Grip Polimeraz Gen-to-yapı belirlenmesi PB2 alt birimi için çoklu hedef Paralel İşleme Yaklaşımı

Summary

Yapı-esaslı ecza tasarımı ilaç gelişmesinde önemli bir rol oynar. Paralel olarak birden çok hedef edinerek büyük ölçüde kurşun keşfi için başarı şansını artırır. Aşağıdaki makale Enfeksiyon Hastalıkları için Seattle Yapısal Genomik Merkezi PB2 influenza A alt birimi gen-için-yapı tayini için bir çoklu hedef yaklaşım kullanır nasıl vurgulamaktadır.

Abstract

Son derece öldürücü grip suşları pandemik salgın dünya çapında insan popülasyonlarında yaygın morbidite ve mortaliteye neden olabilir. Amerika Birleşik Devletleri tek başına, 41.400 ölüm ve 1,86 milyon hastaneye yatış ortalama her yıl ¹ grip virüsü enfeksiyonu neden olur. Polimeraz temel protein 2 alt biriminin (PB2) içindeki nokta mutasyonlar, insan ^2, viral enfeksiyonun, uyum ile bağlantılı olmuştur. Bu çalışmalardan elde edilen bulgular böylece antiviral ilaç hedef olarak potansiyel vurgulayarak, bir virulans faktörü olarak PB2 biyolojik önemi ortaya koymuştur.

Alerji ve Enfeksiyon Hastalıkları Ulusal Enstitüsü (NIAID) tarafından verilen yapısal genomik programı Emerald Bio ve birlikte Enfeksiyon Hastalıkları (SSGCID) için Seattle Yapısal Genomik Merkezi oluşturan üç Kuzeybatı Pasifik kurumlara fon sağlar. SSGCID thre ile bilimsel topluluk sağlamaya adamıştırNIAID kategorisi AC patojenlerin E-boyutlu protein yapıları. Bilimsel topluluk için kullanılabilir yapısal bilgi alma yapısı tabanlı ilaç tasarımı hızlandırmak için hizmet vermektedir.

Yapı-esaslı ecza tasarımı ilaç gelişmesinde önemli bir rol oynar. Paralel olarak birden çok hedef edinerek büyük bir yol ya da bütün bir protein ailesi hedefleyerek yeni kurşun keşif için başarı şansını artırır. Emerald Bio konsorsiyum destek gen-için-yapı tayini için yüksek verimli, çoklu hedef paralel işlem boru hattı (MTPP) geliştirmiştir. Burada dört farklı influenza A suşları PB2 alt birimi yapısını belirlemek için kullanılan protokolleri tarif.

Protocol

Protokolünün bir genel görünüşü Şekil 1'de gösterilmiştir.

Moleküler Biyoloji

1. Tasarım Construct

Protein yapı ve kodon tasarlanmış sentetik gen dizileri tasarım Gen Composer yazılımı kullanın. Gen Besteci yazılım kullanımı başka bir yerde ³ detaylı olarak sunulmuştur.

1. Hizalama Görüntüleyici Modülü kullanın ve protein dizi hizalamalarını karşılaştırmak ve protein yapı tanımlamak için Tasarım Modülü oluşturun. , Varsa (Şekil 2) Protein Data Bank (PDB) içinde homologları, birincil ve 3D yapı elemanları hem de bir hedef amino asit dizisi hizalama.
2. Birincil yapısının korunması ve homologları 3D yapıları dayalı yeni Termini seçerek yapısı güdümlü yapı tasarımlar yapmak için hizalama bilgileri kullanın.
3. Tasarım eklemek PCR (IPCR) ve vektör PCR (vPCR) amplimers (Terminal astar).
4. Gen C kullanarakomposer protein-to-DNA algoritması kodon tasarlanmış bir nükleik asit dizisi içinde, yapının amino asit dizisini geri çevirmek.
5. E. ifade için sırasını optimize etmek için uygun kodon kullanım tablosu (CUT) kullanın coli.
6. Hemen hemen kolayca saflaştırılmasını sağlar bunun bir N-terminali 6x histidin takısı ve Smt3/SUMO füzyon proteini dahil etmek üzere modifiye pET28 vektörü içine uç klonu.
7. DNA 2.0 ve Entegre DNA Technologies için astar ile sentetik gen siparişinizi verin.

2. Polimeraz Eksik Primer Uzatma (BORU) Klon

1. Astarlar ve Genler hazırlayın
   1. 1 dakika 1.000 rpm'de astar içeren satıcı tarafından sağlanan plakaları santrifüj.
   2. Astar konsantrasyonu 100 mcM getirin ve 50 ul TE tampon ekleyin.
   3. Bir 96-bölmeli V-dipli bir levha üzerinde deiyonize (Dİ) su ile 10 uM primerler ile seyreltilir.
   4. 1 dakika 1.300 rpm'de 1.5 ml tüp satıcı tarafından sağlanan gen santrifüj.
   5. 1.5 ml tüpler içinde, her bir primer seyreltileri 10 ng / ul yapmak.
   6. Kullanılmadığı zaman -20 ° C'de saklayın astar ve genler.
2. Ekle PCR (IPCR) hazırlayın
   1. Buz üzerinde Pfu Master Mix bir şişe çözülme; oda sıcaklığında genler ve astar tutun.
   2. Astar bir dizi bir tabak haritası atama kuyu oluşturun ve inşa.
   3. Bir 96-PCR plakanın her oyuğuna DI su ile 13 ul ekle.
   4. Her bir uçlarına arasında değiştirmek için sağlanması, plaka haritaya göre 96 oyuklu plaka içindeki her bir reaksiyon için ileriye 5 ul ve ters primer 5 ul ekleyin.
   5. De plaka haritasına göre kendine uygun her tam uzunlukta gen 2 ul ekleyin.
   6. Her iyi arasında ipuçları değiştirmek için sağlanması, her bir kuyunun Pfu ana karışımı 25 ul ekleyin.
   7. Aşağıdaki PCR koşulları kullanılarak reaksiyon döngüsü:
      1. 95 ° C'de 2 dakika 95 ° C de 30 sn
      2. 50 ° C 45 sn
      3. 68 ° C 3 dk
      4. 4 ° C ∞
   8. 25 döngü için adımları bd tekrarlayın.
   9. Yeni 96-PCR plaka her IPCR reaksiyon 10 ul aktarın.
   10. Her bir örnek için 6X yük boya 3 ul ekle.
   11. Parçacık amplifikasyonu onaylamak için 100-500 baz puan DNA merdiveni yanında 110 V% 1 TAE EtBr agaroz jel üzerinde her örnek ayırın.
   12. -20 ° C'de saklayın IPCR ürün kullanılmadığı zaman (donma çözülme mümkün olduğu kadar kaçının).

