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Immunology and Infection

इन्फ्लुएंजा पोलीमरेज़ के जीन से संरचना निर्धारण PB2 सबयूनिट के लिए मल्टी लक्ष्य समांतर प्रोसेसिंग दृष्टिकोण

Published: June 28, 2013 doi: 10.3791/4225
* These authors contributed equally

Summary

संरचना के आधार पर दवा डिजाइन दवा के विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. समानांतर में कई लक्ष्यों का पीछा बहुत नेतृत्व की खोज के लिए सफलता की संभावना बढ़ जाती है. निम्न आलेख संक्रामक रोग के लिए सिएटल स्ट्रक्चरल जीनोमिक्स सेंटर PB2 इन्फ्लूएंजा ए सबयूनिट के जीन से संरचना निर्धारण के लिए एक बहु - लक्ष्य दृष्टिकोण का इस्तेमाल कैसे प्रकाश डाला गया.

Abstract

अत्यधिक विषमय इन्फ्लूएंजा उपभेदों की महामारी फैलने के दुनिया भर में मानव आबादी में व्यापक रुग्णता और मृत्यु दर का कारण बन सकता है. संयुक्त राज्य अमेरिका अकेले में, 41,400 लोगों की मृत्यु और 1,860,000 hospitalizations के एक औसत प्रत्येक वर्ष 1 इन्फ्लूएंजा वायरस के संक्रमण के कारण होता है. पोलीमर्स बुनियादी प्रोटीन 2 सबयूनिट (PB2) में बिंदु उत्परिवर्तन मनुष्यों 2 में वायरल संक्रमण का अनुकूलन करने के लिए जोड़ा गया है. इस तरह के अध्ययन से निष्कर्ष इस प्रकार एक एंटीवायरल दवा लक्ष्य के रूप में अपनी क्षमता पर प्रकाश डाला, एक विषैलापन कारक के रूप में PB2 की जैविक महत्व का पता चला है.

एलर्जी और संक्रामक रोग के राष्ट्रीय संस्थान (NIAID) के आगे रख दिया संरचनात्मक जीनोमिक्स कार्यक्रम पन्ना जैव और एक साथ संक्रामक रोग (SSGCID) के लिए सिएटल स्ट्रक्चरल जीनोमिक्स सेंटर को बनाने वाली तीन अन्य उत्तर पश्चिमी प्रशांत संस्थानों के लिए धन उपलब्ध कराता है. SSGCID thre के साथ वैज्ञानिक समुदाय प्रदान करने के लिए समर्पित हैNIAID श्रेणी एसी रोगजनकों के ई आयामी प्रोटीन संरचनाओं. वैज्ञानिक समुदाय के लिए उपलब्ध इस तरह के संरचनात्मक जानकारी बनाना संरचना के आधार पर दवा डिजाइन में तेजी लाने के लिए कार्य करता है.

संरचना के आधार पर दवा डिजाइन दवा के विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. समानांतर में कई लक्ष्यों का पीछा बहुत एक मार्ग या एक पूरी प्रोटीन परिवार को लक्षित करके नए नेतृत्व की खोज के लिए सफलता की संभावना बढ़ जाती है. पन्ना जैव संघ का समर्थन करने के लिए जीन करने वाली संरचना निर्धारण के लिए एक उच्च throughput, बहु लक्ष्य समानांतर प्रसंस्करण पाइपलाइन (MTPP) विकसित की है. यहाँ हम चार अलग इन्फ्लूएंजा उपभेदों से PB2 सबयूनिट की संरचना निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल का वर्णन है.

Protocol

प्रोटोकॉल के एक सिंहावलोकन चित्र 1 में प्रस्तुत किया है.

आण्विक जीवविज्ञान

1. डिजाइन निर्माण

प्रोटीन का निर्माण और कोडोन इंजीनियर कृत्रिम जीन दृश्यों डिजाइन करने के लिए जीन संगीतकार सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें. जीन संगीतकार सॉफ्टवेयर का उपयोग कहीं और 3 विस्तार से पेशकश की गई है.

  1. संरेखण दर्शक मॉड्यूल का उपयोग करें और प्रोटीन अनुक्रम संरेखण तुलना और प्रोटीन निर्माण को परिभाषित करने के लिए डिजाइन मॉड्यूल निर्माण. , यदि उपलब्ध है (चित्रा 2) प्रोटीन डाटा बैंक (पी डी बी) में homologs से प्राथमिक और 3 डी संरचनात्मक तत्वों दोनों को लक्ष्य अमीनो एसिड अनुक्रम संरेखित करें.
  2. प्राथमिक संरचना के संरक्षण और homologs की 3 डी संरचना पर आधारित नई टर्मिनी चुनकर संरचना निर्देशित निर्माण डिजाइन बनाने के लिए संरेखण जानकारी का उपयोग करें.
  3. डिजाइन डालने पीसीआर (iPCR) और वेक्टर पीसीआर (vPCR) amplimers (टर्मिनल प्राइमरों).
  4. जीन सी का प्रयोगomposer के प्रोटीन से डीएनए एल्गोरिथ्म, कोडोन इंजीनियर न्यूक्लिक एसिड अनुक्रम में निर्माण एमिनो एसिड अनुक्रम बैक अनुवाद करते हैं.
  5. ई. में अभिव्यक्ति के लिए अनुक्रम अनुकूलन करने के लिए उचित कोडोन उपयोग तालिका (कट) का उपयोग करें कोलाई.
  6. वस्तुतः आसान शुद्धि के लिए अनुमति देता है एक एन टर्मिनल 6x हिस्टडीन टैग और Smt3/SUMO संलयन प्रोटीन को शामिल करने के लिए संशोधित pET28 वेक्टर में डालने क्लोन.
  7. डीएनए 2.0 और एकीकृत डीएनए टेक्नोलॉजीज से आदेश प्राइमरों के साथ कृत्रिम जीन आदेश रखें.

2. पोलीमर्स अधूरा प्राइमर एक्सटेंशन (पाइप) क्लोनिंग

  1. प्राइमर और जीन तैयार
    1. 1 मिनट के लिए 1000 rpm पर प्राइमर युक्त विक्रेता की आपूर्ति की प्लेटें अपकेंद्रित्र.
    2. प्राइमर एकाग्रता 100 माइक्रोन तक लाने के लिए और 50 μl ते बफर जोड़ें.
    3. एक 96 अच्छी तरह से वी के नीचे की थाली में विआयनीकृत (डी) पानी के साथ 10 माइक्रोन तक प्राइमरों पतला.
    4. 1 मिनट के लिए 1300 rpm पर एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में विक्रेता की आपूर्ति जीन अपकेंद्रित्र.
    5. 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों में, प्रत्येक प्राइमर के dilutions 10 एनजी / μl के लिए बनाते हैं.
    6. जब उपयोग में -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर प्राइमरों और जीन.
  2. सम्मिलित पीसीआर (iPCR) तैयार करें
    1. बर्फ पर Pfu मास्टर मिक्स की एक शीशी पिघलना, कमरे के तापमान पर जीन और प्राइमरों रखना.
    2. प्राइमर का एक सेट करने के लिए एक थाली नक्शा बताए कुओं बनाएँ और निर्माण.
    3. एक 96 अच्छी तरह से पीसीआर थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से में डि पानी के 13 μl जोड़ें.
    4. प्रत्येक अच्छी तरह से बीच सुझावों को बदलने के लिए, यह सुनिश्चित करने थाली नक्शे के अनुसार 96 अच्छी तरह से थाली में प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए आगे के 5 μl और रिवर्स प्राइमर के 5 μl जोड़ें.
    5. अच्छी तरह से थाली के नक्शे के अनुसार इसकी उचित करने के लिए प्रत्येक पूर्ण लंबाई जीन की 2 μl जोड़ें.
    6. प्रत्येक अच्छी तरह से बीच सुझावों को बदलने के लिए, यह सुनिश्चित करना हर अच्छी तरह से Pfu मास्टर मिश्रण के 25 μl जोड़ें.
    7. निम्नलिखित पीसीआर शर्तों का उपयोग प्रतिक्रियाओं साइकिल:
      1. 95 डिग्री सेल्सियस 2 मिनट 95 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड
      2. 50 डिग्री सेल्सियस 45 सेकंड
      3. 68 डिग्री सेल्सियस 3 मिनट
      4. 4 डिग्री सेल्सियस ∞
    8. 25 चक्र के लिए कदम बी.डी. दोहराएँ.
    9. एक नया 96 अच्छी तरह से पीसीआर प्लेट के लिए प्रत्येक iPCR प्रतिक्रिया के 10 μl स्थानांतरण.
    10. प्रत्येक नमूने के 6X लोड डाई के 3 μl जोड़ें.
    11. टुकड़ा प्रवर्धन की पुष्टि के लिए एक 100-500 बीपीएस डीएनए सीढ़ी के बगल में 110 वी में 1% TAE EtBr agarose जेल पर प्रत्येक नमूना अलग करें.
    12. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर iPCR उत्पाद जब उपयोग में नहीं है (फ्रीज पिघलना जितना संभव से बचने).

