Summary
Struktur-baserade läkemedlet design spelar en viktig roll i läkemedelsutveckling. Sysslar flera mål samtidigt kraftigt ökar chansen för framgång för bly upptäckt. Följande artikel belyser hur Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease använder en multi-mål-strategi för gen-till-struktur bestämning av PB2 influensa A-subenheten.
Abstract
Pandemic utbrott av högvirulenta influensastammar kan orsaka omfattande sjuklighet och dödlighet i mänskliga befolkningar över hela världen. I USA ensam, är ett genomsnitt av 41.400 dödsfall och 1,86 miljon inläggning på sjukhus orsakas av influensavirus infektion varje år 1. Punktmutationer i polymeras grundläggande protein 2 subenhet (PB2) har varit kopplade till anpassning av virusinfektion hos människa 2. Resultaten från dessa studier har avslöjat den biologiska betydelsen av PB2 som virulensfaktor, vilket understryker dess potential som ett antiviralt läkemedel mål.
Structural Genomics program som tas fram av det nationella institutet för allergi och infektionssjukdomar (NIAID) finansierar Emerald Bio och tre andra Pacific Northwest institutioner som tillsammans utgör Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease (SSGCID). Den SSGCID är dedikerade till att erbjuda den vetenskapliga samfundet med three-dimensionella proteinstrukturer av NIAID kategori AC patogener. Att göra sådan strukturell information tillgänglig för den vetenskapliga samfundet tjänar till att påskynda struktur-baserade läkemedlet design.
Struktur-baserade läkemedlet design spelar en viktig roll i läkemedelsutveckling. Sysslar flera mål samtidigt kraftigt ökar chansen för framgång för nya bly upptäckt genom att rikta en väg eller en hel protein familjen. Emerald Bio har utvecklat en hög genomströmning, multi-mål parallell bearbetning rörledning (MTPP) för gen-till-struktur beslutsamhet att stödja konsortiet. Här beskriver vi de protokoll som används för att bestämma strukturen av PB2 subenheten från fyra olika influensa A-stammar.
Protocol
En översikt av protokollet återges i fig 1.
Molecular Biology
Ett. Construct Design
Använd programvaran Gene Composer för att utforma protein konstruktion och kodon engineered syntetiska gensekvenser. Användningen av Gene Composer har erbjudits närmare håll 3.
- Använd modulen Alignment Viewer och Konstruera Design Module att jämföra inriktningar proteinsekvensdatabaser och definiera protein konstruktion. Align målaminosyrasekvensen till både den primära och 3D-strukturella element från homologer i Protein Data Bank (PDB), om sådan finns (Figur 2).
- Använd anpassningen information för att göra struktur-styrda konstruera mönster genom att välja nya terminaler baserade på bevarandet av den primära strukturen och 3D-strukturer homologer.
- Design insats PCR (IPCR) och vektor PCR (VPCR) amplimerer (plint primers).
- Använda Gene Composer s protein-till-DNA-algoritm, back-översätta konstruktet aminosyrasekvensen i kodon konstruerad nukleinsyrasekvens.
- Använd rätt bord kodonanvändningen (CUT) för att optimera sekvensen för uttryck i E. coli.
- Praktiskt taget klona insatsen i pET28 vektor modifierade för att innehålla en N-terminal 6x Histidin tagg och Smt3/SUMO fusionsprotein som möjliggör enkel rening.
- Placera syntetisk gen ordning med DNA 2.0 och primers beställa från Integrated DNA Technologies.
2. Polymeras Ofullständig Primer Extension (PIPE) Kloning
- Förbered Primers och gener
- Centrifugera från leverantören plattor innehållande primers vid 1000 rpm i 1 minut.
- Ta primerkoncentration till 100 | iM och tillsätt 50 | il TE-buffert.
- Späd primers till 10 pM med avjoniserat (DI) vatten i en 96-brunnars v-bottnad platta.
- Centrifugera från leverantören genen i ett 1,5 ml rör vid 1.300 rpm i 1 minut.
- I 1,5 ml rör, göra spädningar av varje primer till 10 ng / ul.
- Store primers och gener vid -20 ° C när den inte används.
- Förbered Infoga PCR (IPCR)
- Tina en injektionsflaska med Pfu Master Mix på is, hålla gener och grundfärger vid rumstemperatur.
- Skapa en tallrik karta tilldela brunnar till en uppsättning primrar och konstruera.
- Lägg 13 pl av DI-vatten i varje brunn i en 96-brunnars PCR-platta.
- Tillsätt 5 | il av framåt-och 5 pl av omvänd primer till varje reaktion i 96-brunnar enligt tallriksmodellen kartan, vilket garanterar att byta spetsar mellan varje brunn.
- Tillsätt 2 | il av varje fullängdsgen till dess lämpliga väl enligt tallriksmodellen kartan.
- Tillsätt 25 | il Pfu Master Mix till varje brunn, vilket garanterar att byta spetsar mellan varje brunn.
- Cykla reaktioner med hjälp av följande PCR-villkor:
- 95 ° C 2 minuter 95 ° C 30 sek
- 50 ° C 45 sek
- 68 ° C 3 min
- 4 ° C ∞
- Upprepa steg bd i 25 cykler.
- Överför 10 ìl av varje IPCR reaktion på en ny 96-brunnars PCR-platta.
- Tillsätt 3 | il 6X belastning färgämne till varje prov.
- Separera varje prov på en 1% TAE EtBr agarosgel vid 110 V bredvid en 100-500 bps DNA stege för att bekräfta fragment förstärkning.
