Visualisatie van bacteriële toxine geïnduceerde responsen met Live Cell Fluorescentie Microscopie

Summary

Werkwijzen voor het zuiveren van cholesterol binding toxine streptolysine O van recombinant

Abstract

Bacteriële toxinen binden aan cholesterol in membranen, vorming van poriën waarmee lekkage van cellulaire inhoud en instroom van materialen uit de externe omgeving. De cel kan herstellen van deze belediging, actief membraan herstelprocessen heeft, of anders sterven, afhankelijk van de hoeveelheid toxine blootstelling en celtype ^1. Bovendien induceren deze toxinen sterke ontstekingsreacties in geïnfecteerde gastheren door activering van immuuncellen, zoals macrofagen, die een array van pro-inflammatoire cytokines ² produceren. Veel Grampositieve bacteriën produceren toxinen die cholesterol binding is aangetoond dat hun virulentie dragen door grotendeels ongekarakteriseerde mechanismen.

Morfologische veranderingen in het plasmamembraan van cellen blootgesteld aan deze toxinen zijn onder opslag in cholesterol verrijkte oppervlaksuitsteeksels, die worden uitgescheiden in de extracellulaire ruimte, wat suggereert een intrinsieke cellulaire verdedigingmechanisme ^3,4. Dit proces treedt op in alle cellen in afwezigheid van metabolische activiteit en kan worden gevisualiseerd met EM na chemische fixatie ^4. In immune cellen zoals macrofagen die ontsteking bemiddelen als reactie op toxine blootstelling worden geïnduceerd membraanblaasjes voorgesteld cytokines van de IL-1 familie bevatten en kunnen verantwoordelijk zijn voor zowel vergieten toxine en verspreiding van deze pro-inflammatoire cytokines ^5,6,7. Een koppeling tussen IL-1β afgifte en een specifiek type van celdood, is genoemd pyroptosis voorgesteld, aangezien beide caspase-1 afhankelijke processen ^8. Te sorteren op de complexiteit van deze macrofagen reactie, die toxine binden, vergieten van membraan blaasjes, cytokine-afgifte, en mogelijk celdood omvat, hebben we etikettering technieken en fluorescentie microscopie methoden die het mogelijk maken voor real-time visualisatie van toxine-cel interacties, met inbegrip van metingen van disfunctie en dood (figuur 1). Gebruikenvan live cell imaging is nodig als gevolg van beperkingen in de andere technieken. Biochemische benaderingen niet kan oplossen die optreden bij de individuele cellen, terwijl flowcytometrie niet bieden een hoge resolutie, real-time visualisatie van de individuele cellen. De hier beschreven methoden kunnen worden toegepast op kinetische analyse van geïnduceerd door andere stimuli ingewikkelde fenotypische veranderingen in cellen.