3. वेक्टर पीसीआर (vPCR) तैयार करें

  1. तब्दील ई. की रात संस्कृति प्रारंभ प्लाज्मिड pET28 वेक्टर साथ कोलाई.
    1. 50 माइक्रोग्राम / एमएल केनामाइसिन साथ 2 YT शोरबा के दो 5 मिलीलीटर ट्यूबों टीका लगाना.
    2. 220 rpm पर 37 पर रात भर संस्कृतियों ° प्रकार के बरतन में सी के लिए आगे बढ़ें.
  2. 15 मिनट के लिए 3000 rpm पर centrifuging द्वारा रातोंरात वृद्धि के बाद संस्कृतियों स्पिन.
  3. एक Qiagen Qia का प्रयोग करेंप्रस्तुत करने का स्पिन Miniprep किट निर्माता के निर्देशों के अनुसार बैक्टीरिया छर्रों से pET28 वेक्टर निकालने के लिए.
  4. के सेटअप प्रतिबंध एंजाइम digestions pET28 प्लाज्मिड निकाला.
    1. PET28 वेक्टर की 20 μl के लिए 10X BamHI बफर के 2.2 μl और BamHI और HindIII की 1 μl जोड़ें.
    2. 37 पर 1 घंटे के लिए प्रतिक्रिया सेते डिग्री सेल्सियस
  5. एक जेल पर अलग पाचन उत्पाद.
    1. 2.2.10 कदम को देखें.
    2. जेल से वेक्टर बैंड कट और निर्माता के निर्देशों के अनुसार QIAquick जेल निकालना किट का उपयोग कर यह शुद्ध.
  6. एक NanoDrop का प्रयोग, डीएनए एकाग्रता यों.
  7. 10 एनजी / μl के लिए वेक्टर कटौती पतला. -20 डिग्री सेल्सियस जब उपयोग में नहीं है पर स्टोर.
  8. VPCR प्राइमरों तैयार.
    1. 1,300 rpm पर 1 मिनट के लिए IDT आपूर्ति oligonucliotides अपकेंद्रित्र.
    2. डि पानी के साथ 100 माइक्रोन के लिए एकाग्रता लाओ.
    3. एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में दोनों आगे और रिवर्स प्राइमरों के 10 माइक्रोन कमजोर पड़ने को तैयार है.
    4. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर प्राइमरों और प्राइमर dilutions
  9. कमरे के तापमान पर बर्फ और पिघलना टेम्पलेट और प्राइमरों पर Pfu मास्टर मिक्स गला लें.
  10. एक 96 अच्छी तरह से पीसीआर थाली में सेटअप vPCR प्रतिक्रियाओं:
    1. एक 96 अच्छी तरह से थाली की पहली पंक्ति में आगे और रिवर्स vPCR प्राइमरों दोनों के 60 μl और पच pET28 टेम्पलेट (μl / 10 एनजी) के 24 μl गठबंधन.
    2. एक 12 टिप multichannel विंदुक का प्रयोग, प्रत्येक थाली की अच्छी तरह से शेष से 12 प्राइमर के μl और टेम्पलेट मास्टर मिश्रण हस्तांतरण. इस किताब और थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से में टेम्पलेट मास्टर मिश्रण के 12 μl में परिणाम चाहिए.
    3. प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए डि पानी के 13 μl जोड़ें.
    4. प्रत्येक अच्छी तरह से Pfu मास्टर मिक्स के 25 μl जोड़ें.
  11. कदम 2.2.7 में इस्तेमाल पीसीआर स्थितियों के माध्यम से साइकिल प्रतिक्रियाओं.
  12. पूल एक 15 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब में vPCR प्रतिक्रियाओं के सब.
  13. (पच pET28 वेक्टर की उम्मीद की लंबाई एक जेल पर जमा पीसीआर उत्पाद के 10 μl अलग करके टुकड़ा प्रवर्धन सत्यापित करेंलगभग 6 केबी) है.
    1. 2.2.10 कदम को देखें.
  14. प्लेटों के विलय की तैयारी.
    1. एक 96 अच्छी तरह से वी के नीचे प्लेट के प्रत्येक कुएं में vPCR उत्पाद की अशेष 3 μl.
    2. -20 पर स्टोर प्लेटें ° iPCR उत्पाद के साथ मर्ज तक सी.

4. IPCR और vPCR उत्पाद मर्ज

  1. पिघलना iPCR उत्पादों और पूर्व aliquoted vPCR 96 अच्छी तरह से कमरे के तापमान पर थाली विलय.
  2. मर्ज थाली के अपने संबंधित अच्छी तरह से करने के लिए प्रत्येक iPCR उत्पाद के 3 μl जोड़ें.
  3. शीर्ष दस रासायनिक सक्षम कोशिकाओं में थाली विलय रूपांतरण.
  4. विक्रेता आपूर्ति रासायनिक सक्षम कोशिकाओं की एक 50 μl ट्यूब में हर मर्ज की प्रतिक्रिया के 2 μl जोड़ें और निर्माता की आपूर्ति प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ना.
  5. परिवर्तन थाली से प्रत्येक निर्माण के लिए रात भर संस्कृतियों को तैयार है.
  6. एक गहरी अच्छी तरह से ब्लॉक के प्रत्येक कुएं में एक 25 मिलीलीटर बाँझ जलाशय से विभाज्य 5 मिलीलीटर टीबी शोरबा (50 माइक्रोग्राम / एमएल केनामाइसिन साथ).
  7. Steri का प्रयोगले तकनीक, प्रत्येक परिवर्तन थाली से एक अलग कॉलोनी लेने और गहरी अच्छी तरह से ब्लॉक का उचित अच्छी तरह से टीका लगाना.
  8. एक AIRPORE कवर के साथ ब्लॉक कवर.
  9. 37 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर 220 rpm पर ब्लॉक हिलाएँ.
  10. 4,000 rpm पर 30 मिनट के लिए ब्लॉक centrifuging द्वारा गोली कोशिकाओं.
  11. तैरनेवाला डालो और एक कागज तौलिया के साथ सूखी ब्लॉक के शीर्ष थपथपाना.
  12. मिनी प्रस्तुत करने का निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक Qiagen 96 अच्छी तरह से निर्वात उपकरण का उपयोग कर.