- Affär IPCR produkten vid -20 ° C när de inte används (undvik frysning tina så mycket som möjligt).
Tre. Förbered Vector PCR (VPCR)
- Starta övernattskultur av transformerad E. coli med pET28 vektorplasmid.
- Inokulera två 5 ml rör av 2-YT buljong med 50 | ig / ml kanamycin.
- Väx kulturer över natten vid 37 ° C i skakapparat vid 220 rpm.
- Centrifugera ner kulturerna efter odling över natten genom centrifugering vid 3000 rpm under 15 min.
- Använd en Qiagen QIAprep Spin Miniprep Kit för att utvinna pET28 vektor från bakteriella pellets enligt tillverkarens anvisningar.
- Setup restriktionsenzym spjälkningar av extraherades pET28 plasmid.
- Lägg 2,2 ^ il 10 x BamHI-buffert och 1 | il av BamHI och Hindlll för att 20 | il av pET28 vektor.
- Inkubera reaktionsblandningen under 1 h vid 37 ° C.
- Separat uppslutningsprodukt på en gel.
- Se steg 2.2.10.
- Klipp vektor band från gel och rena det med QIAquick Kit Gel Extraction enligt tillverkarens anvisningar.
- Med hjälp av en NanoDrop, kvantifiera DNA-koncentrationen.
- Späd skära vektorn till 10 ng / ul. Förvara vid -20 ° C när de inte används.
- Förbered VPCR primrar.
- Centrifugera IDT tillhandahålls oligonucliotides under 1 min vid 1300 rpm.
- Ta med koncentration till 100 | iM med DI-vatten.
- Bered 10 iM utspädning av både framåtriktade och bakåtriktade primrar i ett 1,5 ml rör.
- Store primrar och spädningar primer vid -20 ° C.
- Tina Pfu Master Mix på is och tina templat och primrar vid rumstemperatur.
- Setup VPCR reaktioner i en 96-brunnars PCR-platta:
- I den första raden i en 96-brunnars platta kombinera 60 pl av både framåtriktade och bakåtriktade VPCR primrar och 24 pl av digererad pET28 mall (10 ng / pl).
- Med hjälp av en 12-tip multikanalpipett, överföra 12 | il av primern och mall Master Mix till varje återstående brunn i plattan. Detta bör leda till 12 pl av primer och mall Master Mix i varje brunn i plattan.
- Lägg 13 pl av DI-vatten till varje brunn.
- Tillsätt 25 | il Pfu Master Mix till varje brunn.
- Cycle reaktionerna genom PCR-förhållanden användes i steg 2.2.7.
- Pool alla VPCR reaktioner i en 15 ml Falcon rör.
- Verifiera fragment förstärkning genom att separera 10 il poolad PCR-produkten på en gel (förväntad längd av rötat pET28 vektorär ca 6 kb).
- Se steg 2.2.10.
- Förbered samman plattorna.
- Alikvot 3 pl VPCR produkt i varje brunn i en 96-brunnars v-bottnad platta.
- Förvara plattorna vid -20 ° C tills merge med IPCR produkt.
4. Merge IPCR och VPCR Produkter
- Tina IPCR produkter och pre-alikvoteras VPCR 96-brunnars sammanfoga plattan vid rumstemperatur.
- Tillsätt 3 l av varje IPCR produkt till respektive brunn sammanfogningen plattan.
- Förvandla samman plattan i Top Ten kemiskt kompetenta celler.
- Tillsätt 2 l av varje Merge reaktion i ett enda 50 pl tub från leverantören kemiskt kompetenta celler och fortsätt med tillverkarens medföljande protokoll.
- Förbered övernattskulturer för varje konstruktion från transformation plattan.
- Alikvot 5 ml TB-buljong (med 50 | ig / ml kanamycin) från en 25 ml steril reservoar i varje brunn i en djup brunn blocket.
- Använda sterile teknik, plocka en isolerad koloni från varje omvandling platta och ympa rätt väl av den djupa brunnen blocket.
- Täck blocket med en Airpore lock.
- Skaka block vid 220 rpm vid 37 ° C över natten.
- Pelletera celler genom centrifugering av blocket under 30 min vid 4000 rpm.
- Häll av supernatanten och klappa den övre delen av blocket torr med en pappershandduk.
- Mini-prep med användning av en Qiagen 96-brunnars vakuumapparat enligt tillverkarens anvisningar.
Fem. Förbereda glycerolstamlösningar framgångsrikt Klonade Konstruktioner
- Omvandla framgångsrikt klonade sekvensen validerade DNA i BL21 (DE3) kemiskt kompetenta celler enligt tillverkarens instruktioner.
- För varje konstruktion, plocka en enda isolerad koloni från BL21 (DE3) omvandling och inokulera i 1 ml 2-YT-buljong (med 50 ug / ml kanamycin).
- Skaka kulturer vid 220 varv per minut under 3-4 h vid 37 ° C.
- Märk ett 1,5 mlprovrör med skruvlock med den unika konstruktionen identifieringsnummer, cellstam, och datum. Lägg 500 pl av 50% glycerol och 500 pl av cellodling och vänd flera gånger. Omedelbart lagra glycerol lager på torr is eller i en -80 ° C frys.
6. Expression Testing
| Lysis Buffe r | Tvättbuffert | Elueringsbuffert |
| 50 mM NaH 2 PO 4, pH 8,0 300 mM NaCl 10 mM imidazol 1% Tween 20 2 mM MgCl2 0,1 pl / ml Benzonase 1 mg / ml Lysozym | 50 mM NaH 2 PO 4, pH 8,0 300 mM NaCl 20 mM imidazol 0,05% Tween 20 | 25 mM Tris, pH 8,0 300 mM NaCl 250 mM imidazol 0,05% Tween 20 |
* Lägg Benzonase, lysozym,och proteas-inhibitor omedelbart före lys.
