细菌毒素引起的响应，用活细胞荧光显微镜的可视化

Summary

方法从重组净化胆固醇结合毒素链球菌溶血素O

Abstract

细菌毒素结合到膜中的胆固醇，细胞内容物的泄漏，和来自外部环境的材料涌入允许形成细孔。从这个侮辱，这需要积极的膜修复过程的细胞可以恢复，否则死取决于毒素的暴露量和细胞类型^1。此外，这些毒素诱导强烈的炎症反应，在受感染的宿主中，通过激活免疫细胞，包括巨噬细胞，从而产生的促炎性细胞因子的阵列^2。许多革兰氏阳性细菌产生的胆固醇结合的毒素，这已被证明有助于其毒力，很大程度上是未知的机制。

这些毒素的细胞暴露在质膜的形态学改变包括其螯合成富含胆固醇的表面突起，它可以脱落到细胞外空间，提示的特性的细胞防御机制^3,4。此过程发生的代谢活动的情况下，在所有细胞中，可以可视化后使用EM化学固定^4。在免疫细胞如巨噬细胞介导炎症的毒素暴露，引起膜泡的建议包含细胞因子IL-1家族，可能是负责脱落毒素和传播这些促炎性细胞因子^5,6,7。 IL-1β的释放之间的链接，以及一种特定类型的细胞死亡，称为pyroptosis已建议，因为二者都是caspase-1的依赖过程^8。进行排序，满分该巨噬细胞反应的复杂性，其中包括毒素结合，脱落的膜性囊泡，细胞因子的释放，和潜在的细胞死亡，我们已经开发了标记技术和荧光显微镜观察的方法，使毒素的细胞间的相互作用的实时可视化的，包括测量功能障碍和死亡（ 图1）。使用活细胞成像是必要的，因为其他技术的限制。生化方法不能解决发生在单个细胞的效应，而流式细胞仪没有提供高分辨率，单个细胞的实时可视化。这里描述的方法可以适用于由其他涉及复杂的细胞的表型变化的刺激诱导的反应的动力学分析。

Protocol

1。纯化的链球菌溶血素O（SLO）

1. 接种20毫升过夜培养BL21 GOLD细胞含有pBADgIII-SLOhis质粒⁹到0.5升的LB肉汤，并加入500微升50毫克/毫升氨苄青霉素。在225的转速在37℃下振荡培养直至OD _600，通常为0.6〜1.5小时。在10,000 xg离心5分钟，离心1 ml细菌（考虑T _0），溶解沉淀于140μL1×SDS上样缓冲液/ 1 OD和超声剪切DNA的蛋白质纯度分析。
2. 诱导细菌与加入5毫升20％的阿拉伯糖文化，摇动3小时，在室温下在225 rpm的转速下。收集1毫升的细菌，离心机和1×SDS上样缓冲液溶解在上述T ₃时间点的纯度分析。
3. 收集残留的细菌在离心瓶500毫升，旋转12,000 xg离心12分钟，在4°C（8500转SORVALL GS-3转子）。滗析出上清液，存储沉淀在-80℃过夜或更长的时间，如果需要的话。
4. 重悬FR在10毫升冰ozen丸对裂解/洗涤缓冲液（50mM的NaH ₂ PO _4，300mM的NaCl，10mM咪唑，pH 8.0）中加入400μl25％的Triton X-100，100微升100毫克/毫升溶菌酶，50补充微升200 1mM苯甲磺酰氟（PMSF）。 50毫升的橡树岭管转移的再悬浮颗粒。
5. 用超声波裂解液5次冰用30秒的时间间隔为30秒。在橡树岭管旋转超声裂解为39,000×g离心20分钟在4°C（18,000 rpm的SORVALL SS-34转子）。
6. 当溶胞产物的纺纱，洗1毫升用10ml的Ni-NTA琼脂糖裂解/洗涤缓冲液和在1,200 rpm下旋转5分钟，在4℃下（所有进一步的清洗/洗脱在这些条件下使用离心）。吸洗。
7. 细菌上清步骤1.5 Ni-NTA琼脂糖，轻轻摇晃2.5小时，在4°C。旋转收集上清。结合10μ4倍SDS上样缓冲液和30μl的上清液，用于纯度分析。洗磁珠4次，裂解/洗涤缓冲液和策中的Tris /盐缓冲液（50mM的Tris，300mM的NaCl，pH8.0）中。
8. 洗脱3次，加入1毫升的洗脱缓冲液（250mM咪唑的Tris /盐缓冲液中）和5μl的1M二硫苏糖醇（DTT）的珠粒，在冰上孵育10分钟，纺丝和收集上清液。 SLO是一个非常氧化还原敏感的蛋白，并必须在任何时候都保持在冰上。一旦降低，蛋白质会迅速失去其活性，如果加热至37℃，即使是很短的时间内。
9. 洗净500μl的多粘菌素共轭琼脂糖洗脱缓冲液中，自旋为1分钟，在4℃下以10,000 xg和重悬在500μl。要耗尽内毒素，加入200μl珠，每次洗脱和动摇4°C 30分钟。自旋为1分钟，在4℃下，保存上清液以10,000 xg。结合30微升的各洗脱与10μl的4倍的SDS样品缓冲液进行SDS-PAGE分析。
10. 测试的纯度通过SDS-PAGE的洗脱。煮沸样品保存在95℃下5分钟，负载10微升10％凝胶上电泳分析。染色GE升用考马斯亮可视化蛋白（ 图2A）。 SLO为69 kDa的。执行一个布雷德福的含量，以确定蛋白浓度（典型的产率是4毫克/毫升首2洗脱，但可能会发生变化的细菌菌株和质粒使用）。
11. 测试每个洗脱的溶血活性（见下文）。池洗脱纯度，浓度和溶血性活动是满意的。等分SLO在单次使用的等分试样（通常为5-10微升），在干冰上并存储在-80℃下冻结