5. सफलतापूर्वक क्लोन संरचनाओं के ग्लिसरॉल स्टॉक तैयारी

  1. सफलतापूर्वक निर्माता के निर्देशों के अनुसार BL21 (DE3) रासायनिक सक्षम कोशिकाओं में अनुक्रम पुष्टि डीएनए क्लोन बदलना.
  2. प्रत्येक निर्माण के लिए, 2 YT शोरबा का 1 मिलीलीटर (50 माइक्रोग्राम / एमएल केनामाइसिन साथ) में BL21 (DE3) परिवर्तन और टीका लगाना से एक अलग कॉलोनी उठाओ.
  3. 37 में 3-4 घंटे के लिए 220 rpm पर संस्कृतियों हिला डिग्री सेल्सियस
  4. एक 1.5 मिलीलीटर लेबलअद्वितीय निर्माण आइडेंटिफिकेशन नंबर, सेल तनाव, और तारीख के साथ टोपी ट्यूब पेंच. 50% ग्लिसरॉल के 500 μl और सेल संस्कृति के 500 μl जोड़ें और कई बार पलटना. तुरंत सूखी बर्फ पर या एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में ग्लिसरॉल स्टॉक की दुकान.

6. अभिव्यक्ति परीक्षण

सेल Buffe आर बफर धो क्षालन बफर
50 मिमी नाह 2 4 पीओ, पीएच 8.0
300 मिमी NaCl
10 मिमी imidazole
1% के बीच 20
2 मिमी 2 MgCl
0.1 मिलीग्राम / μl Benzonase
1 मिलीग्राम / एमएल Lysozyme
50 मिमी नाह 2 4 पीओ, पीएच 8.0
300 मिमी NaCl
20 मिमी imidazole
0.05% बीच 20
25 मिमी Tris, पीएच 8.0
300 मिमी NaCl
250 मिमी imidazole
0.05% बीच 20

* जोड़ें Benzonase, लाइसोजाइम,तुरंत सेल से पहले और protease अवरोध.

  1. स्ट्रीक एक केनामाइसिन चयनात्मक अगर पर ग्लिसरॉल स्टॉक से नमूना और 37 पर रातोंरात सेते डिग्री सेल्सियस
  2. एक हौसले से उगाया ई. के साथ 0.5% ग्लूकोज के साथ पूरक टीका लगाना 1.2 मिलीलीटर टीबी शोरबा (50 मिलीग्राम / एमएल केनामाइसिन के साथ), एक 96 अच्छी तरह गोल नीचे ब्लॉक में एक गैर उत्प्रेरण पूर्व संस्कृति प्रारंभ कोली को अलग. रात में 37 डिग्री सेल्सियस पर 220 rpm पर मिलाते हुए आगे बढ़ें
  3. रातोंरात वृद्धि के बाद, Novagen ओवरनाइट एक्सप्रेस 1 प्रणाली (निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार) पूर्व संस्कृति के 40 μl के साथ साथ पूरक टीबी शोरबा के 1.2 मिलीलीटर (50 मिलीग्राम / एमएल केनामाइसिन साथ) inoculating द्वारा प्रेरण संस्कृतियों शुरू.
  4. 220 rpm पर मिलाते हुए 48 घंटा के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर छोटे पैमाने पर प्रेरण संस्कृतियों आगे बढ़ें.
  5. 15 मिनट के लिए 4000 rpm पर centrifuging द्वारा हार्वेस्ट कोशिकाओं, प्रसंस्करण करने से पहले कम से कम 1 घंटे के लिए -20 पर तैरनेवाला और दुकान डिग्री सेल्सियस टपकना.
  6. 96 अच्छी तरह से ब्लॉक में 300 μl lysis बफर में सेल छर्रों resuspend. सख्ती कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए झटकों से यांत्रिक सेल द्वारा पीछा किया 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर lysis बफर में कोशिकाओं को सेते हैं.
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 4,000 rpm पर 30 मिनट के लिए centrifugation द्वारा कच्चे lysate स्पष्ट करें
  8. एक 96 अच्छी तरह से फ्लैट नीचे ट्रे (Qiagen) को स्पष्ट किया lysate (घुलनशील अंश) के 200 μl हस्तांतरण करने के लिए एक मल्टी चैनल विंदुक का प्रयोग करें. साथ ही एक नमूना है जिसमें प्रत्येक के लिए, 40 μl नी NTA चुंबकीय मोती (Qiagen) जोड़ें.
  9. धीरे 16 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए एक घुमाव पर थाली आंदोलन
  10. एक चुंबकीय पोस्ट प्लेट (Qiagen) पर थाली प्लेस और अपार घुलनशील अंश हटा दें. नी NTA मोती के किसी भी बाहर पिपेट नहीं ख्याल रखना.
  11. पोस्ट थाली से थाली निकालें और धीरे 200 μl धो बफर में मोती resuspended. पिपेट और नीचे 30 सेकंड के लिए और फिर बाद थाली पर वापस थाली जगह.
  12. धोने बफर निकालें और कदम 6.12 दोहराएँ.
  13. पोस्ट थाली से थाली निकालें और नी NTA टा बाध्य elute5 मिनट के लिए 50 μl क्षालन बफर के साथ धोने से rget प्रोटीन.
  14. चुंबकीय पोस्ट प्लेट को फ्लैट नीचे प्लेट लौटें और एक ताजा 96 अच्छी तरह से वी के नीचे प्लेट को क्षालन हस्तांतरण.
  15. एक ताजा 96 अच्छी तरह से वी के नीचे प्लेट को क्षालन के 20 μl स्थानांतरण और 1 μl ULP1 प्रोटीज के साथ प्रतिक्रिया.
  16. निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार, एक LabChip 90 का उपयोग कर केशिका वैद्युतकणसंचलन द्वारा eluted और eluted + Ulp1 अंश का विश्लेषण.
  17. वैकल्पिक रूप से, अभिव्यक्ति के परीक्षण से सभी भिन्न एसडीएस पृष्ठ के माध्यम से विश्लेषण किया जा सकता है.

7. बड़े पैमाने पर किण्वन

  1. एक ग्लिसरॉल स्टॉक से एक परिमार्जन प्राप्त करने के लिए एक बाँझ विंदुक टिप का उपयोग करें, 100 मिलीलीटर टीबी शोरबा (50 मिलीग्राम / एमएल केनामाइसिन साथ) टीका लगाना और रात में हो जाना. 220 rpm और 37 डिग्री सेल्सियस पर मंथन
  2. रातोंरात वृद्धि के बाद, की 10 मिलीलीटर के साथ एक 2 एल चकित फ्लास्क में ईएमडी autoinduction समाधान (निर्माता प्रोटोकॉल देखें) (50 मिलीग्राम / एमएल केनामाइसिन के साथ) के साथ टीबी शोरबा का 1 एल inoculating द्वारा पूर्व संस्कृति का विस्तारपूर्व संस्कृति (1:100 कमजोर पड़ने).
  3. 37 में विस्तारित 1 एल संस्कृतियों हिला डिग्री सेल्सियस, 20 को मिलाते इनक्यूबेटर का तापमान बदल डिग्री सेल्सियस 0.6 (600 आयुध डिपो) की एक ऑप्टिकल घनत्व तक पहुँच जाता है.
  4. रातोंरात वृद्धि के बाद, अभिव्यक्ति के परीक्षण के लिए प्रत्येक निर्माण से एक प्रतिनिधि 10 मिलीलीटर विभाज्य ले.
  5. हार्वेस्ट सेल 15 मिनट के लिए 5000 rpm पर centrifugation द्वारा पेस्ट और सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
  6. -80 पर चस्पा रुक सेल डिग्री सेल्सियस

प्रोटीन शुद्धि

बफ़र:

Lysis बफर एक (संतुलन) बफर बफर बी (क्षालन) कॉलम बफर नौकरशाही का आकार घटाने
25 मिमी Tris, पीएच 8.0
200 मिमी NaCl
0.5% ग्लिसरॉल
0.02% CHAPS
10 मिमी imidazole
1 मिमी TCEP
50 मिमी Arginine
5 μl Benzonase
100 मीटरजी Lysozyme
3 protease अवरोध करनेवाला गोलियाँ (ईडीटीए मुक्त)
25 मिमी Tris, पीएच 8.0
200 मिमी NaCl
10 मिमी imidazole
1 मिमी TCEP
50 मिमी Arginine
0.25% ग्लिसरॉल
25 मिमी Tris, पीएच 8.0
200 मिमी NaCl
200 मिमी imidazole
1 मिमी TCEP
25 मिमी Tris, पीएच 8.0
200 मिमी NaCl
1% ग्लिसरॉल
1 मिमी TCEP

* तुरंत सेल से पहले प्रत्येक 150 मिलीलीटर नमूने के Benzonase, लाइसोजाइम, और protease अवरोध गोलियाँ जोड़ें.