- Streak ett prov från glycerol mald på kanamycin selektiv agar och inkubera över natten vid 37 ° C.
- Starta en icke-inducerande pre-kultur i en 96-brunnars rundbottnad block; inokulera 1,2 ml TB-buljong (med 50 mg / ml kanamycin) kompletterat med 0,5% glukos med en nyligen odlas E. coli isolat. Grow över natten under skakning vid 220 rpm vid 37 ° C.
- Efter odling över natten, börja induktion kulturer genom inokulering av 1,2 ml av TB-buljong (med 50 mg / ml kanamycin) kompletterat med Novagen Overnight Express System 1 (enligt tillverkarens protokoll) med 40 | il av pre-kulturen.
- Odla småskaliga induktion kulturer vid 20 ° C under 48 h, skakning vid 220 rpm.
- Harvest celler genom centrifugering vid 4000 rpm under 15 minuter, häll bort supernatanten och förvara vid -20 ° C i minst 1 h före bearbetning.
- I 96-brunnars blocket, resuspendera cellpelletar i 300 | il lysbuffert. Inkubera cellerna i lysbuffert vid rumstemperatur under 30 min följt av mekanisk lys genom kraftig skakning under 30 min vid rumstemperatur.
- Klargörande av råa lysatet genom centrifugering under 30 min vid 4000 rpm vid 4 ° C.
- Använd en flerkanals pipett för att överföra 200 fil av det klargjorda lysatet (löslig fraktion) till en 96-brunnars flatbottnad bricka (Qiagen). För varje brunn innehållande ett prov, tillsätt 40 | il Ni-NTA-magnetiska pärlor (Qiagen).
- Skaka försiktigt plattan på en vippa under 1 h vid 16 ° C.
- Placera plattan på en magnetisk post platta (Qiagen) och avlägsna den obundna fraktionen. Var noga med att inte pipettera ut någon av Ni-NTA-pärlor.
- Avlägsna plattan från posten plattan och försiktigt suspenderades pärlorna i 200 mikroliter tvättbuffert. Pipettera upp och ner i 30 sekunder och sedan placera plattan tillbaka på posten plattan.
- Avlägsna tvättbufferten och upprepa steg 6.12.
- Avlägsna plattan från posten plattan och eluera Ni-NTA bundet TArget protein genom tvättning med 50 pl elueringsbuffert under 5 min.
- Återgå flatbottnad platta till magnetisk post plattan och överföra eluering för en frisk 96-brunnars v-bottnad platta.
- Överför 20 ul av eluering för en färsk 96-brunnars v-bottnad platta och reagerar med ett pl ULP1 proteas.
- Enligt tillverkarens protokoll, analysera eluerade och eluerade + Ulp1 fraktionen genom kapillär elektrofores med en LabChip 90.
- Alternativt kan alla fraktioner från uttrycket testning analyseras via SDS-PAGE.
7. Large Scale Jäsning
- Använd en steril pipettspets för erhållande av en skrapa från en glycerolstock, inokulera 100 ml TB-buljong (med 50 mg / ml kanamycin) och växa över natt. Skaka vid 220 rpm och 37 ° C.
- Efter odling över natten, expandera förkultur genom inokulering en L av TB-buljong med EMD autoinduktion lösningar (se tillverkarens protokoll) (med 50 mg / ml kanamycin) i en 2 L bafflad kolv med 10 ml av denpre-kultur (1:100 utspädning).
- Skaka de expanderade 1 L kulturer vid 37 ° C, ändra temperaturen hos skakinkubator till 20 ° C då en optisk densitet på 0,6 (OD 600) har uppnåtts.
- Efter odling över natten, ta ett representativt 10 ml alikvot från varje konstruktion för uttryck testning.
- Harvest cellpasta genom centrifugering vid 5000 rpm under 15 min och kassera supernatanten.
- Freeze cellpasta vid -80 ° C.
Proteinrening
Buffertar:
| Lysis Buffer | Buffert A (Jämvikt) | Buffert B (Eluering) | Dimensionering kolonnbuffert |
| 25 mM Tris, pH 8,0 200 mM NaCl 0,5% glycerol 0,02% CHAPS 10 mM imidazol 1 mM TCEP 50 mM Arginin 5 pl Benzonase 100 mg Lysozym 3 Proteasinhibitor Tabletter (EDTA-fri) | 25 mM Tris, pH 8,0 200 mM NaCl 10 mM imidazol 1 mM TCEP 50 mM Arginin 0,25% glycerol | 25 mM Tris, pH 8,0 200 mM NaCl 200 mM imidazol 1 mM TCEP | 25 mM Tris, pH 8,0 200 mM NaCl 1% glycerol 1 mM TCEP |
* Lägg Benzonase, lysozym, och proteashämmare tabletter hämmare till vardera 150 ml prov omedelbart före lys.
8. Cell Lysis
- Gör 2 L lysbuffert, inte lägga lysozym, proteas tabletter inhibitor eller Benzonase (varje prov skall lyseras separat i 150 ml lysbuffert).
- Tina och återsuspendera cellpasta i lysbuffert vid en 01:05 vikt: volymförhållande genom kraftig omröring i 30 min vid 4 ° C. Bryt bitar loss från sidorna av bägare med en ren spatel. Under denna tidsperiod förbereda Ni och Dialysis Buffertar
- På is, lysera cellerna med hjälp av en Misonix sonikator (70% effekt, 2 sek på / 1 sekund av pulser under 3 min) och snurra försiktigt behållare för att förhindra överhettning. Spara en liten (200 ^ il) alikvot av rålysat för framtida analys.