2。溶血性贫血含量

1. 绵羊红血细胞（红细胞）洗净，在RBC测定缓冲液（0.3％牛血清白蛋白（BSA），2mM的的CaCl _2，10毫摩尔的Hepes，pH值7.4），旋在1,200 rpm离心5分钟，并重新悬浮在2.5％的红细胞10毫升RBC测定缓冲液。
2. 加入10μlRBC测定缓冲液/孔在96孔V形底的板置于冰上。串行稀释每洗脱，一式两份。典型的稀释范围为1:1,000到1:512,000。没有毒素，包括3个井3口井10微升2％的Triton X-100的分别作为最小值和最大值的井，。
3. 盖板和孵育在37℃下30分钟。在1,200 rpm下离心5分钟。 70微升的上清液转移到平底96孔板中。读A _405。一个单元是50％的红细胞溶解稀释毒素的需要。毒素活性稀释factor/0.01毫升为1个单位。

3。细胞裂解试验

1. 收集细胞，计数，旋转。以2×10 ⁶ /毫升的缓冲液中重悬的R / B（用2mM的RPMI的CaCl _{2，0.5％BSA）}和20μg/ ml的碘化丙啶。 100μl的细胞加入到96孔V底板。
2. 串行稀释SLO 2倍终浓度的缓冲液R / B，加入100μl的毒素或细胞的100微升缓冲R / B。孵育5分钟，37°C。通常，最终的浓度范围从2000 U /毫升至31.25 U /毫升。
3. 运行流式细胞仪检测细胞和藻红蛋白（PE）与过滤器收集数据。一个对数移瞬时透CELLS而3个日志位移表明死细胞。计算特定的细胞裂解，减去死细胞的比例（％PI ^高 _CTL）在控制实验（PI ^高 _EXP），如下：具体的裂解（％PI ^高的 _EXP - ％PI ^高 _CTL） /（100 - ％PI ^高 _CTL）* 100