Protocol

1. Zuivering van streptolysine O (SLO)

1. Inoculeer 20 ml overnacht kweek van cellen die BL21 GOLD pBADgIII-SLOhis plasmide ⁹ in 0,5 L LB bouillon en voeg 500 pi 50 mg / ml ampicilline. Schudden bij 225 rpm cultuur bij 37 ° C totdat _OD600 = 0,6, gewoonlijk ~ 1,5 uur. Centrifugeer 1 ml bacteriën (als T ₀₎ bij 10.000 xg 5 min, los pellet in 140 ul 1x SDS-monsterbuffer / 1 OD en ultrasone trillingen ten einde afschuiving DNA voor eiwitten zuiverheid analyse.
2. Induceren bacteriën met de toevoeging van 5 ml 20% arabinose tot cultuur schudden bij 225 rpm bij kamertemperatuur gedurende 3 uur. Verzamel 1 ml van bacteriën, centrifugeren en los op in 1x SDS-monsterbuffer als hierboven voor T ₃ tijdstip voor zuiverheid analyse.
3. Verzamel resterende bacteriën in 500 ml centrifuge fles draaien 12.000 xg gedurende 12 min bij 4 ° C (8.500 rpm Sorvall GS-3 rotor). Schenk de supernatant, store pellet bij -80 ° C overnacht of langer indien nodig.
4. Resuspendeer de frozen pellet op ijs in 10 ml Lyse / wasbuffer (50 mM NaH _{2PO 4,} 300 mM NaCl, 10 mM imidazool, pH 8,0) aangevuld met 400 ui 25% Triton X-100, 100 ul 100 mg / ml lysozym, 50 pi 200 mM fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF). Breng de geresuspendeerde pellet in 50 ml Oak Ridge buis.
5. Sonificeer lysaat 5 keren gedurende 30 sec op ijs met 30 seconde. Spin gesonificeerd lysaat in Oak Ridge buis bij 39.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C (18.000 rpm Sorvall SS-34 rotor).
6. Terwijl het lysaat draait, was 1 ml Ni-NTA agarose met 10 ml Lyse / buffer en centrifugeren op 1200 rpm spoelen 5 min bij 4 ° C. (Alle verdere wasbeurten / eluties gebruiken centrifugeren onder deze omstandigheden). Aspireren wassen.
7. Toevoegen bacteriële supernatant van stap 1,5 tot Ni-NTA agarose, schud gedurende 2,5 uur bij 4 ° C. Spin te verzamelen supernatant. Combineer 30 pl supernatant met 10 μ 4x SDS-monsterbuffer en opslaan voor zuiverheidsanalyse. Was de korrels 4 keer in Lyse / Wasbuffer ence in Tris / zoutbuffer (50 mM Tris, 300 mM NaCl, pH 8,0).
8. Elueren 3 maal door 1 ml elutiebuffer (250 mM imidazool in Tris / zoutbuffer) en 5 pi 1 M dithiothreitol (DTT) aan bolletjes incuberen op ijs gedurende 10 min, het spinnen en het verzamelen van het supernatant. SLO is een redox-gevoelige eiwit en worden bewaard op ijs te allen tijde. Na aftrek zal het eiwit snel verliest haar activiteit indien verwarmd tot 37 ° C, zelfs gedurende een korte tijd.
9. 500 ul wassen polymyxine-geconjugeerd agarose in elutiebuffer, centrifugeren op 10.000 xg gedurende 1 min bij 4 ° C en resuspendeer in 500 ul. Aan endotoxine afbreken Voeg 200 ul kralen aan elk elutie en schud 4 ° C gedurende 30 minuten. Spin bij 10.000 xg gedurende 1 min bij 4 ° C en sla het supernatant. Combineer 30 pi van elke elutie met 10 pi 4x SDS-monsterbuffer voor SDS-PAGE analyse.
10. Test de eluties van zuiverheid door SDS-PAGE. Kook monsters opgeslagen voor gel analyse bij 95 ° C gedurende 5 minuten en 10 pl belasting op een 10% gel. Stain gel met Coomassie te visualiseren eiwit (Figuur 2A). SLO is 69 kDa. Voer een Bradford assay voor eiwitconcentratie te bepalen (typisch opbrengst is 4 mg / ml voor de eerste twee eluties, maar kan per bacteriestam en plasmide gebruikt).
11. Test de hemolytische activiteit van elke elutie (zie hieronder). Pool eluties waar zuiverheid, concentratie en hemolytische activiteit bevredigend. Aliquot SLO in eenmalige aliquots (gewoonlijk 5-10 ul), invriezen op droog ijs en bij -80 ° C.

2. Hemolytic Assay

1. Wassen schapen rode bloedcellen (RBC's) in RBC Assay buffer (0,3% bovine serum albumine (BSA), 2 mM _CaCl2, 10 mM Hepes, pH 7,4), centrifugeren op 1200 rpm gedurende 5 min, en resuspendeer 2,5% RBCs in 10 ml RBC Assay buffer.
2. Voeg 10 ul assaybuffer RBC / well in 96-well V-bodem plaat op ijs. Serieel vul telkens elutie in tweevoud. Typische verdunning bereiken zijn 1:1.000 tot 1:512,000. Omvatten 3 wells zonder toxine en 3 met 10 wellspi 2% Triton X-100 de minimum-en maximum putten respectievelijk.
3. Afdekplaat en incubeer bij 37 ° C 30 min. Centrifugeer bij 1200 rpm gedurende 5 minuten. Breng 70 pl supernatant met een vlakke bodem met 96 putjes plaat. Lees beoordelingen over A _405. Een eenheid is de verdunning van toxine vereist voor 50% lysis van de erytrocyten. Toxine activiteit is 1 eenheid * verdunning factor/0.01 ml.