- Klargörande av rått lysat genom centrifugering vid 18.000 xg under 35 minuter vid 4 ° C, samla in supernatanten och spara en liten (200 ^ il) alikvot för framtida analys. Store pellet vid 4 ° C tills det är bekräftat proteinet har lyserats in i den lösliga fraktionen.
9. Pre-run Protein Maker Setup
- Med proteinet Maker påslagen och programvaran öppnas, initiera instrumentet.
- När initierats, bifoga en 5,0 ml GE Healthcare HisTrap FF Nickel-kelat-kolonn (Ni kolumn) på en separat rad i portalen för varje prov.
- Kör 3-4 kolonnvolymer (CV) jämviktsbuffert genom varje kolonn.
- Prime ekvilibreringen och elueringstider linjer buffert.
- Equilibråt kolumnerna genom att aspirera buffert A genom kolonnen gång.
10. Nickel 1 (Ni1) Kolumn
- Tvätta varje kolonn med 20 ml Milli-Q-vatten för att avlägsna lagring buffert. Springa 5 ml buffert B och 25 ml buffert A till jämvikt.
- Ladda det klarnade lysat innehållande solubiliserade proteinet i kolonnerna med en hastighet av 2 ml / min följer sedan genom en 15 ml tvätt med buffert A.
- Eluera det bundna proteinet i en steggradient med buffertar A och B genom följande förhållanden respektfullt: 5 ml 95:5, 5 ml 60:40, 10 ml 0:100. Samla varje elueringsfraktion separat.
- Analysera: eluerade fraktionerna, rålysat, klarnat lysat och genomflöde genom SDS-PAGE. Pool fraktioner innehållande proteinet och använda en Nanodrop att mäta A 280 för att grovt bestämma mängden protein som är närvarande.
11. ULP1 Klyvning
- Håll en liten portion (250 ul) av Ni1 kolumnen poolen för efterföljande gelanalys. Ta restenav Ni1 poolen till 10 ml och tillsätt ubiquitin-liknande proteas 1 (ULP1) vid 1 | il / 5 mg totalt protein för att avlägsna His-Smt affinitetsmärkning.
- Dialysera Ni1 pool + ULP1 mot 2 L buffert A under 4 h vid 4 ° C i en 10 kDa molekylvikt cutoff (MWCO) på en uppståndelse plattan vid 4 ° C.
- Efter dialys köra SDS-PAGE av Ni1 pool och Ni1 pool + ULP1 att bestämma om ULP1 klyvning lyckades.
12. Nickel 2 (Ni2) Kolumn
- Ladda kluvna proteinet över samma Ni-kolonn och upprepa steg 9,3 till en reducerad flödeshastighet av 1 ml / min. Den klyvda av tagg kommer att binda till kolonnen och tagless målproteinet strömmar nu-through. Samla genomflödet i en fräsch behållare.
- Tvätta Ni kolonnen med 3 ml buffert A följt av 5 ml av buffert B för att eluera alla His-märkt och icke-specifikt bundet protein. Samla varje fraktion separat.
- Kör SDS-PAGE av Ni2 genomströmning, tvätta och Ni2 fraktioner elueringsbetingelser att kontrollera ULP1 klyvning och att protein är närvarande i genomflödet. Använd en Nanodrop att mäta A 280 för att grovt bestämma närvaron av protein.
13. Koncentrera
- Koncentrera Ni2 genomströmning (och Ni2 eluering om proteinet är närvarande) till 5 ml med en Amicon Ultra 10 kDa MWCO centrifugrör. Spin i 10 minuters intervall vid 4000 rpm vid 4 ° C. Blanda med en pipett mellan varje dragning för att undvika protein från över-koncentrera längs membranet.
14. Storleksuteslutningskromatografi (SEC)
- Sätt upp en Sephacryl S-100 10/30 GL kolonn (GE Healthcare) genom ekvilibrering med 200 ml SEC-buffert vid en flödeshastighet av 0,5 ml / min på en AKTApurifier systemet (GE Healthcare).
- Bered 10 ml superloops för användning på SEC-kolonn enligt tillverkarens instruktioner.
- Med hjälp av en 5 ml spruta, ladda prover på superloops och börja SEC körningen.
- Övervaka UV-absorbans spår vid 280 nm samtidigt samla liten volym fråtgärder.
- Kör SEC fraktionerna via SDS-PAGE.
- Pool Den SEC fraktionerna visar den högsta intensiteten banden.
- Koncentrera poolade SEC fraktioner. Se steg 13,1.
- Alikvot protein i 100 ul prover, flash frysa i flytande kväve och förvaras vid -80 ° C.
KRISTALLISERING
15. Protein Kristallisation
- Pre-fylla varje reservoar av en 96-brunnars Kompakt Jr kristallisering platta (Emerald Bio) med 80 pl av kristallisering skärm (Emerald Bio) av valet.
- Späd protein med dimensionering buffert till 2-20 mg / ml och förvara på is.
- Fördela 0,4 pl av protein och 0,4 pl av kristallisering skärmen i vart och ett av de 96-brunnar och täck med kristallklart fogband (Manco).
- Förvara plattan vid 16 ° C när du söker efter proteinkristallisering regelbundet under de närmaste veckorna under ett dissekera mikroskop.