3. Vektör PCR (vPCR) hazırlayın

1. Dönüşüm E. gecede kültür Başlangıç plazmid pET28 vektörü ile coli.
   1. 50 ug / ml kanamisin ile 2-YT brot iki 5 ml tüpler inoküle.
   2. 220 devirde 37 gecede kültürler ° çalkalayıcı C büyütün.
2. 15 dakika 3.000 rpm'de santrifüj gece büyüme sonra kültürler aşağı doğru döndürün.
3. QIA, bir Qiagen kullanınhazırlık Spin Miniprep Kit üreticinin talimatlarına göre bakteriyel pelet pET28 vektör ayıklayın.
4. Kurulum sınırlama enzimi sindirim pET28 plazmid ekstre edilmiştir.
   1. PET28 vektörü, 20 ul 10X tampon BamHI 2.2 ul ve BamHI ve Hindlll 1 ul ekle.
   2. 37 ° C'de 1 saat boyunca reaksiyon inkübe ° C.
5. Bir jel üzerinde ayrı bir sindirim ürünü.
   1. 2.2.10 adıma bakın.
   2. Vektör bandı jelden kesilmiş ve imalatçının talimatlarına göre QIAquick jel ekstre etme kiti kullanılarak arındırmak.
6. Bir NanoDrop kullanarak, DNA konsantrasyonu ölçmek.
7. 10 ng / ul vektör kesim sulandırmak. -20 ° C kullanılmadığı zaman mağaza.
8. VPCR astar hazırlayın.
   1. 1.300 rpm'de 1 dakika IDT verilen oligonucliotides santrifüj.
   2. DI su ile 100 uM konsantrasyonda getirin.
   3. 1.5 ml tüp hem ileri ve geri primerleri 10 mcM seyreltme hazırlayın.
   4. -20 ° C'de saklayın astar ve astar dilüsyonları
9. Oda sıcaklığında buz ve çözülme şablon ve astar üzerinde Pfu Master Mix çözülme.
10. Bir 96-PCR plaka Kurulum vPCR reaksiyonlar:
    1. Bir 96-plaka ilk satırda ileri ve geri vPCR astar hem de 60 ul ve sindirilmiş pET28 şablonu (ul / 10 ng) 24 ul birleştirir.
    2. 12-ucu çok kanallı pipet kullanarak, her plakanın iyi kalan 12 astar ul ve şablon ana karışımı aktarın. Bu primer ve plaka her bir şablon ana karışımı 12 ul ile sonuçlanmalıdır.
    3. Her bir kuyunun DI su 13 ul ekleyin.
    4. Her bir kuyunun Pfu Master Mix 25 ul ekleyin.
11. Adım 2.2.7 kullanılan PCR koşulları arasında geçiş reaksiyonlar.
12. Havuz 15 ml Falcon tüp içine vPCR reaksiyonların tüm.
13. (Sindirilmiş pET28 vektörü beklenen uzunluğu bir jel üzerinde toplanmış PCR ürünü, 10 ul ayırarak parçacık amplifikasyonu doğrulamayaklaşık 6 kb) 'dir.
    1. 2.2.10 adıma bakın.
14. Plakaları birleştirme hazırlayın.
    1. Bir 96-bölmeli V-dipli plakanın her oyuğuna vPCR ürünün kısım 3 ul.
    2. -20 Mağaza plakaları ° IPCR ürün ile birleştirme kadar C.

4. IPCR ve vPCR Ürünler Birleştirme

1. Çözülme IPCR ürün ve ön aliquoted vPCR 96-oda sıcaklığında plaka birleştirme.
2. Birleştirme plaka ile ilgili de her IPCR ürünün 3 ul ekleyin.
3. Top Ten kimyasal yetkili hücrelerine plaka birleştirme Transform.
4. Satıcı tarafından sağlanan kimyasal yetkili bir hücre tek 50 ul tüpüne her birleştirme reaksiyon 2 ul ekleyin ve üreticinin verilen protokol ile devam edin.
5. Dönüşüm plağı üzerindeki her bir yapı için bir gecede kültür hazırlayın.
6. Derin bir kuyudan bloğun her kuyuya, 25 ml'lik steril bir hazneden kısım 5 mL TB suyu (50 ug / ml kanamisin ile birlikte).
7. Steri kullanarakle tekniği, her dönüşüm plaka bir izole edilmiş bir koloni almak ve derin kuyu bloğunun uygun iyi aşılamak.
8. Bir AIRPORE kapaklı blok örtün.
9. 37 ° C de bir gece boyunca 220 rpm'de blok çalkalayın.
10. 4,000 rpm'de 30 dakika boyunca santrifüj ile pelet blok hücreleri.
11. Süpernatantı dökün ve bir kağıt havluyla blok üst pat.
12. Mini hazırlık üreticinin talimatlarına göre bir Qiagen 96 oyuklu vakum aygıtı kullanılarak.