3. Cel Lytische Assay

1. Oogst cellen, tellen, spin. Resuspendeer op 2x10 ⁶ / ml in buffer R / B (RPMI met 2 mM _CaCl2, 0,5% BSA) en 20 ug / ml propidiumjodide. Voeg 100 ul cellen een 96-well V-bodem plaat.
2. Serieel verdund tot een eindconcentratie SLO 2x in buffer R / B, 100 ul toxine of 100 ul buffer R / B aan cellen. Incubeer 5 min 37 ° C Typische eindconcentraties bereik van 2.000 U / ml tot 31,25 U / ml.
3. Draaien cellen op stromingscytometer en verzamelen gegevens filters voor fycoerytrine (PE). Een een-log shift staat voor tijdelijk gepermeabiliseerde cells terwijl een 3 log verschuiving geeft aan dode cellen ^4. Berekenen de specifieke lysis van de cellen door het aftrekken het percentage dode cellen in de controle (% PI ^hoge _CTL) uit de experimentele (% PI ^hoog _exp) als volgt: specifieke lysis = (% PI ^hoge _exp -% PI ^hoge _CTL) / (100 -% PI ^hoge _CTL) * 100

4. Micropipet Levering van toxine op cellen in cultuur gerechten

1. Een dag voor experiment plaat 2x10 ⁵ macrofagen op collageen gecoate glazen bodem 35 mm schaal.
2. Zet microscoop en microinjector. Toestaan ​​verwarmd fase tijd opwarmen tot 37 ° C. De keuze van de microscoop hangt meestal af van wat er lokaal beschikbaar. De microscoop heeft een omgekeerde fase, een fase kunnen verwarmen gerechten tot 37 ° C, excitatie / emissie filter blokjes passend gekozen kleurstof, en de ruimte om fysiek de verbinding microinjector. Een Bertrand lensis nuttig voor micro-injectie, maar niet vereist. De computer een de microscoop moet voldoende geheugen te verzamelen en opslaan.
3. Label cellen gedurende 30 min met kleurstof bij 37 ° C. Afhankelijk van de assay kan worden uitgevoerd labeling met 5 pl fura2 uur in 1 ml PBS of 2 pi calceïne AM in 1 ml volledige media. Voor fura2 wordt excitatie / emissie verzameld 340/510 nm en 380/510 nm, en de verhouding van 340/380 signalen bepaalt calciumflux. Voor calceïne, excitatie / emissie is 495/515 nm, terwijl ethidiumhomodimeer is 525/620 nm en APC is 650/660 nm. Andere labels kunnen worden gekozen ook.
4. Was de cellen met PBS en in 1 ml RPMI aangevuld met 2 mM _CaCl2. Monteer op microscoop.
5. Verdun toxine en dextran in water, en centrifuge bij 20.000 xg gedurende 10 min 4 ° C. Gewoonlijk wordt 1 pi SLO en 4 pi 10 mg / ml dextran-555 verdund in 6 pl water. Dextran of andere fluorescerende vloeistof fase molecule wordt gebruikt om te controleren of de femto-tip niet verstopt en injects wens.
6. Laad Femto-tip van achteren met 0,07 pi van verdunde toxine met een microloader.
7. Laad Femto-tip op microinjector. Stel de hoek van de injector, zodat de tip zal zitten boven het midden van de cellen met ruimte om te bewegen in alle richtingen. Schakel z-limiet. Injectie instellingen moeten worden geïnjecteerd 0,5 sec bij 120 psi met 20 psi tegendruk. Laat tip totdat het in het medium.
8. Met de Bertrand lens, midden de tip en volg de tip als het dichter bij de cellen verlaagd. Zodra je verliest focus, terug te schakelen naar de normale optica. De naald schaduw moet duidelijk zijn in het veld. Focus boven de cellen en laat de naald totdat het in focus is. Focus terug op de cellen voorzichtig brengen de naald naast een cel. Stel de z-grens voor injectie. Begin beeldvorming, verhuizen tip in de gewenste positie, injecteren om toxine vrij op het gewenste tijdstip. Zet de naald, verhuizen naar een nieuwe regio van cellen en injecteren. Verplaats de naald naar de uitgangspositie om eventuele ongewenste voorkomentoxine lekkage van de naald.

Representative Results

Gewoonlijk 10 ⁷ -10 ⁸ U / ml SLO kan worden verkregen met een eiwitconcentratie van 4 mg / ml. De hoeveelheid toxine nodig cellysis verschilt per celtype, maar bedraagt ​​gewoonlijk 125 tot 500 U / ml SLO (Figuur 2B). Celtypes zoals macrofagen kunnen veel weerstand (4000 U / ml) terwijl anderen (T-cellijnen) gevoeliger. Deze gevoeligheden komen overeen met in de handel verkrijgbare SLO. Toxineactiviteit neemt ongeveer 2-voudig met elk vriesdooien, zodat hemolytische assays met iedere batch of ontdooien van toxine nodig toxineactiviteit verifiëren. Toxine is zeer gevoelig voor warmte en oxidatie ¹⁰ in afwezigheid van cholesterol-bevattende membranen, moet erop worden gelet dat bij het ​​werken met het eiwit.