8. सेल

  1. Lysis बफर के 2 एल करें; लाइसोजाइम, protease अवरोध गोलियाँ या Benzonase (प्रत्येक नमूना lysis बफर के 150 मिलीलीटर में अलग lysed जाएगा) जोड़ नहीं है.
  2. पिघलना और resuspend सेल एक 01:05 बड़े पैमाने पर lysis बफर में पेस्ट: मात्रा अनुपात सख्ती से 4 बजे 30 मिनट के लिए सरगर्मी डिग्री सेल्सियस से एक साफ रंग का उपयोग बीकर की तरफ से ढीला हिस्सा टूट गया. इस समय अवधि के दौरान नी और Dialy तैयारबहन बफ़र
  3. बर्फ पर, एक Misonix sonicator (3 मिनट के लिए 70% बिजली, 2 सेकंड पर / 1 सेकंड बंद दालों) और overheating रोकने के लिए धीरे ज़ुल्फ़ कंटेनर का उपयोग कोशिकाओं lyse. भविष्य के विश्लेषण के लिए कच्चे lysate के एक छोटे से (200 μl) विभाज्य सहेजें.
  4. 4 में 35 मिनट के लिए 18,000 XG पर centrifugation द्वारा कच्चे lysate डिग्री सेल्सियस को स्पष्ट तैरनेवाला इकट्ठा करने और भविष्य के विश्लेषण के लिए एक छोटी सी (200 μl) विभाज्य बचा. स्टोर गोली 4 डिग्री सेल्सियस पर यह प्रोटीन घुलनशील अंश में lysed किया गया है की पुष्टि की है जब तक.

9. पूर्व रन प्रोटीन निर्माता सेटअप

  1. प्रोटीन निर्माता पर बदल गया और सॉफ्टवेयर को खोलने का साधन को प्रारंभ.
  2. एक बार initialized, नमूनों में से प्रत्येक के लिए गैन्ट्री की एक अलग लाइन पर एक 5.0 मिलीलीटर जीई हेल्थकेयर HisTrap एफएफ निकल chelate स्तंभ (नी स्तंभ) देते हैं.
  3. प्रत्येक स्तंभ के माध्यम से संतुलन बफर के 3-4 स्तंभ मात्रा (सीवी) चलाएँ.
  4. संतुलन और क्षालन बफर लाइनों प्रधानमंत्री.
  5. Equilibrएक बार स्तंभ के माध्यम से बफर एक aspirating द्वारा स्तंभों को खा लिया.

10. निकेल 1 (Ni1) कॉलम

  1. भंडारण बफर दूर करने के लिए 20 मिलीलीटर मिल्ली क्यू पानी के साथ प्रत्येक स्तंभ धो लें. 5 मिलीलीटर बफर बी और संतुलन के लिए 25 मिलीलीटर बफर एक चलाएँ.
  2. 2 मिलीग्राम / मिनट की दर से स्तंभों में solubilized प्रोटीन युक्त स्पष्ट lysate लोड तो बफर ए के साथ एक 15 मिलीलीटर धोने से पालन
  3. Buffers के साथ एक कदम ढाल में बाध्य प्रोटीन Elute सम्मान से पीछा कर अनुपात से ए और बी: 5 मिलीलीटर 95:5, 5 मिलीलीटर 60:40, 10 मिलीलीटर 0:100. अलग क्षालन अंश लीजिए.
  4. विश्लेषण: एसडीएस पृष्ठ से eluted भिन्न, कच्चे lysate, स्पष्ट lysate, और प्रवाह के माध्यम से. पूल भिन्न प्रोटीन युक्त और मोटे तौर पर मौजूद प्रोटीन की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक 280 को मापने के लिए एक Nanodrop का उपयोग करें.

11. ULP1 विखंडन

  1. बाद में जेल के विश्लेषण के लिए Ni1 स्तंभ पूल के एक छोटे से विभाज्य (250 μl) रखें. बाकी लाओ10 मिलीग्राम और उनके-श्रीमती आत्मीयता टैग हटाने के लिए कुल प्रोटीन की 1 μl / 5 मिलीग्राम पर ubiquitin की तरह प्रोटीज 1 (ULP1) जोड़ने के लिए Ni1 पूल की.
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर एक हलचल प्लेट पर एक 10 केडीए आणविक वजन कटौती (MWCO) में 4 डिग्री सेल्सियस से कम 4 घंटे के लिए बफर के 2 एल के खिलाफ Ni1 पूल + ULP1 Dialyze
  3. डायलिसिस के बाद, Ni1 पूल और Ni1 पूल + ULP1 ULP1 दरार सफल रहा तो यह निर्धारित करने के एसडीएस पृष्ठ चलाते हैं.

12. निकेल 2 (Ni2) कॉलम

  1. एक ही नी स्तंभ पर cleaved प्रोटीन लोड और 1 मिलीग्राम / मिनट की एक प्रवाह कम दर पर कदम 9.3 दोहराएँ. cleaved बंद टैग स्तंभ के लिए बाध्य होगा और tagless लक्ष्य प्रोटीन अब प्रवाह के माध्यम से होगा. एक ताजा कंटेनर में प्रवाह के माध्यम से ले लीजिए.
  2. 3 मिलीग्राम बफर के साथ नी स्तंभ धो एक सब उनकी टैग और nonspecifically बाध्य प्रोटीन elute लिए बफर बी के 5 मिलीलीटर द्वारा पीछा किया. अलग से एक अंश ले लीजिए.
  3. Ni2 के एसडीएस पृष्ठ धोने, प्रवाह के माध्यम से और Ni2 क्षालन भिन्न ULP1 दरार को सत्यापित करने के लिए और कहा कि भागो जनसंपर्कotein के माध्यम से प्रवाह में मौजूद है. मोटे तौर पर प्रोटीन की उपस्थिति निर्धारित करने के लिए एक 280 को मापने के लिए एक Nanodrop का प्रयोग करें.

13. ध्यान दे

  1. Ni2 प्रवाह के माध्यम से ध्यान लगाओ (और प्रोटीन मौजूद है Ni2 क्षालन) एक Amicon अल्ट्रा 10 केडीए MWCO अपकेंद्रित्र ट्यूब के साथ 5 मिलीलीटर. 4 डिग्री सेल्सियस पर 4,000 rpm पर 10 मिनट के अंतराल में स्पिन झिल्ली के किनारे से अधिक ध्यान केंद्रित से प्रोटीन को रोकने के लिए प्रत्येक स्पिन के बीच एक विंदुक के साथ मिक्स.

14. आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी (एसईसी)

  1. 0.5 मिलीग्राम / एक AKTApurifier प्रणाली (जीई हेल्थकेयर) पर मिनट की एक प्रवाह दर पर 200 मिली सेकंड के बफर के साथ equilibrating द्वारा एक Sephacryl एस -100 10/30 जीएल स्तंभ (जीई हेल्थकेयर) की स्थापना की.
  2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एसईसी स्तंभ पर इस्तेमाल के लिए 10 मिलीलीटर superloops तैयार.
  3. एक 5 मिलीलीटर सिरिंज का प्रयोग, superloops पर नमूने लोड और एसईसी चलाने लगते हैं.
  4. छोटी मात्रा fr एकत्रित जबकि 280 एनएम पर यूवी absorbance को ट्रेस मॉनिटरकार्रवाई.
  5. एसडीएस पृष्ठ के माध्यम से एसईसी भिन्न भागो.
  6. उच्चतम तीव्रता बैंड दिखा एसईसी भिन्न तरणताल.
  7. जमा एसईसी भिन्न ध्यान लगाओ. 13.1 कदम को देखें.
  8. 100 μl नमूने, -80 में तरल नाइट्रोजन और दुकान में फ्लैश फ्रीज डिग्री सेल्सियस में विभाज्य प्रोटीन

रवे बनाने की प्रक्रिया

15. प्रोटीन Crystallization

  1. चुनाव के क्रिस्टलीकरण स्क्रीन के 80 μl (पन्ना जैव) के साथ एक 96 अच्छी तरह से कॉम्पैक्ट जूनियर क्रिस्टलीकरण थाली के प्रत्येक जलाशय (पन्ना बायो) पूर्व भरें.
  2. 2-20 मिलीग्राम / बर्फ पर एमएल और स्टोर करने के लिए बफर आकार के साथ प्रोटीन पतला.
  3. 96 कुओं में से प्रत्येक में प्रोटीन और क्रिस्टलीकरण स्क्रीन के 0.4 μl के 0.4 μl बांटना और क्रिस्टल स्पष्ट टेप सील (Manco) के साथ कवर किया.
  4. 16 पर थाली स्टोर डिग्री सेल्सियस एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत अगले कुछ हफ्तों में समय - समय प्रोटीन क्रिस्टलीकरण की जांच करते समय.

16. क्रिस्टल फसल काटने </ P>

  1. माँ शराब और इथाइलीन ग्लाइकॉल से एक cryoprotectant बनाएँ. लक्ष्य प्रोटीन क्रिस्टल के साथ अच्छी तरह से कवर करने स्पष्ट टेप काटें. एक खाली अच्छी तरह से करने के लिए, इसी crystallizing के हालत के 1.6 μl जोड़ने और इथाइलीन ग्लाइकॉल की 0.4 μl 20% इथाइलीन ग्लाइकॉल की एक अंतिम एकाग्रता उपज और 80% हालत crystallizing के साथ गठबंधन. नोट: ग्लिसरॉल, तेल, कम मेगावाट पॉलीथीन ग्लाइकॉल्स, और / या cryoprotectant के प्रतिशत में अलग: क्रिस्टल विवर्तन अनुकूलन करने के लिए इस तरह के रूप में विभिन्न cryoprotectants कोशिश.
  2. ढक्कन के साथ तरल नाइट्रोजन और कवर से भरा एक देवर में एक ए एल एस शैली पक शांत कटाई से पहले.
  3. एक चुंबकीय क्रिस्टल छड़ी (हैम्पटन अनुसंधान) और अच्छी तरह समाधान से सीधे स्कूप पर क्रिस्टल का आकार मिलान भीतरी व्यास के साथ एक CryoLoop रखकर क्रिस्टल हार्वेस्ट.
  4. तुरंत ग फ्रीज फ़्लैश करने के लिए ए एल एस शैली पक में cryoprotectant तो डूब में काटा क्रिस्टल के साथ CryoLoop डुबकीrystal. क्रिस्टल की एक वांछित संख्या के लिए दोहराएँ.

17. क्रिस्टल स्क्रीनिंग / डाटा संग्रह

  1. एक बार कटाई ए एल एस पक पर चुंबकीय क्रायो पक ढक्कन जगह के लिए एक पक की छड़ी का उपयोग पूरा हो गया है. तुला चिमटे से, पक उल्टा फ्लिप.
  2. एक Rigaku अभिनेता देवर को पक स्थानांतरण, पक पर एक पक ढकेलनेवाला पेंच, और ऊपर का सामना पिन के साथ देवर में इसे छोड़ने के ढक्कन बंद मुक्का.
  3. JDirector सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, निम्नलिखित मानकों के तहत स्क्रीन प्रत्येक क्रिस्टल: 0.5 डिग्री करने के लिए सेट किरण भट्ठा, 50 मिमी के लिए सेट डिटेक्टर दूरी, 70 डिग्री करने के लिए छवि कदम, और जोखिम लंबाई 30 सेकंड के लिए निर्धारित किया है.
  4. आप सबसे अच्छा क्रिस्टल और रणनीति डेटा संग्रह के लिए है निर्धारित करने के क्या JDirector के साथ गोली मार दी परीक्षण छवियों पर Mosflm चलाएँ.
  5. Mosflm से अपने परिणाम के आधार पर एक पूर्ण डाटासेट लीजिए.

18. डाटा प्रोसेसिंग / संरचना निर्धारण

  1. डाटासेट प्रक्रिया को XDS / XScale 4 चलाएँ.
  2. CCP4 सूट सॉफ्टवेयर खोलें.
    1. जब उपलब्ध है, एक उच्च अनुरूपता खोज मॉडल का उपयोग कर एक आणविक प्रतिस्थापन समाधान गणना करने के लिए Phaser 5 चलाएँ. इस मामले में हम एक खोज मॉडल के रूप में 6 PDBID 3CW4 इस्तेमाल किया.
    2. डाटासेट में एकत्र मनाया प्रतिबिंब के खिलाफ अपनी आणविक मॉडल को निखारने के लिए Refmac 7 चलाएँ. अंतिम संकल्प उच्चतम खोल के बंद आधारित है और निम्नलिखित मानकों के द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए: आर कारक> 50%, मैं / सिग्मा> 2, और पूर्णता> 90%.
  3. आणविक ग्राफिक्स सॉफ्टवेयर कूट 8 के साथ एक 3 आयामी इलेक्ट्रॉन घनत्व मॉडल बनाएँ.
  4. पी डी बी में संरचना जमा करने से पहले संरचना की है कि गुणवत्ता को सत्यापित करने MolProbity 9 सॉफ्टवेयर के साथ यह मान्य बयान के लिए उपयुक्त है.

Representative Results

निम्नलिखित परिणाम वर्णित प्रोटोकॉल की उम्मीद परिणामों के उदाहरण देकर स्पष्ट करना, और PB2, मनाया परिणामों के मामले में.

इन्फ्लूएंजा वायरस पोलीमरेज़ सबयूनिट PB2 के पांच पूर्ण लंबाई लक्ष्य एमिनो एसिड दृश्यों (चित्रा 2) के डिजाइन किए गए थे, जीन संगीतकार का उपयोग करना. PB2 दृश्यों वापस अनुवादित और कई इंजीनियरिंग चरण 3 के अधीन, ई. में अभिव्यक्ति के लिए अनुकूलित कोडोन सामंजस्य दृश्यों में जिसके परिणामस्वरूप गया कोलाई. iPCR उत्पादों (चित्रा 3b), चौंतीस निर्माणों की कुल से सफलतापूर्वक चित्रा 3a के रूप में दिखाया पाइप क्लोनिंग 3 का उपयोग कर उसका-श्रीमती संलयन टैग एक एन टर्मिनल 6x साथ एक संशोधित pET28 वेक्टर प्रणाली 10 में क्लोन किया गया. क्लोनिंग कार्यप्रवाह का एक सारांश चित्रा 4 में प्रस्तुत किया है.