5. Başarıyla Klonlanmış Yapılar bir Gliserin Hisse Senedi hazırlanması

1. Başarılı bir şekilde, üretici talimatlarına göre BL21 (DE3) 'kimyasal olarak yeterli hücrelerini içerisine klonlanmış DNA sekansı doğrulanır dönüşümü.
2. Her bir yapı için, 2-YT brot 1 ml (50 ug / ml kanamisin ile) içine BL21 (DE3) dönüştürme ve inokülasyon tek izole edilen bir koloninin al.
3. 37 3-4 saat 220 rpm'de kültürler sallamak ° C
4. 1.5 ml etiketeşsiz yapı kimlik numarası, cep gerginlik ve tarih ile kap tüp vida. % 50 gliserol, 500 ul ve hücre kültür, 500 ul ekle ve birkaç kez ters çevirin. Hemen kuru buz veya -80 ° C derin dondurucuda gliserol stok saklayın.

6. İfade Test

Lizis Buffe r	Yıkama tamponu	Seyreltme Tampon
, 50 mM NaH 2 PO 4, pH 8.0 ' 300 mM NaCI 10 mM imidazol % 1 Tween 20 2 mM MgCl2 0.1 ml / ml Benzonase 1 mg / ml lizozim	, 50 mM NaH 2 PO 4, pH 8.0 ' 300 mM NaCI 20 mM imidazol % 0.05 Tween 20	25 mM Tris, pH 8.0 300 mM NaCI 250 mM imidazol % 0.05 Tween 20

* Ekle Benzonase, lizozim,hemen önce parçalama ve proteaz inhibitörü kullanılmasını içerir.

1. Çizgi bir kanamisin seçici agara gliserol stoktan örnek ve 37 gece boyunca inkübe ° C
2. Bir taze yetiştirilen E ile% 0.5 glukoz ile desteklenmiş 1.2 mi inoküle TBC suyu (50 mg / ml kanamisin ile birlikte), bir 96 oyuklu tabanı yuvarlak bir blok olmayan bir indükleyici ön-kültürün Başlangıç coli izole. Gece 37 ° C'de 220 rpm'de sallayarak büyümek
3. Gece boyunca büyüme sonrası, Novagen Gecelik Hızlı Sistem 1 (üreticinin protokolüne göre) ön-kültürün 40 ul ile takviye TBC suyu, 1,2 ml (50 mg / ml kanamisin ile) inoküle indüksiyon kültürleri başlar.
4. 220 rpm sallayarak, 48 saat 20 ° C de küçük ölçekli indüksiyon kültürler büyütün.
5. 15 dakika için 4000 rpm'de santrifüj Hasat hücreleri, önceden işlem için en az 1 saat boyunca -20 ° C'de süpernatan ve mağaza ° C dökün.
6. 96 oyuklu bloğunda, 300 ul lizis tamponu içinde tekrar süspansiyon hücre topakları. Kuvvetli bir şekilde oda sıcaklığında 30 dakika boyunca çalkalayarak mekanik lizisi ve ardından 30 dakika boyunca oda sıcaklığında lizis tamponu içinde inkübe hücreleri.
7. 4 ° C'de 4,000 rpm'de 30 dakika için santrifüjleme ile ham lizat açıklamak
8. Bir 96-gözenekli düz tabanlı tepsi (Qiagen) ile açıklık lizat (çözünebilir fraksiyon) 200 ul transfer etmek için çok kanallı bir pipet kullanın. Iyi bir örneği içeren her biri için, 40 ul birleştirilen Ni-NTA manyetik boncuk (Qiagen) ekleyin.
9. Yavaşça 16 ° C de 1 saat boyunca bir rocker plaka ajitasyon
10. Bir manyetik sonrası plakası (Qiagen) üzerinde plaka yerleştirin ve ilişkisiz çözünür fraksiyon çıkarın. Ni-NTA boncuk herhangi birini pipetle değil dikkat edin.
11. Sonrası plaka plaka çıkarın ve yavaşça 200 ul yıkama tamponu ile boncuk yeniden süspansiyona alınmıştır. Pipet ve aşağı yukarı 30 saniye sonra sonrası plaka geri plaka yerleştirin.
12. Yıkama tamponu çıkarın ve adım 6.12 tekrarlayın.
13. Yazılan plaka plaka çıkarın ve Ni-NTA ta bağlı Zehir5 dakika boyunca 50 ul yıkama tamponu ile yıkanarak rget proteini.
14. Manyetik sonrası plakasına düz tabanlı plaka dönmek ve yeni bir 96-bölmeli V-dipli plaka elüsyon aktarın.
15. Yeni bir 96-bölmeli V-dipli plakasına elüsyonun 20 ul aktarın ve 1 ul ULP1 proteaz ile reaksiyona girerler.
16. Üreticinin protokole göre, bir LabChip 90 kullanarak kılcal elektroforez ile yıkandı ve yıkandı + Ulp1 kısmını analiz.
17. Alternatif olarak, ifade test tüm fraksiyonlar SDS-PAGE ile analiz edilebilir.

7. Büyük Ölçekli Fermantasyon

1. Bir gliserol stoktan bir sıyrık elde etmek için steril bir pipet kullanın, 100 ml TB suyu (50 mg / ml kanamisin ile) aşılamak ve gece büyür. 220 rpm ve 37 ° C de sallamak
2. Gece boyunca büyüme sonrası, 10 ml 2 L'lik bir şişe içerisinde şaşkın Merck autoinduction çözümleri (üreticinin protokolü bakınız), (50 mg / ml kanamisin ile) TBC suyu 1 L aşılayarak ön-kültürün genişletmekön-kültürün (1:100 seyreltme).
3. 37 genişletilmiş 1 L kültürler çalkalayın ° C; 20 sallayarak inkübatör sıcaklığı değiştirmek ° C 0,6 (OD ₆₀₀₎ bir optik yoğunluk ulaşıldığında.
4. Gece büyüme sonra, ifade test için her yapı bir temsilci 10 ml kısım almak.
5. Hasat hücre 15 dakika için 5000 rpm'de santrifüjleme ile yapıştırma ve supernatant atın.
6. -80 Yapıştırın Freeze hücre ° C

