Summary
Méthodes de purification du cholestérol contraignant toxine streptolysine O de recombinaison
Abstract
Toxines bactériennes se lier au cholestérol dans les membranes, en formant des pores qui permettent une fuite du contenu cellulaire et l'afflux de matériaux provenant de l'environnement extérieur. La cellule peut soit se remettre de cette insulte, ce qui nécessite actifs des processus de réparation des membranes, ou mourir en fonction de la quantité d'exposition aux toxines et 1 type de cellule. En outre, ces toxines induisent de fortes réactions inflammatoires chez les hôtes infectés par l'activation des cellules immunitaires, dont les macrophages, qui produisent une gamme de cytokines pro-inflammatoires 2. De nombreuses bactéries Gram-positives produisent des toxines cholestérol contraignants qui ont été montrés pour contribuer à leur virulence en grande partie grâce à des mécanismes non caractérisés.
Des changements morphologiques dans la membrane plasmique des cellules exposées à ces toxines comprennent leur séquestration dans les protubérances de surface cholestérol enrichis, qui peuvent être versées dans l'espace extracellulaire, ce qui suggère une défense cellulaire intrinsèqueMécanisme 3,4. Ce processus se produit sur toutes les cellules en l'absence de l'activité métabolique, et peuvent être visualisées à l'aide EM au bout de 4 fixation chimique. Dans les cellules immunitaires comme les macrophages, qui interviennent dans l'inflammation en réponse à l'exposition aux toxines, des vésicules membranaires induits sont suggérées pour contenir cytokines de la famille IL-1 et peut être responsable à la fois pour l'excrétion des toxines et la diffusion de ces cytokines pro-inflammatoires 5,6,7. Un lien entre l'IL-1β libération et un type spécifique de mort cellulaire, appelée pyroptosis a été suggéré, car les deux sont des processus caspase-1 dépendantes 8. Pour démêler les complexités de cette réponse des macrophages, ce qui inclut la liaison toxine, l'excrétion de vésicules membranaires, la libération de cytokines et la mort cellulaire potentiellement, nous avons développé des techniques d'étiquetage et les méthodes de microscopie par fluorescence qui permettent de visualiser en temps réel des toxines cellulaires des interactions, y compris mesures de dysfonctionnement et la mort (figure 1). Utiliserd'imagerie des cellules vivantes est nécessaire en raison des limitations dans d'autres techniques. Approches biochimiques ne peut pas résoudre effets qui se produisent dans des cellules individuelles, tout en cytométrie en flux n'offre pas de haute résolution, visualisation en temps réel des cellules individuelles. Les méthodes décrites ici peuvent être appliqués à l'analyse cinétique des réactions induites par des stimuli complexes impliquant d'autres changements phénotypiques dans les cellules.
Protocol
1. Purification de streptolysine O (SLO)
- Inoculer 20 ml de culture de nuit de cellules BL21 contenant le plasmide GOLD pBADgIII-SLOhis 9 dans 0,5 L de bouillon LB et ajouter 500 ul de 50 mg / ml d'ampicilline. Secouez la culture à 225 rpm à 37 ° C jusqu'à DO600 = 0,6, habituellement ~ 1,5 h. Centrifuger 1 ml (bactéries considérées T 0) à 10.000 xg 5 min, dissoudre le culot dans tampon 140 pi d'échantillon SDS 1x / 1 OD et soniquer à l'ADN de cisaillement pour l'analyse de pureté des protéines.
- Provoquer des bactéries avec l'addition de 5 ml arabinose 20% à la culture, secouez à 225 rpm à température ambiante pendant 3 heures. Prélever 1 ml de bactéries par centrifugation et dissous dans un tampon d'échantillon SDS 1x comme ci-dessus pour le point de temps T 3 pour l'analyse de pureté.
- Recueillir des bactéries restantes dans 500 ml bouteille centrifugeuse, tourner 12.000 xg pendant 12 min à 4 ° C (8.500 rpm Sorvall GS-3 du rotor). Décanter le surnageant, réserve de granulés à -80 ° C pendant la nuit ou plus si nécessaire.
- Reprendre le frozen granulés sur la glace dans 10 ml Lyse / tampon de lavage (50 mM NaH 2 PO 4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8,0) additionné de 400 ul de 25% de Triton X-100, 100 pl 100 mg / ml de lysozyme, 50 pl 200 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF). Transférer le culot remis en suspension à tube de 50 ml d'Oak Ridge.
- Soniquer lysat 5 fois pendant 30 secondes sur la glace avec des intervalles de 30 sec. Spin soniqué lysat dans un tube Oak Ridge à 39000 xg pendant 20 min à 4 ° C (18.000 rpm Sorvall rotor SS-34).