Microdelivery van het toxine kan de vergelijking van onbehandelde cellen met toxine behandelde cellen in dezelfde schaal. Het biedt ook een interne controle om toxineactiviteit, aangezien een diffusie gradiënt worden vastgesteld van de micropipet tip. Streken met een micropipet zal celdood zien, gekenmerkt door calceïne verlies en ethidiumhomodimeer opname, terwijl gebieden die verder van de tip geen schade (figuur 3) tonen. Aangezien de sterkte van de gebruikte toxine kunnen kleine hoeveelheden die lekken uit de micropipet zelfs in aanwezigheid van de tegendruk vernietigen cellen als tip wordt bewogen langs het veld (figuur 3). Met behulp van de veiligheid optie op de microinjector voorkomt dit verlies.

Microdelivery van het toxine kan ook de behandeling van real-time gebeurtenissen, zoals calcium flux (figuur 4). Deze flux kan niet worden waargenomen in gefixeerde cellen en de lokale aflevering van het toxine maakt het bestuderen van deze geïnduceerde calcium flux wordt verspreid door een celkweek. Zorg moet worden genomen niet om de cellen te beschadigen met de micropipet zelf, want dit kan ook leiden tot calciumflux ^11.

Bovendiende standaard breed-veld microscopie kan worden gecombineerd met microdelivery snelle 3D confocale microscopie. Het voordeel van een confocale microscoop dan breed is het vermogen gebeurtenissen in de z-afmeting lossen en analyseren afzonderlijke vlakken. Met de huidige technologieën gebruik van een draaiende schijf confocale moet de benodigde hoge snelheden te bereiken. Deze voordelen kunnen de visualisatie van microdeeltjes wordt vergoten van dendritische cellen na toxine injectie (Figuur 5). Deze microdeeltjes worden afgestoten als onderdeel van de cellulaire herstelproces ^4. Toxine moleculen geconcentreerd worden op blebs, die worden vergoten om toxine ⁴ te elimineren. Zonder confocale beeldvorming zou detecteren van de microdeeltjes moeilijk en kunnen leiden tot de conclusie dat toxine niet wordt uitgeschakeld op deze manier.

Figuur 1. Algemeenworkflow voor het genereren en het gebruik van giftige stoffen in live cell imaging. Toxine wordt gezuiverd, onderworpen aan een strenge kwaliteitscontrole, en vervolgens geleverd via micropipet aan cellen die eerder zijn gelabeld, waarbij de levensvatbaarheid kleurstoffen, calcium indicatoren of antilichamen tegen oppervlakte-eiwitten. Gegevens worden verkregen op de microscoop en vervolgens geanalyseerd met behulp van software, zoals Metamorph of Elements.

Figuur 2. Kwaliteitscontrole van gezuiverd SLO. (A) Monsters van bacteriën voor (T ₀₎ en na _(T3) toxine inductie supernatant na zuivering (S), en elk van de drie eluties (E _{1 E-3)} werden gescheiden door SDS-PAGE en gekleurd met Coomassie blue . (B) Elke dendritische cellijn D2 of leukemie cellijn T27A werden uitgedaagd met verschillende concentraties van SLO gedurende 5 minuten bij 37 ° C in aanwezigheid van propidiumjodide enonderzocht door flowcytometrie. De specifieke lysis werd bepaald door de volgende formule: specifieke lysis = (% PI ^hoge _exp -% PI ^hoge _CTL) / (100 -% PI ^hoge _CTL) * 100

Figuur 3. Celdood blijkt uit het verlies van calceïne signaal en opname van EtBr in menselijke dermale fibroblasten na plaatselijke blootstelling aan de bacteriële toxine anthrolysin O. Fibroblasten werden geïncubeerd met calceïne AM en ethidiumhomodimeer met behulp van een live dode kit van Life Technologies. 100 pg van de cholesterol binding toxine anthrolysin O ¹³ (een gift van Dr Richard Rest, Drexel University) werd geleverd door micropipet in het midden van de kweekschaal en groothoek fluorescentiebeelden verzameld met een 40x objectief na 30 minuten. Beelden uit meerdere velden werden gecombineerd om de grotere afbeelding weergegeven met behulp van Met het genereren vanamorf.