PROTEİN ARITMA

Tamponlar:

Lizis Tampon	A (Dengeleme) Tampon	Tampon B (elüsyon)	Sütun Tampon boyutlandırma
25 mM Tris, pH 8.0 200 mM NaCI % 0.5 gliserol % 0.02 CHAPS 10 mM imidazol 1 mM TCEP 50 mM arginin 5 ul Benzonase 100 mg Lizozim 3 Proteaz İnhibitör Tablet (EDTA-ücretsiz)	25 mM Tris, pH 8.0 200 mM NaCI 10 mM imidazol 1 mM TCEP 50 mM arginin % 0.25 gliserol	25 mM Tris, pH 8.0 200 mM NaCI 200 mM imidazol 1 mM TCEP	25 mM Tris, pH 8.0 200 mM NaCI % 1 gliserol 1 mM TCEP

* Hemen lizis önce her 150 ml'lik bir numune için Benzonase, lizozim ve proteaz inhibitörü tablet ekleyin.

8. Hücre Lizis

1. Lizis tamponu, 2 L yapmak, lizozim, proteaz inhibitörü tablet ya da Benzonase (her bir numune lizis tamponu 150 ml ayrı lize edilecektir) ekleyin.
2. Çözülme ve tekrar süspansiyon hücre 1:5 kitlesel lizis tamponu içinde yapıştırın: hacim oranında kuvvetli bir şekilde 4, 30 dakika boyunca karıştırma ° C. Temiz bir spatula ile beher taraftan gevşek parçalar kırın. Bu dönemde Ni ve Dialy hazırlamaksis Tamponlar
3. Buz üzerinde, bir Misonix sonikatör (3 dakika 70% güç, 2 saniye / 1 sn kapalı bakliyat) ve aşırı ısınmayı önlemek için yavaşça girdap konteyner kullanarak hücrelerin lyse. Gelecek analizi için ham lizat küçük (200 ul) kısım kaydedin.
4. , 4 35 dakika boyunca 18,000 x g'de santrifüj ile ham lizat ° C açıklamak süpernatan toplamak ve gelecekteki analiz için bir küçük (200 ul) kısım kaydedin. Mağaza pelet 4 ° C de, proteinin çözünür fraksiyonu içine lize edilmiştir teyit kadar.

9. Ön tarafından işletilen Protein Maker Kurulum

1. Protein yapımcısı açık ve yazılım açıkken, araç başlatmak.
2. Bir kez başlatılır, örneklerin her biri için portal ayrı bir satırda bir 5.0 ml GE Healthcare HisTrap FF Nikel-şelat sütun (Ni sütun) ekleyin.
3. Her bir sütun üzerinden dengeleme tamponu 3-4 kolon hacmi (CV) çalıştırın.
4. Dengeleme ve elüsyon tampon hatları hazırlamak.
5. Equilibrbir kez tampon A kolonu boyunca aspire edilerek sütun yedi.

10. Nikel 1 (NI1) Kolon

1. Depolama tamponu çıkarmak için 20 ml Milli-Q su ile her bir sütun yıkayın. 5 ml tampon B ve dengeleme boyunca 25 ml tampon maddesi A çalıştırın.
2. 2 ml / dakika arasında bir oranda sütunlar halinde çözünür protein ihtiva açıklık lizat yük, daha sonra tampon A ile birlikte, 15 ml yıkama takip
3. Tamponlara sahip bir basamaklı bir derece olarak bağlı protein elute saygılı aşağıdaki oranlara göre A ve B: 5 ml 95:5, 5 ml 60:40, 10 ml 0:100. Ayrı ayrı her elüsyon fraksiyonu toplamak.
4. Analiz: SDS-PAGE ile yıkandı, kesirler, ham lizat, açıklık lizat ve akış yoluyla. Havuz fraksiyonları da protein ihtiva eden ve yaklaşık olarak mevcut olan protein miktarını belirlemek için bir ₂₈₀ ölçmek için Nanodrop kullanın.

11. ULP1 Dilinim

1. Sonraki jel analizi için NI1 sütun havuz küçük bir kısım (250 ul) tutun. Geri kalanı getir10 ml ve His-Smt çekim etiketi kaldırmak için toplam protein 1 ul / 5 mg ubikuitin benzeri proteaz 1 (ULP1) eklemek için NI1 havuzu.
2. 4 ° C de bir karıştırma plakası üzerinde 10 kDa'lık bir molekül ağırlığı kesme (MWCO) içinde 4 ° C'de 4 saat boyunca tampon A 2 L karşı NI1 havuzu + ULP1 Dialyze
3. Diyaliz sonrası NI1 havuzu ve NI1 havuzu + ULP1 ULP1 bölünme başarılı olup olmadığını belirlemek için SDS-PAGE çalıştırın.

12. Nikel 2 (Ni2) Kolon

1. Aynı Ni kolonundan yarılan protein yükü ve 1 ml / dak 'lık bir düşük akış hızında adım 9.3 tekrarlayın. Bölünmüş kapalı etiketi sütuna bağlamak ve etiketsiz hedef protein şimdi akış-ile olacaktır. Yeni bir kapta flow-through toplayın.
2. 3 ml tamponu ile Ni sütun yıkayın A O'nun tüm etiketli ve spesifik olmayan bağlı protein Zehir için tampon B 5 ml izledi. Ayrı ayrı fraksiyonu toplayın.
3. Ni2 SDS-PAGE yıkama, içinden akan ve Ni2 elüsyon kesirler ULP1 bölünme doğrulamak için ve çalıştırmak protein akış yoluyla mevcuttur. Kabaca proteinin varlığını belirlemek için bir ₂₈₀ ölçmek için Nanodrop kullanın.

13. Konsantre

1. Ni2 akış yoluyla konsantre (ve protein varsa Ni2 elüsyon) bir Amicon Ultra 10 kDa MWCO santrifüj tüpü ile 5 ml. 4 ° C'de 4000 rpm'de 10 dakika aralıklarla Spin Zar boyunca aşırı konsantre protein önlemek için her spin arasında bir pipet ile karıştırın.