- Alors que le lysat est en rotation, laver 1 ml de Ni-NTA agarose avec 10 ml Lyse / tampon de lavage et un essorage à 1200 rpm pendant 5 min à 4 ° C. (Tous les autres lavages / ELUTIONS utiliser centrifugation dans ces conditions). Aspirer laver.
- Ajouter surnageant bactérien de l'étape de 1,5 à Ni-NTA agarose, agiter doucement pendant 2,5 heures à 4 ° C. Spin pour ramasser le surnageant. Mélanger 30 ul de surnageant avec 10 μ tampon d'échantillon SDS 4x et d'économiser pour l'analyse de la pureté. Laver les billes 4 fois dans Lyse / tampon de lavage et surce du Tris / sel tampon (50 mM Tris, 300 mM NaCl, pH 8,0).
- Éluer 3 fois en ajoutant 1 ml de tampon d'élution (250 mM d'imidazole dans du Tris / sel tampon) et 5 pi 1 M dithiothréitol (DTT) à des billes, l'incubation sur de la glace pendant 10 min, filature et recueillir le surnageant. SLO est une protéine très redox-sensible, et doit être conservé sur de la glace en tout temps. Une fois réduit, la protéine perdra rapidement son activité si chauffé à 37 ° C, même pour une courte période de temps.
- Lavez 500 pi polymixine conjugué agarose dans un tampon d'élution, spin à 10.000 xg pendant 1 min à 4 ° C et remettre en suspension dans 500 ul. Pour décharger endotoxine, ajouter 200 ul de perles à chaque élution et secouez 4 ° C pendant 30 min. Spin à 10.000 xg pendant 1 min à 4 ° C, puis enregistrez le surnageant. Mélanger 30 ul de chaque élution avec 10 pi de tampon d'échantillon SDS 4x pour analyse SDS-PAGE.
- Tester la pureté de élutions par SDS-PAGE. Faire bouillir les échantillons enregistrés pour analyse sur gel à 95 ° C pendant 5 min et la charge de 10 pi sur un gel à 10%. Stain gel de Coomassie pour visualiser la protéine (figure 2A). SLO est de 69 kDa. Effectuer un test de Bradford afin de déterminer la concentration de protéines (rendement typique est de 4 mg / ml pour les deux premières élutions, mais peut varier selon la souche bactérienne et le plasmide utilisé).
- Tester l'activité hémolytique de chaque élution (voir ci-dessous). Élutions piscine où l'activité pureté, la concentration et hémolytiques sont satisfaisants. SLO aliquote à usage unique aliquotes (ul typiquement 5-10), de geler sur glace sèche et conserver à -80 ° C.
2. Dosage hémolytique
- Laver globules rouges de mouton (globules rouges) dans RBC dosage tampon (0,3% de sérumalbumine bovine (BSA), 2 mM de CaCl2, 10 mM de HEPES, pH 7,4), spin à 1200 rpm pendant 5 min, et remettre en suspension les globules rouges à 2,5% en 10 ml de tampon de dosage RBC.
- Ajouter 10 ul de tampon d'analyse RBC / puits dans 96 puits à fond en V plat sur la glace. Diluer en série chaque élution en double exemplaire. Gammes de dilutions typiques sont 1:1,000 à 1:512,000. Inclure les 3 puits avec aucune toxine et 3 puits avec 10pi 2% de Triton X-100 comme puits minimale et maximale, respectivement.
- Couvrir la plaque et incuber à 37 ° C 30 min. Centrifuger à 1200 rpm pendant 5 min. Transfert 70 pi de surnageant dans un fond plat plaque de 96 puits. Lire A 405. Une unité est la dilution de la toxine requis pour la lyse de 50% des globules rouges. Activité de la toxine est de 1 unité de dilution * factor/0.01 ml.
3. Essai cellule lytique
- Cellules de récolte, de comptage, de spin. Remettre en suspension à 2x10 6 / ml dans un tampon R / B (RPMI avec 2 mM de CaCl2, 0,5% de BSA) et 20 pg / ml d'iodure de propidium. Ajouter 100 ul de cellules à un 96-V et plaque à fond.
- Diluer en série SLO 2x concentration finale dans le tampon R / B, ajouter 100 ul toxine ou 100 pi de tampon R / B pour les cellules. Incuber 5 min à 37 ° C. Portée typique concentrations finales de 2.000 U / ml à 31,25 U / ml.