सफल क्लोनिंग के बाद, प्रत्येक निर्माण के सूक्ष्म पैमाने प्रोटीन अभिव्यक्ति BL21 (DE3) ई. में परीक्षण किया गया थाकोलाई कोशिकाओं. कोशिकाओं 220 rpm पर एक मिलाते मशीन सेट में 20 डिग्री सेल्सियस से कम 48 घंटे के लिए Novagen ओवरनाइट एक्सप्रेस 1 मध्यम (निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार) के साथ पूरक टीबी माध्यम में बड़े हो रहे थे. विकास के बाद, कोशिकाओं एक कैलिपर LabChip 90 के साथ केशिका electrophoreses उपयोग कर घुलनशील प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए काटा और परीक्षण किया गया. घुलनशील प्रोटीन लक्ष्य के लिए नेतृत्व और चौंतीस PB2 निर्माणों के चौदह बड़े पैमाने पर किण्वन में प्रवेश किया. प्रत्येक निर्माण के लिए बड़े पैमाने पर संस्कृतियों निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार Novagen के ओवरनाइट एक्सप्रेस 1 मध्यम के साथ पूरक टीबी माध्यम में बड़े हो रहे थे. विकास के बाद, कोशिकाओं centrifugation के माध्यम से काटा गया और -80 पर संग्रहीत डिग्री सेल्सियस प्रत्येक संस्कृति के बड़े पैमाने पर प्रोटीन अभिव्यक्ति बड़े पैमाने पर शुद्धि के साथ आगे बढ़ने से पहले एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण (चित्रा 5) के माध्यम से इसकी पुष्टि की थी.

प्रोटीन निर्माता चौदह PB2 निर्माणों के समानांतर शुद्धि संचालन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. अल का स्पष्ट lysatesएल चौदह निर्माणों एक निकल chelate स्तंभ के माध्यम से चलाए जा रहे थे. एसडीएस पृष्ठ द्वारा लक्ष्य प्रोटीन जिसमें भिन्न निर्धारण करने के बाद, इसी भिन्न प्रत्येक नमूने के लिए जमा थे और प्रत्येक की एकाग्रता एक ए 280 पढ़ने के द्वारा निर्धारित किया गया था. 6x उनका-श्रीमती टैग का हटाया रातोंरात डायलिसिस और एक दूसरे निकल स्तंभ द्वारा पीछा ULP1 के अलावा द्वारा आयोजित किया गया. उनका-श्रीमती टैग हटाने की पुष्टि एसडीएस पृष्ठ (चित्रा 6) द्वारा आयोजित किया गया था, और प्रत्येक नमूना एक 10 केडीए Amicon अल्ट्रा अपकेंद्रित्र ट्यूब के साथ ध्यान केंद्रित किया गया था. Amicon अल्ट्रा अपकेंद्रित्र ट्यूब का उपयोग एकाग्रता के बाद, प्रत्येक नमूना crystallographic पवित्रता प्राप्त करने के लिए एक आकार स्तंभ के ऊपर चला गया था. एक दूसरा एकाग्रता क्रिस्टलीकरण के लिए आवश्यक एक स्तर को प्रोटीन एकाग्रता बढ़ाने के लिए आयोजित किया गया. सभी चौदह निर्माणों सफलतापूर्वक शुद्ध और crystallization परीक्षण में प्रवेश कर रहे थे.

क्रिस्टलीकरण पहले fr विगलन द्वारा शुरू किया गया थाozen प्रोटीन. क्रिस्टलीकरण 16 पर एक जलवायु नियंत्रित कमरे में प्रदर्शन किया गया था डिग्री सेल्सियस बैठे ड्रॉप वाष्प प्रसार (चित्रा 7) के लिए विशेष रूप से डिजाइन प्लेट (पन्ना जैव) के साथ. प्रारंभिक जांच चार विरल मैट्रिक्स स्क्रीन के साथ आयोजित किया गया, JCSG + संधि, जादूगर पूर्ण, और एक विस्तारित न्यूमैन रणनीति का पालन CryoFull (पन्ना बायो),. प्रोटीन समाधान के 0.4 μl तो 96 अच्छी तरह से कॉम्पैक्ट जूनियर क्रिस्टलीकरण प्लेट (पन्ना बायो) का उपयोग इसी जलाशय से crystallant के 0.4 μl (या जलाशय समाधान) के साथ मिलाया था. चौदह शुद्ध नमूनों की उनमें से नौ विवर्तन पढ़ाई (8 चित्रा) के लिए उपयुक्त क्रिस्टल झुकेंगे. एक घर में विवर्तन डेटा सेट Osmic VariMAX एचएफ प्रकाशिकी और एक शनि 944 + सीसीडी डिटेक्टर से लैस एक Rigaku SuperBright एफआर-ई + घूर्णन-एनोड एक्स - रे जनरेटर का उपयोग घन Kα तरंग दैर्ध्य में सघन नौ निर्माणों में से पांच (9 चित्रा पर एकत्र किया गया था ). प्रत्येक डेटा सेट XDS / XScale 4 के साथ संसाधित किया गया था < / Sup> और एक अंतिम समाधान के लिए पहुंचा. आणविक प्रतिस्थापन द्वारा संरचनाओं को हल करने के लिए प्रयास CCP4 सूट 7 से Phaser 5 से बाहर किया गया. अंतिम मॉडल REFMAC 7 और कूट 11 के साथ मैनुअल पुनर्निर्माण में शोधन के बाद प्राप्त किया गया. संरचनाओं का मूल्यांकन और MolProbity 9 के साथ ज्यामिति और फिटनेस के लिए सही थे. PB2 सबयूनिट की चार संरचनाओं के कुल निर्धारित (चित्रा 10) और पी डी बी में जमा थे. चित्रा 11 MTPP पाइपलाइन में प्रत्येक चरण में कुल परिणाम दिखाता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. पन्ना बायो में मल्टी लक्ष्य समानांतर प्रसंस्करण के लिए SSGCID जीन करने वाली संरचना मार्ग का अवलोकन.

सामग्री "के लिए: रखने together.within पृष्ठ =" हमेशा "> चित्रा 2
चित्रा 2. संरेखण दर्शक और प्रोटीन जीन संगीतकार सॉफ्टवेयर में डिजाइन मॉड्यूल निर्माण. एमिनो एसिड आधार हरे (मध्य खिड़की) और वैकल्पिक निर्माणों की संरचना निर्देशित truncations सोना नीचे (विंडो) में दिखाया जाता है में दिखाया गया है लक्ष्य का निर्माण. कई फ्लू वायरल PB2 दृश्यों का एक संरेखण अनुक्रम और माध्यमिक संरचना तत्वों की तुलना में दिखाया गया है PDBID 3CW4 से सी टर्मिनल डोमेन की. डोमेन संरचना और माध्यमिक संरचना तत्वों का ज्ञान एन टर्मिनल truncations वांछित अमीनो एसिड अवशेषों पर राइट क्लिक करके जीन संगीतकार डिजाइन मॉड्यूल के भीतर से चुना जा सकता है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .


चित्रा 3a. पाइप क्लोनिंग कृत्रिम जीन डालने (नारंगी) आगे बनाया गया (लाल, नारंगी लाइनें) और उत्पन्न करने के लिए रिवर्स (नारंगी नीले लाइनों) प्राइमरों पीसीआर सामग्री डालने से परिलक्षित होता है जिसमें यह साफ है. अभिव्यक्ति वेक्टर रिवर्स (लाल काले लाइनों से परिलक्षित होता है ) और आगे (नीली काली लाइनें) प्राइमरों वेक्टर पीसीआर सामग्री उत्पन्न करने के लिए. टर्मिनल दृश्यों iPCR उत्पादों vPCR उत्पादों (iPCR के लाल iPCR की vPCR और नीले vPCR के नीले पूरक के लाल पूरक) के टर्मिनल दृश्यों के पूरक हैं. इस iPCR और vPCR उत्पादों मेजबान BL21 (DE3) रासायनिक सक्षम ई. में परिवर्तन पर दोहराया जाता है कि plasmids के लिए फार्म का पानी रखना करने की अनुमति देता है कोलाई कोशिकाओं.