14. Boyut-dışlama Kromatografi (SEC)

1. 0.5 ml / bir AKTApurifier sistemi (GE Healthcare) üzerinde dak 'lık bir akış hızında 200 ml SEC tamponu ile dengeye bir Sephacryl S-100, 10/30 GL sütunu (GE Healthcare) ayarlayın.
2. Üreticinin talimatlarına uygun olarak SEC kolonu üzerinde kullanım için 10 ml superloops hazırlayın.
3. 5 ml şırınga kullanarak, superloops üzerine örnekler yüklemek ve SEC çalışma başlar.
4. Küçük hacimli fr toplarken, 280 nm'de UV emilimi iz Monitöreylemler.
5. SDS-PAGE ile SEC kesirler çalıştırın.
6. En yüksek yoğunluk bantları gösteren SEC kesirler havuzda.
7. Toplanmış SEC kesirler konsantre. 13.1 adıma bakın.
8. 100 ul örnekleri, -80 sıvı azot ve mağaza flaş dondurma ° C içine kısım protein

KRİSTALİZASYON

15. Protein Kristalizasyon

1. Tercih kristalizasyonu ekranın 80 ul (Emerald Biyo) ile 96-çukurlu bir kompakt Jr kristalizasyon plakasının her bir rezervuara (Emerald Biyo) önceden doldurmak.
2. 2-20 mg / buz üzerinde ml ve saklamak için tampon boyutlandırma ile protein sulandırmak.
3. 96-kuyu her birine protein ve kristalleşme ekranın 0.4 ul 0.4 ul koyun ve kristal netliğinde sızdırmazlık bandı (Manço) ile kaplayın.
4. 16 plaka Mağaza ° C bir mikroskop altında önümüzdeki birkaç hafta içinde periyodik olarak protein kristalizasyon için kontrol ederken.

16. Kristal Hasat </ P>

1. Ana likör ve etilen glikol bir dondurarak saklama koruyucusu oluşturun. Hedef protein kristal ile de kapsayan açık bant kesin. Boş bir de, karşılık gelen kristalize durumun 1.6 ul ve etilen glikol ve 0.4 ul% 20 etilen glikol ve bir nihai konsantrasyon elde edilmiştir ve% 80 durum kristalleştirilmesi ile birleştirir. Not: gliserol, yağlar, düşük MW polietilen glikoller ve / veya dondurarak saklama yüzdeleri değişen: kristal kırınım optimize etmek gibi farklı bir dondurarak saklama koruyucuları deneyin.
2. Kapaklı sıvı nitrojen ve kapak dolu bir Dewar bir ALS tarzı disk soğuma hasat önce.
3. Manyetik Kristal Wand (Hampton Research) ve çok iyi çözeltisinden doğrudan kepçe üzerinde kristal büyüklüğüne uygun iç çapa sahip bir CryoLoop yerleştirerek kristal hasat.
4. Hemen c dondurmak flaş ALS tarzı disk içinde kriyoprotektan sonra batığın içine hasat kristal ile CryoLoop daldırmaRystal. Kristallerinin istenen bir dizi için tekrarlayın.

17. Kristal Tarama / Veri Toplama

1. Bir kez hasat ALS disk üzerindeki manyetik cryo disk kapağı yerleştirmek için bir disk değnek kullanmak tamamlandı. Bükülmüş maşa ile, disk ters çevirin.
2. Bir Rigaku AKTÖR Dewar için disk transfer, disk üzerine bir Puck İtici vida ve yukarı bakacak işaretçilerine ile Dewar içinde bırakarak kapağı kapalı yumruk.
3. JDirector yazılımı kullanarak, aşağıdaki parametreleri altında ekran her kristal: 0.5 dereceye ayarlanmış ışın yarık, 50 mm ayarlı dedektör mesafesi, 70 derece görüntü adım, ve maruz kalma süresi 30 saniye olarak ayarlanır.
4. En iyi kristal ve strateji veri toplama için ne olduğunu belirlemek için JDirector çekilen test görüntülerde Mosflm çalıştırın.
5. Mosflm gelen sonuçlara göre tam bir veri kümesi toplayın.

18. Bilgi İşlem / Yapı Tayini

1. Veri kümesi işlemek için XDS / XScale ⁴ çalıştırın.
2. CCP4 suite yazılımını açın.
   1. Kullanılabilir, yüksek homoloji arama modelini kullanarak bir molekül yerine çözüm hesaplamak için Phaser ⁵ çalıştırın. Bu durumda biz bir arama modeli ⁶ olarak PDBID 3CW4 kullanılır.
   2. Veri kümesi içinde toplanan gözlenen yansıması karşı moleküler modeli geliştirmek için Refmac ⁷ çalıştırın. Nihai kararı en yüksek kabuk dışına göre ve aşağıdaki parametreleri tarafından belirlenmelidir: R katsayısı>% 50, I / sigma> 2 ve bütünlüğü> 90%.
3. Moleküler grafik yazılımı su tavuğu ⁸ ile 3 Boyutlu elektron yoğunluğu modeli oluşturmak.
4. PDB içinde yapı yatırma önce yapının kalite doğrulamak için MolProbity ⁹ yazılımı ile doğrulamak birikimi için uygundur.

Representative Results

Aşağıdaki sonuçlar, açıklanan protokol beklenen sonuçları göstermektedir ve PB2, gözlenen sonuçların durumunda.

Grip virüsü alt birim polimeraz PB2 beş tam uzunlukta bir hedef amino asit dizileri (Şekil 2) tasarlanmıştır, Gene Besteci kullanarak. PB2 dizileri geri çevrilir ve bir çok mühendislik adım ³ tabi tutuldu E. ekspresyon için optimize edilmiş kodon uyumlu dizileri elde edilmiştir coli. IPCR ürünleri (Şekil 3b) otuz dört tane yapısının toplam başarıyla içinden Şekil 3a'da gösterildiği gibi, boru klonlama ³ ile His füzyon tag SMT, bir N-terminal ile modifiye edilmiş bir 6x pET28 vektör sistemi ¹⁰ içine klonlandı. Klonlama akışı bir özeti Şekil 4 'de sunulmuştur.