4。微量移液器交货的毒素到细胞在培养皿

1. 实验板^{2×10 5}巨噬细胞对胶原蛋白镀膜玻璃底部35毫米盘前一天。
2. 打开显微镜和微量注射器。允许加热阶段的时间来预热至37°C显微镜的选择通常取决于对什么是本地可用的。该显微镜需要一个倒置的阶段，一个阶段能够菜肴加热至37℃，激发/发射滤​​波器立方体适合的染料的选择，和空间的物理连接的微量注射器。一个伯特兰透镜是有助益用于显微注射，但不是必需的。驱动显微镜的计算机需要足够的内存来收集和存储数据。
3. 标记细胞在37℃下30分钟用染料根据检测，标签可能会做与AM在5微升Fura2 1毫升PBS或2微升钙黄绿素AM在1毫升全媒体。对于Fura2，激发/发射340/510 nm和380/510 nm处收集，和340/380信号的比率确定钙通量。钙黄绿素，激发/发射515分之495，nm，而乙锭二聚体是六百二十零分之五百二十五的纳米和APC是650/660纳米。也可以选择其他的标签。
4. 洗涤细胞用PBS和地点在1ml的RPMI补充用2mM CaCl _2的 。安装在显微镜。
5. 4℃下以20,000 xg离心10分钟，稀释毒素和葡聚糖在水中，并且离心通常情况下，1微​​升SLO和4微升10毫克/毫升葡聚糖-555是在6μl水稀释。葡聚糖或其他荧光流体相分子是用来验证该毫微微尖端还没有堵塞，和INJE仙应有的作用。
6. 加载毫微微头从后面使用microloader的0.07微升稀释的毒素。
7. 毫微微尖装载到微量注射器。调整角度，使喷油器的尖端会坐在中心的细胞与空间各个方向移动。清除的z极限。注射设置应注入0.5秒，在120磅，20磅的反压。降低小费，直到它进入介质。
8. 使用伯特兰透镜，中心的前端和后续的尖端被降低，因为它更接近细胞。一旦你失去重心，切换回正常的光学系统。针影子应该是明显的领域。聚焦以上的细胞，并降低针，直到它处于焦点。重点对细胞，并小心地把针相邻的单元格。设置注射的z-限制。展开成像，移动到所需位置的前端，注入，释放毒素在期望的时间点。提高针，移动到一个新区域的细胞注入。针移动到起始位置，以防止任何不想要的针毒素泄漏。

Representative Results

通常为10 ⁷ -10 ⁸ U / ml的SLO可以得到4毫克/毫升的蛋白浓度。毒素细胞裂解所需的量的细胞类型而变化，但通常为125-500 U / ml的SLO（ 图2B）。如巨噬细胞的细胞类型可以更耐（4000 U /毫升），但其他人（特别是T细胞系）更为敏感。这些敏感性与市售SLO。毒素活性降低大约2倍的与各冻结 - 解冻，因此溶血检测与毒素每批或解冻需要验证毒素活性。毒素是在的情况下，含胆固醇的膜对热和氧化¹⁰也非常敏感，所以必须小心工作时，与该蛋白。

毒素microdelivery允许毒素处理过的细胞在同一盘与未经处理的细胞的比较。它还提供了一个内部​​控制毒素活性，因为扩散梯度将是ESTAB的lished微吸管尖端。地区靠近的微量吸移管将显示细胞死亡，所代表的钙黄绿素损失和乙锭同型二聚体的吸收，而进一步远离尖端的区域将显示无损伤（ 图3）。鉴于所用的毒素的效力，少量泄漏的微量吸移管的存在，即使在背压可以破坏细胞的字段（ 图3）的前端沿。使用的安全选项上的微量注射器将避免这方面的损失。

microdelivery的毒素还允许实时的事件，如钙离子流（ 图4）的检查。这个磁通不能被固定的细胞中观察到，和毒素的本地化交付允许这种诱导的钙通量如何传播通过细胞培养的研究。必须注意不损害细胞与微吸管本身，这也促使钙离子流^11。

此外标准的宽视场显微镜，可以结合高速三维共聚焦显微镜microdelivery。在很宽的领域的一个共焦显微镜的优点是能够解决在z维度上的事件和分析单个平面。根据当前技术，使用纺丝光盘共聚焦是必要的，以实现所需的高的速度。这些优点允许棚从毒素注射后（ 图5）的树突状细胞的可视化的微粒。这些微粒脱落蜂窝修复过程^4的一部分。毒素分子都集中在肺大泡，脱落，以消除毒素^4。没有共焦成像，检测微粒将是困难的，并且可能导致毒素的结论是，还没有以这种方式消除。

图1总体工作流程的生成和利用活细胞成像中的毒素。毒素纯化，严格的质量控制，通过微量移液器，此前已标记的可行性染料，钙指标或表面蛋白的抗体的细胞，然后交付。显微镜上获取数据，然后使用软件，如的MetaMorph或元素分析。

图2。纯化的SLO的质量控制。 （A）（T _0）的细菌的样品之前和之后（T _3）毒素诱导，上清液下述纯化（S），和每个3洗脱（E _{1-E 3）}通过SDS-PAGE和染色解决用考马斯亮蓝。 （B）无论是树突状细胞线D2或白血病细胞株T27A在37℃下5分钟，用各种浓度的SLO的挑战的碘化丙啶的存在下，并流式细胞仪检测。由下列公式计算：特异性裂解=（％PI ^高 _进出口 - ％PI ^高 _{的CTL）/（100} - ％PI ^高 _的CTL）* 100确定的特异性裂解