चित्रा 3b
चित्रा 3b. IPCR उत्पादन की agarose जेल विश्लेषण सफल iPCR उत्पादों मजबूत बैंड द्वारा प्रतिनिधित्व कर रहे हैं, जबकि PB2 सबयूनिट से टीएस. iPCR विफलताओं, बेहोश या मैला बैंड के रूप में देखा जा सकता है. iPCR उत्पाद की गुणवत्ता आम तौर पर क्लोनिंग सफलता के साथ सहसंबद्ध किया जा सकता है. आण्विक वजन मार्करों kiloDaltons में हैं. चित्रा रेमंड एट अल., 2011 12 से reproduced है.

चित्रा 4
4 चित्रा. लक्ष्य का जीन इंजीनियरिंग कदम PB2 प्रोटीन जीन संगीतकार सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया. इंजीनियर न्यूक्लिक एसिड अनुक्रम प्रत्येक लक्ष्य के लिए स्थापित किया गया था, के बाद 6-7 वैकल्पिक प्रोटीन निर्माणों प्रत्येक के लिए डिजाइन किए गए थे. जीन डिजाइन और क्लोनिंग के प्रारंभिक चरणों में मल्टी लक्ष्य समानांतर प्रसंस्करण ई. में घुलनशील प्रोटीन का उत्पादन किया है कि व्यवहार्य लक्ष्य थे 14, जिनमें से 34 निर्माणों में हुई कोलाई.

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चित्रा 5. मजबूत प्रोटीन अभिव्यक्ति (25.76 केडीए की उम्मीद आकार), (लेन 7) eluted प्रोटीन से 6x उनका-श्रीमती टैग की दरार लगभग 50% घुलनशील (4 लेन) और 50% के बारे में दिखा बड़े पैमाने किण्वन के प्रतिनिधि एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण.

चित्रा 6
6 चित्रा. पोलीमर्स PB2 सबयूनिट के तीन निर्माणों के लिए एसडीएस पृष्ठ परिणामों लेन 1, आणविक वजन मार्कर (केडीए में बाईं तरफ लेबल);. गलियों 2, 6, और 10, निकेल 1 स्तंभ से जमा प्रोटीन, गलियों 3, 7, और 11, निकेल 2 से बफर में cleaved है प्रोटीन के प्रवाह के माध्यम से, गलियों 4, 8, और 12, निकेल 2 से बफर बी में 6x उनका-श्रीमती टैग को हटाने.

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चित्रा 7. बैठे ड्रॉप विधि द्वारा वाष्प प्रसार का एक योजनाबद्ध. प्रोटीन crystallization के लिए बैठे ड्रॉप विधि वाष्प प्रसार की श्रेणी में आता है. इस विधि प्रोटीन और एक उच्च एकाग्रता में इसी तरह की स्थिति से युक्त एक बड़ा जलाशय के साथ संतुलित करने के लिए तेज़ की एक शुद्ध नमूना जरूरत पर जोर देता. पानी प्रोटीन नमूना और तबादलों से जलाशय को वाष्पीकृत के रूप में, तेज़ एकाग्रता प्रोटीन crystallization के लिए एक इष्टतम स्तर तक बढ़ जाती है.

8 चित्रा
चित्रा 8. इन्फ्लूएंजा वायरस के एक तनाव से पोलीमर्स PB2 सबयूनिट के प्रोटीन क्रिस्टल.

9 चित्रा
9 चित्रा. एक से पोलीमर्स PB2 सबयूनिट की एक्स - रे विवर्तन छविइन्फ्लूएंजा वायरस का तनाव.

चित्रा 10
10 चित्रा. 4 PB2 संरचनाओं के crystallographic असममित इकाई में अणुओं का रिबन चित्र. इसी पी डी बी कोड के साथ इंद्रधनुष पैटर्न में रंगीन माध्यमिक संरचनाओं. (एक) 3K2V (A/Yokohama/2017/2003/H3N2) (ख) 3KHW (ए / मेक्सिको / InDRE4487/2009/H1N1) (ग) 3KC6 (A/Vietnam/1203/2004/H5N1) (डी) 3L56 (A/Vietnam/1203/2004/H5N1).

चित्रा 11
11 चित्रा. वर्णित विधि द्वारा इन्फ्लूएंजा PB2 लक्ष्यों के लिए परिणाम विश्लेषण. स्ट्रक्चरलई दृढ़ संकल्प पाइपलाइन पांच चरणों में सचित्र है: क्लोनिंग, विलेयता, शुद्धि, क्रिस्टलीकरण और संरचना निर्धारण.

Discussion

मल्टी लक्ष्य समांतर प्रोसेसिंग

संरचना के आधार पर दवा डिजाइन दवाओं की खोज में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. SSGCID NIAID श्रेणी एसी रोगजनकों से तीन आयाम प्रोटीन संरचनाओं के साथ वैज्ञानिक समुदाय प्रदान करने के लिए समर्पित है. व्यापक रूप से उपलब्ध इस तरह के संरचनात्मक जानकारी बनाने अंततः संरचना के आधार पर दवा डिजाइन में तेजी लाने के लिए काम करेगा.

MTPP दृष्टिकोण का पहला महत्वपूर्ण कदम निर्माण डिजाइन है. प्रत्येक लक्ष्य प्रोटीन के कई निर्माणों सफल संरचना दृढ़ संकल्प और बढ़ जाती है बदलाव की संभावना बढ़ जाती है. यह कुछ प्रोटीन निर्माणों पाइपलाइन के चरणों के दौरान विफल हो जाएगा कि अपरिहार्य है. पाइप क्लोनिंग विधि को लागू श्रम गहन शुद्धि चरणों के बिना 96 अच्छी तरह प्रारूप में कई निर्माणों की पीढ़ी की अनुमति देकर MTPP विधि का समर्थन करता है. वही 96 अच्छी तरह प्रारूप (कैलिपर लैब में प्रोटीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने की क्षमता के साथ पाइप क्लोनिंग बाँधनाचिप 90) आगे समग्र प्रवाह expedites. इन तरीकों की जोड़ी बड़े पैमाने पर प्रोटीन के उत्पादन और शोधन की सफलता सुनिश्चित करता है जो घुलनशील प्रोटीन का उत्पादन करने वाले निर्माणों की जल्दी पहचान के लिए अनुमति देता है.

MTPP उच्च throughput की सफलता के लिए एक अनिवार्य पहलू प्रोटीन निर्माता (अमेरिकी पेटेंट नंबर 6818060, पन्ना बायो) साधन है. प्रोटीन निर्माता उच्च throughput प्रोटीन के उत्पादन और संबंधित संरचनात्मक जीनोमिक पाइपलाइन अनुसंधान आवेदनों की दक्षता को बढ़ावा देने के लिए विशेष रूप से विकसित एक 24 चैनल समानांतर तरल क्रोमैटोग्राफी प्रणाली है. प्रोटीन बनाने के लिए पहले से वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करना, लाभ एक भी लाइन FPLC प्रणाली की तुलना में स्पष्ट कर रहे हैं. एक भी व्यक्ति को एक आठ घंटे की अवधि के भीतर समानांतर में 48 ठिकानों पर निर्भर शुद्ध कर सकते हैं. इसके विपरीत, एक भी लाइन FPLC प्रणाली का उपयोग करते हुए एक भी व्यक्ति को केवल एक ही समय सीमा के भीतर चार लक्ष्यों की एक अधिकतम शुद्ध कर सकते हैं. प्रत्येक लक्ष्य के लिए शुद्धता के उच्च स्तर परसंरचना के विश्लेषण के लिए बढ़ती प्रोटीन क्रिस्टल के बाद सफलता में एक महत्वपूर्ण कारक हैं प्रोटीन निर्माता के साथ हासिल की.