Başarılı Klonlama işleminden sonra her bir yapı mikro ölçekli protein ekspresyonu BL21 (DE3) E. test edilmiştircoli hücreleri. Hücreler 220 rpm'de bir çalkalama inkübatör seti içinde 20 ° C 'de 48 saat süre ile Novagen Gecelik Express 1 ortamı (üreticinin protokolüne göre) ile desteklenmiş TBC medyumu içinde büyütülmüştür. Büyütmeden sonra, hücreler, bir kaliper LabChip 90 kılcal Elektroforez kullanılarak çözülebilir protein ekspresyonu için hasat edilmiş ve test edildi. Çözünür hedef protein yol açtı ve otuz dört PB2 yapıları on dört büyük ölçekli fermantasyon girdi. Her bir yapı Büyük ölçekli kültürler, üreticinin protokolüne uygun olarak Novagen en Gecelik Hızlı 1 orta TBC ile desteklenmiş ortam içinde büyütülmüştür. Büyütmeden sonra, hücreler santrifüjleme ile hasat edilmiş ve -80 ° C'de saklanır Her bir kültürün büyük ölçekli protein ekspresyonu büyük ölçekli saflaştırma ile devam etmeden önce SDS-PAGE analizi (Şekil 5) ile teyit edilmiştir.

Protein Maker on dört PB2 yapıları paralel arıtma yapmak için kullanıldı. Al açıklık lizatlarıl on dört yapıları bir nikel-şelat sütun kadar devam edildi. SDS-PAGE ile hedef protein fraksiyonları ihtiva ettiği tespit edildikten sonra, karşılık gelen her bir örnek için fraksiyonlar toplanmış ve her bir konsantrasyonu A ₂₈₀ okuma ile tespit edilmiştir. 6x His-etiketi SMT çıkarılması gece boyunca diyaliz ve bir ikinci nikel kolon takip ULP1 ilavesiyle yapılmıştır. His-etiketi kaldırma SMT Onayı, SDS-PAGE (Şekil 6) tarafından yapılan ve her bir örnek, 10 kDa'lık bir Amicon Ultra santrifüj tüpü ile konsantre edildi. Amicon Ultra santrifüj tüpleri kullanarak yoğunlaştırma sonrasında, her bir örnek kristalografik saflık elde etmek için bir boyutlandırma kolonu üzerinde çalıştırıldı. Ikinci bir konsantrasyon kristalizasyon için gerekli olan bir seviyeye protein konsantrasyonunu arttırmak için yapılmıştır. Tüm on dört yapıları başarıyla arıtılmış ve kristalizasyon çalışmalarda girilmiştir.

Kristalizasyon önce Fr eritilmesi ile başlatıldıozen protein. Kristalizasyon 16 bir iklim kontrollü odada yapıldı ° C oturan damla buharı difüzyon (Şekil 7) için özel olarak tasarlanmış plakaları (Emerald Bio) ile. İlk tarama dört seyrek-matris ekranı ile yapılmıştır; JCSG +, Paktı, Sihirbazı Tam, ve uzun bir Newman strateji takip CryoFull (Emerald Bio),. Protein çözeltisi, 0.4 ul daha sonra 96 ​​oyuklu Kompakt Jr kristalleştirme levhalar (Emerald Biyo) kullanılarak ilgili rezervuardan crystallant 0.4 ul (ya da hazır olarak bulundurulan çözelti) ile karıştırıldı. On dört saflaştırılmış örneklerin bunlardan dokuz difraksiyon çalışmaları (Şekil 8) için uygun kristaller vermiştir. Içi bir kırınım veri seti Osmik VARIMAX HF optik ve Saturn 944 + CCD dedektör ile donatılmış bir Rigaku süper parlak FR-E + döner-anot X-ışını jeneratörü kullanarak Cu Ka dalga boyunda kristalize dokuz yapıları beş (Şekil 9 toplanmıştır .) Her veri kümesi XDS / XScale ⁴ ile işlendi ^< / Sup> ve bir nihai karar için ölçekli. Moleküler değiştirilmesi ile yapı çözmeye çalışır CCP4 süit ⁷ Phaser ⁵ ile gerçekleştirilmiştir. Son model REFMAC ⁷ ve Coot ¹¹ ile manuel yeniden inşa arıtma sonra elde edilmiştir. Yapıları değerlendirildi ve MolProbity ⁹ ile geometri ve fitness için düzeltildi. PB2 alt birimi dört yapıların toplam belirlenir (Şekil 10) ve PDB yatırılır edildi. Şekil 11 MTPP boru hattı her aşamasında genel sonuç göstermektedir.

Şekil 1. Emerald Bio Çok hedef paralel işlem için SSGCID gen-için-yapı yolu genel bakış.

içeriği "fo: keep-together.within-page =" her zaman ">
Şekil 2. Hizalama Viewer ve Protein Gen Composer yazılımı Tasarım Modülü oluşturun. Amino-asit baz yeşil (orta pencere) ve alternatif yapıları yapısı güdümlü truncations altın (alt pencere) gösterilir gösterilmiştir hedef inşa. Birden Grip viral PB2 dizilerinin bir uyum sırası ve ikincil yapı elemanları ile karşılaştırıldığında gösterilir PDBID 3CW4, C-terminal alanı arasında. Etki alanı yapısı ve ikincil yapı elemanlarının Bilgi N-terminal truncations istenilen amino asit kalıntısı sağ tıklayarak Gen Besteci Tasarım Modülü içinde seçilecek sağlar. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 3a. BORU klonlama sentetik gen ekleme (turuncu) ileri tasarlanmıştır (kırmızı-turuncu çizgiler) ve üretmek için ters (turuncu-mavi çizgiler) primer PCR malzeme eklemek ile amplifiye neyin gösterilmiştir. Ifade vektörü ters (kırmızı-siyah çizgiler ile yükseltilir ) ve ileri (mavi-siyah çizgiler) astar vektör PCR malzeme oluşturmak için. Terminal dizileri IPCR ürünleri vPCR ürünleri (IPCR kırmızı IPCR bir vPCR ve mavi vPCR mavi tamamlar kırmızı tamamlar) bir terminal dizileri tamamlayıcısıdır. Bu IPCR ve vPCR ürünleri ana BL21 (DE3) kimyasal yetkili E. dönüşüm üzerine çoğaltılır plazmid oluşturmak için tavlama sağlar coli hücreleri.