16. Crystal Skörd </ P>
- Skapa ett kryoskyddande medel från moderluten och etylenglykol. Skär den klara tejpen som täcker väl med målproteinet kristall. Till en tom väl, tillsätt 1,6 | il av den motsvarande kristalliserande tillstånd och kombinera med 0,4 | il etylenglykol vilket ger en slutlig koncentration av 20% etylenglykol och 80% kristalliserande skick. Observera: att optimera kristall diffraktion prova olika kryoskyddsmedel såsom: glycerol, oljor, låg MW polyetylenglykoler, och / eller vid olika procentsatser av frysskyddsmedel.
- Innan skörd svalna en ALS-stil pucken i en dewar fylld med flytande kväve och täck med lock.
- Harvest kristallen genom att placera en CryoLoop med innerdiametern likvärdig storleksfördelning av kristallen på en magnetisk Crystal Wand (Hampton Research) och skopa den direkt från väl lösningen.
- Omedelbart doppa CryoLoop med den skördade kristallen i kryoskyddsmedlet sedan dränka i ALS-stil puck att blinka frysa crystal. Upprepa för ett önskat antal kristaller.
17. Crystal Screening / datainsamling
- När skörden är klar att använda en puck trollstav att placera magnetiska Cryo pucken locket på ALS pucken. Med böjda tänger, vända pucken upp och ner.
- Överför pucken till en Rigaku ACTOR Dewar, skruva en Puck Pusher på pucken, och slå av locket lämnar den i Dewar med stiften uppåt.
- Använda JDirector programvara, skärm varje kristall under följande parametrar: balk slits inställd på 0,5 grader, detektor avstånd satt till 50 mm, bild steg till 70 grader, och exponering längd inställd på 30 sek.
- Kör MOSFLM på testbilder du tagit med JDirector att avgöra vad det bästa kristall och strategi är för datainsamling.
- Samla ett komplett dataset baserat på dina resultat från MOSFLM.
18. Data Processing / Structure Determination
- Kör XDS / XSCALE 4 för att bearbeta datamängden.
- Öppna CCP4 Suite.
- Kör Phaser 5 för att beräkna en molekylär ersättare lösningen med en hög modell homologisökning, när det finns. I det här fallet använde vi PDBID 3CW4 som sökmodellen 6.
- Kör REFMAC 7 för att förfina din molekylära modell mot den observerade reflektion samlats i datamängden. Slutlig upplösning bör baseras bort av högsta skalet och bestäms av följande parametrar: R faktor> 50%, I / sigma> 2, och fullständighet> 90%.
- Bygg en 3-dimensionell modell elektrontätheten med molekylära grafikprogram COOT 8.
- Innan de deponerar strukturen i det preliminära budgetförslaget validera den med MolProbity 9 programvara för att kontrollera att kvaliteten på konstruktionen är lämplig för deponering.
Representative Results
Följande resultat illustrerar de förväntade utfallet av den beskrivna protokollet, och i fallet med PB2, de observerade resultaten.
Använda Gene Composer, fem fullängds mål aminosyrasekvenserna av influensavirus polymeras subenhet PB2 utformades (Figur 2). De PB2 sekvenserna tillbaka översattes och utsattes för många tekniska steg 3, vilket resulterar i kodon harmoniserade sekvenser optimerade för uttryck i E. coli. Från de IPCR produkter (figur 3b), totalt trettiofyra konstruktionerna framgångsrikt klonades in i en modifierad pET28 vektorsystem 10 med en N-terminal 6x His-Smt fusion tagg med PIPE kloning 3, såsom visas i figur 3a. En sammanfattning av kloning arbetsflödet presenteras i Figur 4.
Efter lyckad kloning, var mikroskala proteinuttryck av varje konstruktion testades i BL21 (DE3) E.coli-celler. Celler odlades i TB-medium kompletterat med Novagen Overnight Express ett medium (i enlighet med tillverkarens protokoll) för 48 timmar vid 20 ° C i en skakande inkubator inställd på 220 rpm. Efter tillväxt skördades cellerna och testades med avseende på lösligt protein expression med användning av kapillär elektrofores med en Caliper LabChip 90. Fjorton av de trettiofyra PB2 konstruktioner ledde till lösligt målprotein och trädde storskalig fermentation. Storskaliga kulturer av varje konstruktion odlades i TB-medium kompletterat med Novagen s Overnight Express ett medium enligt tillverkarens protokoll. Efter tillväxt skördades cellerna genom centrifugering och förvarades vid -80 ° C. Storskalig proteinexpression av varje kultur bekräftas via SDS-PAGE-analys (Figur 5) innan man går vidare med storskalig rening.
Den Protein Maker användes för att genomföra parallella rening av de fjorton PB2 konstruktioner. Den klarnade lysat av all fjorton konstruktioner kördes genom en nickel-kelat-kolonn. Efter bestämning vilka fraktioner innehöll målproteinet genom SDS-PAGE, var de motsvarande fraktionerna sammanslogs för varje prov och koncentrationen av varje bestämdes genom en A 280 behandlingen. Avlägsnande av 6x His-Smt tagg utfördes genom tillsats av ULP1 följt av dialys över natten och en andra nickelkolonn. Bekräftelse av His-Smt tag bort utfördes genom SDS-PAGE (fig 6), och varje prov koncentrerades med en 10 kDa Amicon Ultra centrifugrör. Efter koncentrering med hjälp av Amicon Ultra centrifugrör blandades varje prov överkörd en dimensionering kolonn för att uppnå kristallografisk renhet. En andra koncentration utfördes för att öka proteinkoncentrationen till en nivå som krävs för kristallisation. Alla fjorton konstruktioner framgångsrikt renade och trädde i kristallisering prövningar.
