans octrooischrift 6.818.060, Emerald Bio) instrument. De Protein Maker is een 24-kanaals parallel vloeistof-chromatografie-systeem speciaal ontwikkeld om de efficiëntie van high-throughput eiwit productie en aanverwante structurele genoom pijplijn onderzoek toepassingen te stimuleren. Met behulp van de eerder beschreven protocol voor de Protein Maker, de voordelen duidelijk ten opzichte van een lijn FPLC systeem. Een enkele persoon kan zuiveren tot 48 doelen in parallel binnen een periode van acht uur. In tegenstelling, kan een persoon met behulp van een enkele lijn FPLC systeem slechts maximaal vier doelen binnen dezelfde termijn te zuiveren. De hoge niveaus van zuiverheid voor elk doelbereikt met de Protein Maker is een kritische factor in de latere succes van groeiende eiwitkristallen voor structuuranalyse.

Beperkingen en problemen oplossen

Problemen driedimensionale structuren door x-ray kristallografie is een getrapte inspanning met vele uitdagingen, waarvan het onvermogen om grote hoeveelheden oplosbaar doelwiteiwit verkrijgen. Een strategie die kan worden toegepast om de oplosbaarheid probleem te overwinnen is het gebruik van een andere expressie gastheer zoals E. coli-cellen niet in staat een aantal belangrijke eukaryote post-translationele modificaties uitvoeren. Expressie in diverse gist, insect en zoogdier cellijnen die in staat zijn het uitvoeren van deze post-translationele modificaties zijn vaak een geschikt alternatief. Doeleiwitten worden soms uitgedrukt maar volledig onoplosbaar in de standaard lysis voorwaarden. De Protein Maker kan een waardevolle bron voor het snelle testen van alternatieve cellysis omstandighedenzoals beschreven in Smith et al.. 2011 ^13. Deze strategie is vaak noodzakelijk om doelstellingen bewegen door de leiding. In geen structurele genomics pijpleidingen, dan kunnen gestandaardiseerde protocollen niet geschikt voor iedere doelgroep die door de pijpleiding en de doelstellingen kunnen individuele optimalisatie nodig komt. Zo is gekozen voor 20% ethyleenglycol gebruikt voor elke cryobeschermingsmiddel. In de gevallen dat deze voorwaarde niet geschikt is, kunnen alternatieve cryoprotectants of concentraties moeten worden getest.

Vanwege het unieke karakter van elk eiwit doel, de snelheidsbeperkende stap in en onvoorspelbare bepalen van een structuur kristallisatie. De MTPP pijplijn compenseert de algemeen lage slagingspercentage van eiwitkristallisatie met optimalisering van de eerste spaarzame matrix schermen. Elke eerste kristallen raakte uit commercieel beschikbare sparse matrix schermen wordt verder geoptimaliseerd met een E-Screen Builder (Emerald Bio). De optimalisatie-scherm is ontworpen areluid de toestand van het oorspronkelijke kristal hit, het veranderen van de concentraties van de buffers, zouten en additieven. Succesvolle optimalisatie schermen opleveren kristallen geschikt voor diffractie studies en structuurbepaling.

De structurele genomics-programma naar voren gebracht door het Nationaal Instituut voor Allergie en Infectieziekten (NIAID) financiert Emerald Bio en drie andere Pacific Northwest instellingen die samen de SSGCID (Emerald Bio, SeattleBiomed, de Universiteit van Washington en de Pacific Northwest National Laboratory) . Elk lid van het consortium is gekozen om hun expertise in het toepassen van state-of-the-art technologieën die nodig zijn voor het bereiken van de doelstellingen van het NIAID structurele genomics-programma. Tot op heden heeft SSGCID 461 structuren gestort in het VOB ranking als de zevende grootste bijdrage in de wereld, en in 2011, de meest productieve. De protocollen en methodologieën van de SSGCID zijn voorzien van de bedoeling van het voordeel van dewetenschappelijke gemeenschap en het bestendigen van het onderzoek van infectieziekten.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Primers	IDT
Genes	DNA 2.0
TE buffer	Qiagen	provided in kit
96-well half skirt PCR plates	VWR	10011-248
PFU Master Mix
6X Orange Loading Dye	Fermentas	R0631
10X TAE	Teknova	T0280
Agarose	Sigma-Aldrich	A9414-10G
pET28 vector
2-YT Broth	VWR	101446-848
Kanamycin	Teknova	K2151
Restriction Enzymes	Fermentas
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
Top 10 chemically comp cells	Invitrogen	C4040-06
Disposable Troughs (Sterile, 25 ml)	VWR	89094-662
Airpore covers (Rayon films for bio cultures)	VWR	60941-086
24-well blocks	VWR	13503-188
QIAvac 96	Qiagen	19504
BL21(DE3) cells chemcomp (phageR)	NEB	C2527H
50% Glycerol	VWR	100217-622
TB Media	Teknova	T7060
IPTG	Sigma-Aldrich
1 M Tris pH 8.0	Mediatech	46-031-CM
5 M NaCl	Teknova	S0251
Glycerol	Aldrich	G7893-4L
CHAPS	JT Baker	4145-01
Imidazole	Sigma	56749-1KG
TCEP	Amresco	K831-10G
L-arginine	Amresco	0877-500G
Benzonase	EMD	70746-3
Lysozyme	USB	1864525GM
10 kDa MWCO dialysis tubing	Thermo	68100
Amicon Ultra 10 ka MWCO concentrators	Millipore	UFC901024
HisTrap FF columns	GE	17-5255-01
HiTrap Chelating columns	GE	17/0408-01
Compact Jr crystallization plates	Emerald Bio	EBS-XJR
Crystalization screens	Emerald Bio
Ethylene Glycol 100%	Emerald Bio	EBS-250-EGLY
Crystal Wand Magnetic Straight	Hampton Research	HR4-729
Mounted CryoLoop 0.1-0.2 mm	Hampton Research	HR4-955
ALS style puck
Puck Wand
Bent Tongs
Puck Pusher