सीमाओं और निवारण

एक्स - रे क्रिस्टलोग्राफी द्वारा तीन आयामी संरचना को सुलझाने घुलनशील लक्ष्य प्रोटीन की बड़ी मात्रा में प्राप्त करने की अक्षमता है, जिनमें से एक में कई चुनौतियों के साथ एक बहु मंचन प्रयास है. घुलनशीलता समस्या को दूर करने के लिए लागू किया जा सकता है कि एक रणनीति ई. के रूप में एक विकल्प अभिव्यक्ति मेजबान का इस्तेमाल होता है कोली की कोशिकाओं को कई महत्वपूर्ण यूकेरियोटिक बाद translational संशोधनों प्रदर्शन करने में असमर्थ हैं. इन बाद translational संशोधनों प्रदर्शन करने में सक्षम हैं कि विभिन्न खमीर में अभिव्यक्ति, कीट और स्तनधारी सेल लाइनों अक्सर एक उपयुक्त विकल्प हैं. लक्ष्य प्रोटीन कभी कभी व्यक्त लेकिन मानक सेल की स्थिति में पूरी तरह से अघुलनशील रहे हैं. प्रोटीन निर्माता वैकल्पिक सेल की स्थिति के तेजी से परीक्षण के लिए एक मूल्यवान संसाधन हो सकते हैंके रूप में स्मिथ एट अल में वर्णित है. 2011 13. इस रणनीति अक्सर लक्ष्यों को पाइप लाइन के माध्यम से आगे बढ़ रखने के लिए आवश्यक है. किसी भी संरचनात्मक जीनोमिक्स पाइप लाइन में, मानकीकृत प्रोटोकॉल पाइपलाइन और लक्ष्य व्यक्तिगत अनुकूलन आवश्यकता हो सकती है के माध्यम से आता है कि हर लक्ष्य के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता. उदाहरण के लिए, हम हर cryoprotectant के लिए 20% इथाइलीन ग्लाइकॉल उपयोग करने के लिए चुना है. इस हालत के लिए उपयुक्त नहीं है कि मामलों में, विकल्प cryoprotectants या सांद्रता का परीक्षण करने की आवश्यकता हो सकती है.

प्रत्येक व्यक्ति प्रोटीन लक्ष्य के अद्वितीय प्रकृति के कारण, दर सीमित और एक संरचना का पता लगाने में अप्रत्याशित कदम crystallization है. प्रारंभिक विरल मैट्रिक्स स्क्रीन से अनुकूलन के साथ प्रोटीन क्रिस्टलीकरण की MTPP पाइपलाइन ऑफसेट आमतौर पर कम सफलता दर. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध विरल मैट्रिक्स स्क्रीन से मारा प्रत्येक प्रारंभिक क्रिस्टल आगे एक ई स्क्रीन बिल्डर (पन्ना जैव) के साथ अनुकूलित है. अनुकूलन स्क्रीन गिरफ्तारी बनाया गया हैबफ़र्स, लवण, और additives की सांद्रता में फेरबदल, प्रारंभिक क्रिस्टल हिट की हालत ound. सफल अनुकूलन स्क्रीन विवर्तन पढ़ाई और संरचना के निर्धारण के लिए उपयुक्त क्रिस्टल उपज.

एलर्जी और संक्रामक रोग के राष्ट्रीय संस्थान (NIAID) के आगे रख दिया संरचनात्मक जीनोमिक्स कार्यक्रम पन्ना जैव और एक साथ SSGCID (पन्ना बायो, SeattleBiomed, वाशिंगटन विश्वविद्यालय और प्रशांत नॉर्थवेस्ट राष्ट्रीय प्रयोगशाला) कर रहे हैं जो तीन अन्य उत्तर पश्चिमी प्रशांत संस्थानों को आर्थिक सहायता प्रदान करता है . संघ के प्रत्येक सदस्य NIAID संरचनात्मक जीनोमिक्स कार्यक्रम के लक्ष्यों को पूरा करने के लिए आवश्यक राज्य के अत्याधुनिक प्रौद्योगिकियों को लागू करने में अपनी विशेषज्ञता के लिए चुना गया था. तिथि करने के लिए, SSGCID दुनिया में सातवें सबसे बड़ा योगदानकर्ता के रूप में पी डी बी रैंकिंग इसे में 461 संरचनाओं जमा किया गया है, और 2011 में, सबसे अधिक उत्पादक. SSGCID के प्रोटोकॉल और तरीकों को लाभ के इरादे से प्रदान की जाती हैंवैज्ञानिक समुदाय और संक्रामक रोगों के अनुसंधान को बनाए रखने.

Disclosures

लेखकों पन्ना जैव, Inc के कर्मचारी हैं

Acknowledgments

लेखकों SSGCID संघ के सभी सदस्यों को धन्यवाद देना चाहूंगा. SSGCID के लक्ष्यों की उपलब्धि पन्ना बायो में सभी दल के सदस्यों के भारी प्रयासों के द्वारा ही संभव बनाया है. इस शोध एलर्जी और संक्रामक रोगों, स्वास्थ्य और स्वास्थ्य और मानव सेवा विभाग के राष्ट्रीय संस्थानों के राष्ट्रीय संस्थान से संघीय अनुबंध नहीं HHSN272200700057C तहत वित्त पोषित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Primers IDT
Genes DNA 2.0
TE buffer Qiagen provided in kit
96-well half skirt PCR plates VWR 10011-248
PFU Master Mix
6X Orange Loading Dye Fermentas R0631
10X TAE Teknova T0280
Agarose Sigma-Aldrich A9414-10G
pET28 vector
2-YT Broth VWR 101446-848
Kanamycin Teknova K2151
Restriction Enzymes Fermentas
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704
Top 10 chemically comp cells Invitrogen C4040-06
Disposable Troughs (Sterile, 25 ml) VWR 89094-662
Airpore covers (Rayon films for bio cultures) VWR 60941-086
24-well blocks VWR 13503-188
QIAvac 96 Qiagen 19504
BL21(DE3) cells chemcomp (phageR) NEB C2527H
50% Glycerol VWR 100217-622
TB Media Teknova T7060
IPTG Sigma-Aldrich
1 M Tris pH 8.0 Mediatech 46-031-CM
5 M NaCl Teknova S0251
Glycerol Aldrich G7893-4L
CHAPS JT Baker 4145-01
Imidazole Sigma 56749-1KG
TCEP Amresco K831-10G
L-arginine Amresco 0877-500G
Benzonase EMD 70746-3
Lysozyme USB 1864525GM
10 kDa MWCO dialysis tubing Thermo 68100
Amicon Ultra 10 ka MWCO concentrators Millipore UFC901024
HisTrap FF columns GE 17-5255-01
HiTrap Chelating columns GE 17/0408-01
Compact Jr crystallization plates Emerald Bio EBS-XJR
Crystalization screens Emerald Bio
Ethylene Glycol 100% Emerald Bio EBS-250-EGLY
Crystal Wand Magnetic Straight Hampton Research HR4-729
Mounted CryoLoop 0.1-0.2 mm Hampton Research HR4-955
ALS style puck
Puck Wand
Bent Tongs
Puck Pusher

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References

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इन्फ्लुएंजा पोलीमरेज़ के जीन से संरचना निर्धारण PB2 सबयूनिट के लिए मल्टी लक्ष्य समांतर प्रोसेसिंग दृष्टिकोण
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Armour, B. L., Barnes, S. R., Moen,More

Armour, B. L., Barnes, S. R., Moen, S. O., Smith, E., Raymond, A. C., Fairman, J. W., Stewart, L. J., Staker, B. L., Begley, D. W., Edwards, T. E., Lorimer, D. D. Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit. J. Vis. Exp. (76), e4225, doi:10.3791/4225 (2013).

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