- Exécuter sur les cellules cytomètre de flux et de recueillir des données avec des filtres pour la phycoérythrine (PE). Un décalage d'une cel journal représente transitoirement perméabiliséesls tandis qu'un changement de 3 log indique les cellules mortes 4. Calculer la lyse spécifique des cellules en soustrayant le pourcentage de cellules mortes dans le contrôle (PI% haute ctl) de la (PI exp% élevé) expérimental, comme suit: lyse spécifique = (PI% exp haute -% PI haute ctl) / (100 -% PI haute ctl) * 100
4. Micropipette de livraison de la toxine aux cellules dans des boîtes de culture
- Un jour avant l'expérience, les macrophages plaque 2x10 5 sur un revêtue de collagène à fond de verre boîte de 35 mm.
- Allumez le microscope et microinjecteur. Prévoyez du temps Platine chauffante pour réchauffer à 37 ° C. Le choix d'un microscope dépend généralement de ce qui est disponible localement. Le microscope inversé a besoin d'un stade, un stade capable de chauffer les plats à 37 ° C, blocs de filtres d'excitation / émission appropriées pour le colorant choisi, et l'espace pour connecter physiquement le micro-injecteur. Lentille de Bertrandest utile pour la micro-injection, mais pas obligatoire. L'ordinateur de conduite du microscope a besoin de mémoire suffisant pour recueillir et stocker des données.
- Marquer les cellules pendant 30 min avec de la teinture à 37 ° C. Selon le dosage, l'étiquetage peut être fait avec 5 pl Fura2 AM dans 1 ml de PBS ou 2 pi calcéine AM dans 1 ml de milieu complet. Pour Fura2, excitation / émission est recueillie pour 340/510 nm et 380/510 nm, et le rapport de 340/380 signaux détermine le flux de calcium. Pour calcéine, excitation / émission est 495/515 nm tandis que l'éthidium homodimère est 525/620 nm et APC est 650/660 nm. D'autres marqueurs peuvent être choisis aussi bien.
- Laver les cellules avec du PBS et placer dans 1 ml de RPMI supplémenté avec 2 mM de CaCl 2. Montez le microscope.
- Diluer la toxine et le dextrane dans l'eau, et centrifugation à 20.000 xg pendant 10 min 4 ° C. Typiquement, 1 pl SLO et 4 pl 10 mg / ml de dextran-555 est dilué dans 6 pl d'eau. Dextrane ou un autre fluide fluorescent en phase molécule est utilisé pour vérifier que le femto-pointe n'est pas bouché, et injects comme vous le souhaitez.
- Chargez femto-pointe de l'arrière avec 0,07 l de toxine diluée à l'aide d'un Microloader.
- Chargez femto-pointe sur microinjecteur. Ajustez l'angle de l'injecteur de sorte que la pointe sera assis sur le centre des cellules avec espace pour se déplacer dans toutes les directions. Effacer z-limite. Paramètres d'injection doivent être injecter plus de 0,5 seconde à 120 psi à 20 psi pression. Abaissez la pointe jusqu'à ce qu'elle entre dans le milieu.
- En utilisant la lentille de Bertrand, centre de la pointe et la pointe suivre lorsqu'il est abaissé au plus près des cellules. Une fois que vous perdre le focus, revenez à l'optique normales. L'ombre aiguille doit être visible sur le terrain. Concentrez-dessus des cellules et abaisser l'aiguille jusqu'à ce qu'elle soit mise au point. Concentrer arrière sur les cellules et soigneusement amener l'aiguille adjacente à une cellule. Réglez le z-limite pour l'injection. Commencer imagerie, déplacer la pointe à la position désirée, injecter pour libérer la toxine à l'instant souhaité. Relevez l'aiguille, passer à une nouvelle région de cellules et injecter. Déplacer l'aiguille en position initiale pour éviter toute indésirablefuite de l'aiguille de la toxine.
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Representative Results
Typiquement 10 7 -10 8 U / ml SLO peut être obtenue avec une concentration en protéines de 4 mg / ml. La quantité de toxine nécessaire pour la lyse des cellules varie selon le type cellulaire, mais elle est généralement de 125 à 500 U / ml SLO (figure 2B). Types de cellules comme les macrophages peuvent être plus résistantes (4000 U / ml) alors que d'autres (en particulier des lignées de cellules T) sont plus sensibles. Ces sensibilités correspondre avec SLO disponible dans le commerce. Activité de la toxine diminue à peu près 2 fois avec chaque gel-dégel, les tests hémolytiques manière avec chaque lot ou le dégel de la toxine sont nécessaires pour vérifier l'activité des toxines. La toxine est également très sensible à la chaleur et à l'oxydation 10 en l'absence de cholestérol des membranes contenant, si les soins doivent être prises lorsque l'on travaille avec la protéine.