Şekil 3b. IPCR üretimi agaroz jel analizi Başarılı IPCR ürünleri sağlam bantları temsil ise PB2 alt birimi gelen ts. IPCR arızaları, soluk ya da yağlı bantlar olarak görülebilir. IPCR ürün kalitesi genellikle klonlama başarı ile ilişkili olabilir. Molekül ağırlığı işaretleyicileri kiloDalton içindedir. Şekil Raymond ve arkadaşları. 2011 ¹² yeniden üretilir.

Şekil 4. Hedef gen mühendisliği adımları PB2 protein gen Composer yazılımı kullanılarak yapıldı. Işlenmiş nükleik asit sekansı, her hedef için kurulduktan sonra, 6-7 alternatif protein yapısının her biri için tasarlanmıştır. Gen tasarım ve klonlama ilk adımda çoklu hedef paralel işlem E. çözünür proteinler üretilen uygulanabilir hedefler vardı 14 olan 34 yapıları, sonuçlandı coli.

yeniden 5 "src =" / files/ftp_upload/4225/4225fig5.jpg "/>
Şekil 5,. Sağlam protein ekspresyonu (25.76 kDa'lık beklenen boyutu), (hat 7) Elüsyonlanan protein, 6x His-etiketi SMT bölünme yaklaşık% 50 çözünür (şerit 4) ile yaklaşık% 50 arası büyük ölçekli fermantasyon Örnek SDS-PAGE analizi.

6 Şekil. Polimeraz PB2 alt biriminin üç yapıları için SDS-PAGE sonuçlarını Şerit 1, moleküler ağırlık belirteçleri (kDa olarak solda etiketli);. Şerit 2, 6, 10, 1 Nikel kolondan toplanmış proteini şeritler 3, 7, ve 11. Nikel 2 tampon A içinde yarılan protein akan, şerit 4, 8 ve 12, nikel 2 tampon B 6x His-etiketi SMT çıkarılması.

d/4225/4225fig7.jpg "/>
Şekil 7. Oturma damla yöntemi ile buhar difüzyon şematik. Protein kristalizasyon için oturma bırak yöntemi buhar difüzyon kategorisinde yer alır. Bu yöntem, protein ve daha yüksek bir konsantrasyonda benzer koşullar içeren bir rezervuar ile daha büyük bir denge sağlaması için çökeltici bir arıtılmış örnek gerektirir. Su protein örnek transfer edilen hazneye buharlaşan olarak, çökeltici konsantrasyonu protein kristalizasyon için bir optimum seviyede artar.

Şekil 8. Grip virüsü bir gerginlik polimeraz PB2 alt birim protein kristal.

9 Şekil. Bir ikinci polimeraz PB2 alt biriminin X-ışını kırılma görüntüsününgrip virüsü süzün.

10 Şekil. 4 PB2 yapıların kristalografik asimetrik birimde moleküllerin Şerit diyagramlar. Gelen PDB kodları ile gökkuşağı desen renkli ikincil yapıları. (A) '3K2V (A/Yokohama/2017/2003/H3N2) (b) 3KHW (A / Meksika / InDRE4487/2009/H1N1) (c) 3KC6 (A/Vietnam/1203/2004/H5N1), (d) 3L56 (A/Vietnam/1203/2004/H5N1).

11 Şekil. Tarif edilen yöntemler ile grip PB2 hedefler için sonuç analizi. StrüktürlerE belirlenmesi boru hattı beş adımda gösterilmiştir: Klonlama, çözünürlük, saflaştırma, kristalleştirme ve yapı tayini.

Discussion

Çok Hedef Paralel İşleme

Yapı-esaslı ecza tasarımı ilaç keşfi önemli bir rol oynar. SSGCID NIAID kategorisi AC patojenlerden üç boyutlu protein yapıları ile bilimsel topluluk sağlamaya adamıştır. Yaygın olarak kullanılan yapısal bilgi yapma sonuçta yapı-bazlı ilaç tasarımı hızlandırmak için hizmet verecek.

MTPP yaklaşımın ilk kritik adım yapı tasarımı. Her hedef proteinin birden yapıları başarılı yapı tayini ve artar dönüş olasılığını artırır. Bazı protein yapıları boru hattının aşamalarında başarısız kaçınılmazdır. BORU klonlama yöntemi uygulayan emek yoğun arıtma aşamaları olmadan 96-çukurlu bir biçimde çok yapıların üretimi vererek MTPP yöntemini destekler. Aynı 96-biçimi (Kaliper Laboratuarı'nda protein ekspresyonu analiz yeteneği ile BORU klonlama EşleştirmeChip 90) daha genel akışını hızlandırır. Bu yöntemlerin eşleştirme büyük ölçekli protein üretimi ve arınma başarı sağlayan çözünür protein üretmek yapıları hızlı belirlenmesi için izin verir.