Figuur 4. Calcium influx in cytosol van menselijke dendritische cellen blootgesteld aan het bacteriële toxine SLO. Cellen werden geladen met fura2 uur voor levering van een oplossing van SLO in een concentratie van 80 U / pl en een stroomsnelheid van 1 nl / min. De punt van de micropipet voor levering aangegeven tijdstip 0 met een gele asterisk. Beelden werden continu verzameld in groothoek modus bij 340 en 380 nm excitatie golflengte, en de verhouding van emissies gebruikt cytosolische calcium te bepalen. Verschuiving van groen naar blauw pseudocolor wijst op een toename van de cytosolische calcium. De tijd merk in elk paneel geeft seconden na het begin toevoeging van toxine. Scale bar is 20 urn. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 5. Vrijgave van microvesicles van het oppervlak van dendritische cellen blootgesteld aan SLO. Cellen werden gepreïncubeerd met anti-CD11c geconjugeerd aan APC naar de plasmamembraan gevolgd door afgifte van een bolus van 3x10 ^-3 U van SLO labelen. 3-D reconstructies werden gegenereerd uit confocale z-stacks verzameld op elk tijdstip in minuten. De tip van de microinjector werd geïdentificeerd met behulp van DIC imaging en wordt aangegeven door de gele pijl. Scale bar is 20 urn.

Discussion

De hier beschreven technieken toe het onderzoek van de reacties van immuuncellen bacteriële toxinen. De belangrijkste stap is de behandeling en dosering van de toxine. Toxineactiviteit kunnen zeer variabel, zelfs bij verschillende hoeveelheden van hetzelfde preparaat door zijn broosheid. Dit vereist zowel het testen van elk aliquot van toxine tegen een referentie-cellijn of RBC's of met behulp van toxine hellingen. Toxine gradiënten, zoals die door micropipet, zodat het volledige spectrum van toxine-geïnduceerde activiteiten die moeten worden nageleefd in real-time, maar niet leent voor biochemische analyse.

Micropipet levering van de toxine kan een uitdaging zijn. Tegenstelling tot standaard micro-injectie, echter penetratie van de cel niet voor deze assay. In feite, moet erop worden gelet dat de cellen beschadigen met de naald zelf, want dit zal een soortgelijke membraan reparatie reactie ¹² te lokken. In immuuncellen, in het bijzonder de calcium fluxen gegenereerd doornaald contact zal verspreiden zich over de nanobuisjes naar andere cellen binnen de cultuur ^11. Niet injecteren cellen zal ook verlengen de levensduur van de naald. Ook het gebruik van een lens Bertrand de naald afdaling volgen de cellen verwijderd onzekerheid in de positionering van de micropipet. Hoewel beschadigde naalden zal lekken toxine sneller dan intact naalden, kunnen zij toch worden gebruikt om de voorlopige resultaten te genereren. Het systeem maakt microinjector meerdere injecties zou meer toxine gradiënt gewenst. Als alternatief kan inspuitduur ook worden gemodificeerd om de geleverde dosis veranderen. De microinjector maakt het ook mogelijk meerdere experimenten uit te voeren binnen een schotel. Bovendien kan het effect van rechallenge bestudeerd. Hoewel we beschrijven experimenten onderzoeken immuuncellen kunnen deze werkwijzen worden aangepast aan andere cellijnen ook.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ni-NTA agarose	Qiagen	30210
polymixin-agarose	Sigma	P1411-5ML
Zeba Desalt Spin col	Fisher	PI-89891
sheep RBCs	Fisher	50-415-688
pBADgIII-SLO	N/A	N/A	see ref9
Cy5 monoreactive dye	GE Healthcare	PA25001
Fura2-AM	Life Technologies	F1221
Calcein AM/ Ethidium homodimer	Life Technologies	L3224
Anti-CD11c-APC	BD Biosciences	550261
collagen-coated glass-bottom dish	Mattek	P35GCol-1.5-10-C
femto-tip II	Fisher	E5242957000
Microloader	Fisher	E5242956003
dextran Alexa 555	Life Technologies	D34679
Injectman NI 2	Eppendorf	920000029
FemtoJet	Eppendorf	5247 000.013
Table 1. List and source of specific reagents and equipment needed. Specific equipment and reagents used in this protocol, along with company and catalogue number are listed.
Buffer Composition Step Used Lyse/Wash 50 mM NaH2PO4 300 mM NaCl 10 mM imidazole, pH 8.0 1.4 Tris/salt 50 mM Tris, pH 8.0 300 mM NaCl 1.7 Elution buffer 50 mM Tris, pH 8.0 300 mM NaCl 250 mM imidazole 1.8 RBC Assay buffer 0.3% BSA 2 mM CaCl2 10 mM HEPES, pH 7.4 2.1 buffer R/B RPMI cell culture medium 2 mM CaCl2 0.5% BSA 3.1
Table 2. List of buffers used in this protocol. The buffers used, their composition and the first step at which they are used in the protocol are listed.