Kristallisation initierades genom att tina den tidigare frOzen proteinet. Kristallisation utfördes i ett klimat kontrollerade rum vid 16 ° C med specialdesignade plattor (Emerald Bio) för sittande droppångdiffusion (Figur 7). Initial screening utfördes med fyra gles-matris skärmar, JCSG +, pakten, Wizard Full och CryoFull (Emerald Bio), efter en längre Newman strategi. 0,4 | il proteinlösning blandades sedan med 0,4 | il crystallant (eller reservoarlösning) från motsvarande reservoaren med hjälp 96-brunnars Compact Jr kristallisations plattor (Emerald Bio). Av de fjorton renade prover nio av dem gav kristaller lämpliga för diffraktionsstudier (Figur 8). En in-house diffraktion datamängd samlades på fem av de nio konstruktioner kristalliseras vid Cu Ka våglängd med en Rigaku SuperBright FR-E + roterande anod X-ray generator utrustad med Osmic Varimax HF optik och en Saturn 944 + CCD-detektor (figur 9 ). Varje datauppsättning bearbetades med XDS / XSCALE 4 < / Sup> och skalas till en slutlig lösning. Försök att lösa de strukturer genom molekylär ersättning utfördes med Phaser 5 från CCP4 suite 7. De slutliga modellerna erhölls efter förfining i REFMAC 7 och manuell ombyggnad med Sothöna 11. Strukturerna bedömdes och korrigerad för geometri och fitness med MolProbity 9. Totalt fyra strukturer PB2 subenheten bestämdes (Figur 10) och deponeras i det preliminära budgetförslaget. Figur 11 visar det samlade resultatet i varje steg i MTPP pipeline.
Figur 1. Översikt över SSGCID gen-till-struktur bana för Multi-mål parallell bearbetning på Emerald Bio.
Figur 2. Alignment Viewer och Protein Konstruera Design Module i Gene Composer. Aminosyra-bas konstruktion av målet visas i grönt (mitt fönster) och strukturen guidade stympningar av alternativa konstruktioner visas i guld (nedre fönstret). En anpassning av flera Flu virala PB2 sekvenser visas jämfört med sekvensen och sekundära element struktur av den C-terminala domän från PDBID 3CW4. Kunskap om domänstrukturen och sekundära element struktur möjliggör N-terminala stympningar som skall väljas inom Gene Composer Design Modul genom att högerklicka på den önskade aminosyraresten. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 3a. PIPE kloning illustreras vari den syntetiska genen insatsen (orange) är förstärkt med hjälp utformad framåt (röd-orange linjer) och omvänd (orange-blå linjer) primrar för att generera infoga PCR material. Expressionsvektorn förstärks med omvänd (röd-svarta linjer ) och framåt (blå-svarta linjer) primers för att generera vektor PCR material. Den terminala sekvenserna IPCR produkter kompletterar de terminala sekvenserna av VPCR produkter (röd av IPCR kompletterar rött av VPCR och blå IPCR kompletterar blå VPCR). Detta gör att IPCR och VPCR produkter att para bilda plasmider som replikeras efter transformation in i värden BL21 (DE3) kemiskt kompetenta E. coli-celler.
Figur 3b. Agarosgel analys av IPCR produktion ts från PB2 subenheten. IPCR misslyckanden kan ses som svaga eller smetig band, medan framgångsrika IPCR produkter representeras av robusta band. IPCR produktkvalitet kan i allmänhet korreleras med kloning framgång. Molekylviktsmarkörer är i kilodalton. Figur reproduceras från Raymond et al., 2011 12.
Figur 4. Genteknik stegen av mål PB2 proteiner utfördes med hjälp av programvara Gene Composer. Efter den manipulerade nukleinsyrasekvensen fastställdes för varje mål, var 6-7 alternativa proteinkällor konstruktioner utformade för varje. Multi-mål parallell bearbetning i de inledande stegen av gen design och kloning gav 34 konstruktioner, av vilka 14 var livskraftiga mål som producerade lösliga proteiner i E. coli.
re 5 "src =" / files/ftp_upload/4225/4225fig5.jpg "/>
Figur 5. Representativa SDS-PAGE-analys av storskalig fermentation visar robust proteinuttryck (förväntad storlek av 25,76 kDa), ungefär 50% lösligt (spår 4) och ca 50% spjälkning av 6x His-Smt taggen från eluerade proteinet (spår 7).
Figur 6. SDS-PAGE resultat för tre konstruktioner av polymeras PB2 subenheten Lane 1, molekylvikt markörer (märkt på vänster sida i kDa),. Spår 2, 6 och 10, poolade protein från Nickel 1 kolumn, raderna 3, 7, och 11, genomströmning av klyvda proteinet i buffert A från Nickel 2, fält 4, 8 och 12, borttagande av 6x His-Smt tagg i buffert B från Nickel 2.
d/4225/4225fig7.jpg "/>
Figur 7. En schematisk av diffusion från sammanträdet drop metoden. Sammanträdet släpp-metoden för proteinkristallisering faller under kategorin av ångdiffusion. Denna metod innebär ett renat prov av protein och fällningsmedel i jämvikt med en större behållare innehållande liknande förhållanden i en högre koncentration. Som vatten förångas från proteinet provet och överför till reservoaren, ökar fällningsmedel koncentration till en optimal nivå för proteinkristallisering.
Figur 8. Protein kristall av polymeras PB2 subenheten från en stam av influensavirus.
Figur 9. Röntgendiffraktion bild av polymeraset PB2 subenheten från enstam av influensavirus.