MTPP yüksek verimli başarısı için önemli bir yönü Protein Maker (ABD Patent No 6.818.060, Emerald Bio) araçtır. Protein Maker yüksek verimli protein üretimi ve ilgili yapısal genomik boru hattı araştırma uygulamaları verimini artırmak için özel olarak geliştirilmiş bir 24-kanal paralel sıvı kromatografi sistemidir. Protein makinesi için daha önce açıklanan protokol kullanılarak, avantajları tek bir hat FPLC sistemi ile karşılaştırıldığında fark vardır. Tek bir kişi sekiz saatlik süre içinde paralel olarak 48 hedefe kadar arındırmak olabilir. Bunun tersine, tek bir hat FPLC sistemi kullanılarak tek bir kişi, sadece aynı süre içinde dört hedefi azami arıtabilir. Her hedef için saflıkta yüksek düzeydeyapı analizi için artan protein kristalleri daha sonra başarısında kritik bir faktör olan protein Maker ile elde etti.

Sınırlamalar ve Sorun Giderme

X-ışını kristalografisi ile üç boyutlu yapıları çözme çözünür hedef proteinin büyük miktarda elde etmek için yetersizlik biri pek çok sorun, bir çok aşamalı bir çabadır. Çözünürlük sorunun üstesinden gelmek için uygulanabilecek bir strateji, E. gibi alternatif bir ekspresyon konak, kullanılmasıdır coli hücreleri birçok önemli ökaryotik translasyon sonrası modifikasyonlar yapamazsanız. Bu post-translasyonel modifikasyonlar gerçekleştirme yeteneğine sahip olan çeşitli maya ekspresyon, böcek ve memeli hücre çizgileri genellikle uygun bir alternatiftir. Hedef protein, bazen ifade ancak standart lizis koşullarında tamamen çözünmezler. Protein Makinesi alternatif hücre parçalama koşullarının hızlı test için değerli bir kaynak olabilirSmith, et ​​al. 2.011 ^13. Bu strateji hedefleri boru hattı boyunca hareket tutmak için gereklidir. Herhangi bir yapısal genomik boru hattı, standart protokoller boru hattı ve hedefleri tek tek optimizasyonu gerekebilir yoluyla gelen her hedef için uygun olmayabilir. Örneğin, her kriyoprotektan için 20% etilen glikol kullanmayı seçtim. Bu durum uygun olmadığı durumlarda, alternatif dondurarak saklama ya da konsantrasyonlar test edilmesi gerekebilir.

Her bir protein hedef eşsiz doğası gereği, hız sınırlayıcı ve bir yapı belirlenmesinde öngörülemeyen adım kristalleşme olduğunu. Ilk seyrek matris ekranlarından optimizasyonu ile protein kristalleşme MTPP boru hattı uzaklıklar yaygın olarak düşük başarı oranı. Ticari seyrek matris ekranlarından vurmak Her ilk kristal daha bir E-Screen Builder (Emerald Bio) ile optimize edilmiştir. Optimizasyonu ekran ar tasarlanmıştırtamponlar, tuzlar, ve katkı maddelerinin konsantrasyonları değiştiren, başlangıç ​​kristal hit durumu ound. Başarılı optimizasyon ekranlar difraksiyon çalışmaları ve yapı tayini için uygun kristaller verim.

Alerji ve Enfeksiyon Hastalıkları Ulusal Enstitüsü (NIAID) tarafından verilen yapısal genomik programı Emerald Bio ve birlikte SSGCID (Emerald Bio, SeattleBiomed, Washington Üniversitesi ve Pacific Northwest National Laboratory) olan diğer üç Kuzeybatı Pasifik kurumlara fon sağlar . Konsorsiyumun her üyesi NIAID yapısal genomik programının hedefleri gerçekleştirmek için gerekli state-of-the-art teknolojileri uygulayarak kendi uzmanlık için seçildi. Bugüne kadar, SSGCID dünyanın yedinci en büyük katkı olarak PDB sıralama içine 461 yapıları tevdi etti, ve 2011 yılında, en verimli. SSGCID olan protokolleri ve yöntemleri yararlanma niyeti ile sağlanırbilimsel topluluk ve bulaşıcı hastalıkların araştırma devam ettirmek.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Primers	IDT
Genes	DNA 2.0
TE buffer	Qiagen	provided in kit
96-well half skirt PCR plates	VWR	10011-248
PFU Master Mix
6X Orange Loading Dye	Fermentas	R0631
10X TAE	Teknova	T0280
Agarose	Sigma-Aldrich	A9414-10G
pET28 vector
2-YT Broth	VWR	101446-848
Kanamycin	Teknova	K2151
Restriction Enzymes	Fermentas
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
Top 10 chemically comp cells	Invitrogen	C4040-06
Disposable Troughs (Sterile, 25 ml)	VWR	89094-662
Airpore covers (Rayon films for bio cultures)	VWR	60941-086
24-well blocks	VWR	13503-188
QIAvac 96	Qiagen	19504
BL21(DE3) cells chemcomp (phageR)	NEB	C2527H
50% Glycerol	VWR	100217-622
TB Media	Teknova	T7060
IPTG	Sigma-Aldrich
1 M Tris pH 8.0	Mediatech	46-031-CM
5 M NaCl	Teknova	S0251
Glycerol	Aldrich	G7893-4L
CHAPS	JT Baker	4145-01
Imidazole	Sigma	56749-1KG
TCEP	Amresco	K831-10G
L-arginine	Amresco	0877-500G
Benzonase	EMD	70746-3
Lysozyme	USB	1864525GM
10 kDa MWCO dialysis tubing	Thermo	68100
Amicon Ultra 10 ka MWCO concentrators	Millipore	UFC901024
HisTrap FF columns	GE	17-5255-01
HiTrap Chelating columns	GE	17/0408-01
Compact Jr crystallization plates	Emerald Bio	EBS-XJR
Crystalization screens	Emerald Bio
Ethylene Glycol 100%	Emerald Bio	EBS-250-EGLY
Crystal Wand Magnetic Straight	Hampton Research	HR4-729
Mounted CryoLoop 0.1-0.2 mm	Hampton Research	HR4-955
ALS style puck
Puck Wand
Bent Tongs
Puck Pusher