图3。培养细胞死亡的EtBr在下面的本地化曝光的细菌毒素anthrolysin O.成纤维细胞的人类皮肤成纤维细胞的钙黄绿素信号和吸收损失的钙黄绿素AM和溴化乙锭同型二聚体从Life Technologies使用活的死的套件。 100 pg的胆固醇结合毒素anthrolysin O ^13（的礼物，Drexel大学博士理查德休息）到培养皿的中心交付微量移液器，宽视场荧光图像采集，30分钟后用40倍的目标。从多个领域的图像结合起来，产生更大的图像显示气象非晶硅。

图4。暴露于细菌毒素SLO的人树突状细胞的细胞质中的钙离子流入。细胞被加载fura2 AM分娩前的SLO的溶液的浓度为80 U /μl和1升/分钟的流速。在时间0时表示用于交付的微量吸移管的前端由一个黄色星号。收集图像，在宽视场模式下连续地在340和380nm的激发波长，并用于测定胞内钙离子水平的排放量的比率。从绿色到蓝色的伪移位表示增加细胞内钙水平。每个面板中的时间标记表明秒钟后，开始另外的毒素。比例尺为20微米。 点击此处查看大图 。

图5。推出的从暴露于SLO的树突状细胞的表面上的微泡。预培养细胞的抗CD11c共轭APC标记的细胞膜，随后交付的丸3×10 ^-3 U的SLO。共聚焦的z以分钟为单位表示在各时间点收集的堆栈产生的3-D重建。的微量注射器的前端被确定使用DIC的成像和由黄色的箭头表示。比例尺为20μm。

Discussion

这里描述的技术允许检查细菌毒素的免疫细胞的反应。最关键的步骤是处理和剂量的毒素。毒素活性可以是非常可变之间，甚至在不同的等分试样的相同的制备，由于其脆弱性。因此，有必要对引用单元格的行或红细胞的毒素测试各等份，或使用毒素梯度的。毒素梯度，交付微量移液器，让毒素引起的活动时必须遵守的实时全方位的，但不适合本身的生化分析。

微管交货的毒素可以是具有挑战性的。然而，与标准显微注射不同，细胞渗透不需要此测定法。事实上，必须小心，不要损坏细胞与针本身，因为这会引起类似的膜修复反应^12。在免疫细胞中，特别是，所产生的钙通量针接触会传播到其他细胞在培养¹¹通过纳米管。不注射的细胞也会延长寿命的针。同样，使用伯川德透镜跟随针的下降细胞移除一些不确定性的微量吸移管的定位。虽然受损针会泄漏毒素的速度比完整的针，他们仍可以被用来生成初步结果。微量注射器系统允许，为多次注射，较高的毒素梯度的理想。另外，喷射持续时间也可以被修改，以改变剂量。微量注射器也允许一盘菜内进行多次实验。此外，再激发的效果进行研究。尽管我们描述检查免疫细胞的实验中，这些方法可适合于其他细胞系，以及。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ni-NTA agarose	Qiagen	30210
polymixin-agarose	Sigma	P1411-5ML
Zeba Desalt Spin col	Fisher	PI-89891
sheep RBCs	Fisher	50-415-688
pBADgIII-SLO	N/A	N/A	see ref9
Cy5 monoreactive dye	GE Healthcare	PA25001
Fura2-AM	Life Technologies	F1221
Calcein AM/ Ethidium homodimer	Life Technologies	L3224
Anti-CD11c-APC	BD Biosciences	550261
collagen-coated glass-bottom dish	Mattek	P35GCol-1.5-10-C
femto-tip II	Fisher	E5242957000
Microloader	Fisher	E5242956003
dextran Alexa 555	Life Technologies	D34679
Injectman NI 2	Eppendorf	920000029
FemtoJet	Eppendorf	5247 000.013
Table 1. List and source of specific reagents and equipment needed. Specific equipment and reagents used in this protocol, along with company and catalogue number are listed.
Buffer Composition Step Used Lyse/Wash 50 mM NaH2PO4 300 mM NaCl 10 mM imidazole, pH 8.0 1.4 Tris/salt 50 mM Tris, pH 8.0 300 mM NaCl 1.7 Elution buffer 50 mM Tris, pH 8.0 300 mM NaCl 250 mM imidazole 1.8 RBC Assay buffer 0.3% BSA 2 mM CaCl2 10 mM HEPES, pH 7.4 2.1 buffer R/B RPMI cell culture medium 2 mM CaCl2 0.5% BSA 3.1
Table 2. List of buffers used in this protocol. The buffers used, their composition and the first step at which they are used in the protocol are listed.