Figur 10. Ribbon diagram av molekylerna i den kristallografiska asymmetrisk enhet av fyra PB2 strukturer. Sekundära strukturer färgade i regnbågemönster med motsvarande PDB koder. (A) 3K2V (A/Yokohama/2017/2003/H3N2) (b) 3KHW (A / Mexico / InDRE4487/2009/H1N1) (c) 3KC6 (A/Vietnam/1203/2004/H5N1) (d) 3L56 (A/Vietnam/1203/2004/H5N1).
Figur 11. Utfall analys för influensa PB2 mål genom de beskrivna metoderna. The strukturellte beslutsamhet pipeline visas i fem steg: Kloning, löslighet, rening, kristallisering och strukturbestämning.
Discussion
Multi-Target Parallel Processing
Struktur-baserade läkemedlet design spelar en viktig roll i läkemedelsutveckling. Den SSGCID är dedikerade till att erbjuda den vetenskapliga samfundet med tredimensionell proteinstrukturer från NIAID klass AC patogener. Att göra sådan strukturell information allmänt tillgänglig i slutändan kommer att tjäna till att påskynda struktur-baserade läkemedlet design.
Den första kritiska steget i MTPP tillvägagångssätt är konstruktion design. Flera konstruktioner av varje målprotein ökar sannolikheten för framgångsrika struktur beslutsamhet och ökar vändning. Det är oundvikligt att vissa protein konstruktioner kommer att misslyckas under skeden av rörledningen. Genomförandet av metoden PIPE kloning stöder MTPP metoden genom att tillåta generering av många konstruktioner i 96-brunnars format utan arbetsintensiva reningssteg. Para PIPE kloning med förmåga att analysera proteinexpression i samma 96-brunnsformat (Caliper LabChip 90) påskyndar ytterligare det totala flödet. Ihopkopplingen av dessa metoder möjliggör en snabb identifiering av konstruktioner som producerar lösligt protein som säkerställer framgången för storskalig proteinproduktion och rening.
En viktig aspekt för framgång MTPP hög genomströmning är Protein Maker (US patent nr 6.818.060, Emerald Bio) instrument. Den Protein Maker är en 24-kanals parallell vätske-kromatografi system som utvecklats speciellt för att öka effektiviteten i hög genomströmning protein produktion och tillhörande strukturella genomiska rörlängder forskning. Med det tidigare beskrivna protokollet för Protein Maker, fördelarna är uppenbara i jämförelse med en enda rad FPLC-system. En enda person kan rena upp till 48 mål i parallella inom en åtta timmars period. Däremot kan en enskild person som använder ett enda system linje FPLC renar endast maximalt fyra mål inom samma tidsram. De höga nivåerna av renhet för varje måluppnås med Protein Maker är en kritisk faktor för senare framgång växande proteinkristaller för strukturanalys.
Begränsningar och felsökning
Lösa tredimensionella strukturer av röntgenkristallografi är en multi-iscensatt insatser med många utmaningar, varav en är en oförmåga att få stora mängder lösligt målprotein. En strategi som kan genomföras för att övervinna lösligheten problemet är användningen av en alternativ expressionsvärd som E. coli-celler inte kan utföra flera viktiga eukaryota post-translationella modifieringar. Uttryck i olika jäst-, insekts-och däggdjurs-cellinjer som är kapabla att utföra dessa posttranslationella modifikationer är ofta ett lämpligt alternativ. Målproteiner uttrycks ibland men helt olösligt i de vanliga lys villkor. Den Protein Maker kan vara en värdefull resurs för snabb testning av alternativa villkor cellyseringsåsom beskrivs i Smith et al. 2011 13. Denna strategi är ofta nödvändigt att hålla mål rör sig genom rörledningen. I varje strukturell genomik pipeline, kan standardiserade protokoll inte vara lämplig för varje mål som kommer genom rörledningen och målen kan behöva individuell optimering. Till exempel har vi valt att använda 20% etylenglykol för varje frysskyddsmedel. I fall att detta villkor inte är lämpligt, får alternativa kryoskyddsmedel eller koncentrationer behöva testas.
På grund av den unika karaktären av varje individuellt protein-målet, är det hastighetsbegränsande och oförutsägbara steg för att fastställa en struktur kristallisation. De MTPP pipeline förskjuter den allmänt låga andelen framgångsrika proteinkristallisering med optimering av de ursprungliga gles matris skärmar. Varje initial kristall hit från kommersiellt tillgängliga gles matris skärmar optimeras ytterligare med en E-Screen Builder (Emerald Bio). Optimeringen Skärmen är konstruerad ARound tillståndet hos den initiala kristall träff, ändring av koncentrationerna av de buffertar, salter, och tillsatser. Framgångsrik optimering skärmar ger kristaller lämpliga för diffraktionsstudier och struktur beslutsamhet.
Structural Genomics program som tas fram av det nationella institutet för allergi och infektionssjukdomar (NIAID) finansierar Emerald Bio och tre andra Pacific Northwest institutioner som tillsammans utgör SSGCID (Emerald Bio, SeattleBiomed, University of Washington och Pacific Northwest National Laboratory) . Varje medlem i konsortiet valdes för sin kompetens i tillämpning state-of-the-art teknik som krävs för att uppnå målen i NIAID Structural Genomics programmet. Hittills har SSGCID avsatt 461 strukturer i den preliminära rankingen det som den sjunde största bidragsgivaren i världen, och i 2011, den mest produktiva. De protokoll och metoder för SSGCID är försedda med avsikt att gagnavetenskapliga samfundet och vidmakthålla forskningen av infektionssjukdomar.
Disclosures
Författarna är anställda i Emerald Bio, Inc.
Acknowledgments
Författarna vill tacka alla medlemmar i SSGCID konsortiet. Achievement av SSGCID mål görs möjlig genom de enorma ansträngningar av alla gruppmedlemmar på Emerald Bio. Denna forskning har finansierats inom ramen för Federal Contract No HHSN272200700057C från det nationella institutet för allergi och infektionssjukdomar, National Institutes of Health och Department of Health and Human Services.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primers | IDT | ||
| Genes | DNA 2.0 | ||
| TE buffer | Qiagen | provided in kit | |
| 96-well half skirt PCR plates | VWR | 10011-248 | |
| PFU Master Mix | |||
| 6X Orange Loading Dye | Fermentas | R0631 | |
| 10X TAE | Teknova | T0280 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9414-10G | |
| pET28 vector | |||
| 2-YT Broth | VWR | 101446-848 | |
| Kanamycin | Teknova | K2151 | |
| Restriction Enzymes | Fermentas | ||
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Top 10 chemically comp cells | Invitrogen | C4040-06 | |
| Disposable Troughs (Sterile, 25 ml) | VWR | 89094-662 | |
| Airpore covers (Rayon films for bio cultures) | VWR | 60941-086 | |
| 24-well blocks | VWR | 13503-188 | |
| QIAvac 96 | Qiagen | 19504 | |
| BL21(DE3) cells chemcomp (phageR) | NEB | C2527H | |
| 50% Glycerol | VWR | 100217-622 | |
| TB Media | Teknova | T7060 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | ||
| 1 M Tris pH 8.0 | Mediatech | 46-031-CM | |
| 5 M NaCl | Teknova | S0251 | |
| Glycerol | Aldrich | G7893-4L | |
| CHAPS | JT Baker | 4145-01 | |
| Imidazole | Sigma | 56749-1KG | |
| TCEP | Amresco | K831-10G | |
| L-arginine | Amresco | 0877-500G | |
| Benzonase | EMD | 70746-3 | |
| Lysozyme | USB | 1864525GM | |
| 10 kDa MWCO dialysis tubing | Thermo | 68100 | |
| Amicon Ultra 10 ka MWCO concentrators | Millipore | UFC901024 | |
| HisTrap FF columns | GE | 17-5255-01 | |
| HiTrap Chelating columns | GE | 17/0408-01 | |
| Compact Jr crystallization plates | Emerald Bio | EBS-XJR | |
| Crystalization screens | Emerald Bio | ||
| Ethylene Glycol 100% | Emerald Bio | EBS-250-EGLY | |
| Crystal Wand Magnetic Straight | Hampton Research | HR4-729 | |
| Mounted CryoLoop 0.1-0.2 mm | Hampton Research | HR4-955 | |
| ALS style puck | |||
| Puck Wand | |||
| Bent Tongs | |||
| Puck Pusher |
References
- Lowen, A. C., Mubareka, S., Steel, J., Palese, P. Influenza virus transmission is dependent on relative humidity and temperature. PLoS Pathogens. 3 (10), 1470-1476 (2007).
- Yamada, S., et al. Biological and structural characterization of a host-adapting amino acid in influenza virus. PLoS Pathog. 6, e1001034 (2010).
- Lorimer, D., Raymond, A., Walchli, J., Mixon, M., Barrow, A., Wallace, E., Grice, R., Burgin, A., Gene Stewart, L. Composer: database software for protein construct design, codon engineering, and gene synthesis. BMC Biotechnol. 9, 36 (2009).
- Kabsch, W. Integration, scaling, space-group assignment and post-refinement. Acta Cryst. D. 66, 125-132 (2010).
- McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. J. Phaser crystallographic software. Appl. Cryst. 40, 658-674 (2007).
- Kuzuhara, T., Kise, D., et al. Structural basis of the influenza A virus RNA polymerase PB2 RNA-binding domain containing the pathogenicity-determinant lysine 627 residue. J. Biol. Chem. 284, 6855-6860 (2009).
- Murshudov, G. N., Skubàk, P., Lebedev, A. A., Pannu, N. S., Steiner, R. A., Nicholls, R. A., Winn, M. D., Long, F., Vagin, A. A. REFMAC5 for the refinement of macromolecular crystal structures. Acta Cryst. D. 67, 355-367 (2011).
- Cowtan, K. Recent developments in classical density modification. Acta Cryst. D. 66, 470-478 (2010).
- Chen, V. B., Arendall, W. B., Headd, J. J., Keedy, D. A., Immormino, R. M., Kapral, G. J., Murray, L. W., Richardson, J. S., Richardson, D. C. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Cryst. D. 66, 12-21 (2010).
- Mossessova, E., Lima, C. D. Ulp1-SUMO crystal structure and genetic analysis reveal conserved interactions and a regulatory element essential for cell growth in yeast. Mol. Cell. 5, 865-876 (2000).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Cryst. D. 66, 486-501 (2010).
- Raymond, A. C., Haffner, T. E., Ng, N., Lorimer, D., Staker, B. L., Stewart, L. J. Gene design, cloning and protein-expression methods for high-value targets at the Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease. Acta Cryst. F. 67, 992-997 (2011).
- Smith, E. R., Begley, D. W., Anderson, V., Raymond, A. C., Haffner, T. E., Robinson, J. I., Edwards, T. E., Duncan, N., Gerdts, C. J., Mixon, M. B., Nollert, P., Staker, B. L., Stewart, L. J. The Protein Maker: an automated system for high-throughput parallel purification. Acta Cryst. F. 67, 1015-1021 (2011).