Microdelivery de la toxine permet la comparaison des cellules non traitées par la toxine des cellules traitées dans le même plat. Il fournit également un contrôle interne à l'activité des toxines, depuis un gradient de diffusion sera étainstitué à partir de la pointe de la micropipette. Régions proches de la micropipette montrera la mort cellulaire, caractérisée par la perte de calcéine et l'adoption d'éthidium homodimère, alors que les régions plus éloignées de la pointe se présenter aucun dommage (figure 3). Compte tenu de la puissance de la toxine utilisée, de petites quantités qui s'échappent de la micropipette, même en présence de contre-pression peut détruire les cellules que la pointe est déplacée le long du champ (figure 3). Utilisation de l'option de sécurité sur le microinjecteur permettra d'éviter cette perte.
Microdelivery de la toxine permet également à l'examen des événements en temps réel, tels que les flux de calcium (figure 4). Ce flux ne peut pas être observée dans les cellules fixes, et l'application locale de la toxine permet l'étude de la façon dont ce flux de calcium induit se propage à travers une culture cellulaire. Il faut prendre soin de ne pas blesser les cellules avec la micropipette lui-même, car cela peut aussi induire des flux de calcium 11.
En plusà la norme microscopie à grand champ, Microdelivery peut être associé à une vitesse de microscopie confocale 3D haut. L'avantage d'un microscope confocal sur le champ large est la capacité à résoudre les événements dans la dimension z et analyser les différents plans. Avec les technologies actuelles, l'utilisation d'un confocale à disque rotatif est nécessaire pour atteindre les vitesses élevées requises. Ces avantages permettent la visualisation des microparticules étant répandu depuis les cellules dendritiques suite à l'injection de toxine (figure 5). Ces microparticules sont excrétées dans le cadre de la 4 processus de réparation cellulaire. Molécules de toxine est concentrée sur les bulles, qui sont versées à éliminer les toxines 4. Sans l'imagerie confocale, la détection des microparticules serait difficile, et peut-être mener à la conclusion que la toxine n'est pas éliminée de cette manière.
Figure 1. L'ensembleflux de travail pour la production et l'utilisation de toxines dans l'imagerie de cellules vivantes. La toxine est purifié, soumis à un contrôle rigoureux de la qualité, puis livrés via micropipette à des cellules qui ont été préalablement marqués avec des colorants, des indicateurs de viabilité de calcium ou des anticorps contre les protéines de surface. Les données sont acquises sur le microscope, puis analysées à l'aide du logiciel, telles que Metamorph ou Elements.
Figure 2. Contrôle de la qualité d'eau purifiée SLO. (A) Les échantillons de bactéries avant (T 0) et après l'induction toxine (T 3), surnageant après purification (S), et chacun des trois élutions (E 1-E 3) ont été résolus par SDS-PAGE et colorées au bleu de Coomassie . (B) Soit D2 cellules dendritiques ligne ou la leucémie lignée cellulaire T27A ont été exposées à différentes concentrations de SLO pendant 5 min à 37 ° C en présence d'iodure de propidium etexaminé par cytométrie de flux. La lyse spécifique a été déterminée par la formule suivante: lyse spécifique = (PI% exp haute -% PI haute ctl) / (100 -% PI haute ctl) * 100
Figure 3. Mort cellulaire montre une perte de signal calcéine et l'adoption de EtBr dans les fibroblastes dermiques humains suite à une exposition localisée aux fibroblastes bactériennes toxine anthrolysin O. ont été incubées avec calcéine AM et éthidium homodimère l'aide d'un kit en direct mort de Life Technologies. 100 pg de cholestérol contraignant toxine anthrolysin O 13 (un don du Dr. Richard repos, Drexel University) a été livré par micropipette dans le centre de la boîte de culture et grand champ d'images de fluorescence collectées en utilisant un objectif 40x après 30 min. Images provenant de plusieurs champs ont été combinées pour produire la plus grande image affichée à l'aide Metamorphe.
Figure 4. L'entrée de calcium dans le cytosol des cellules dendritiques humaines exposées au SLO toxine bactérienne. Les cellules ont été chargés de fura2 AM avant la livraison d'une solution de SLO à une concentration de 80 U / ul et un débit de 1 nl / min. La pointe de la micropipette utilisée pour la livraison est indiqué au temps 0 par un astérisque jaune. Les images ont été recueillies en continu en mode à grand champ 340 et 380 nm longueurs d'excitation, et le rapport des émissions utilisée pour déterminer le taux de calcium cytosolique. Maj du vert au bleu en pseudo indique une augmentation du taux de calcium cytosolique. La marque du temps sur chaque panneau indique secondes après le début de la toxine plus. La barre d'échelle est de 20 um. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 5. Sortie de microvésicules de la surface des cellules dendritiques exposées à SLO. Les cellules ont été pré-incubées avec des anticorps anti-CD11c conjugué à APC pour étiqueter la membrane plasmique, suivie par administration d'un bolus de U -3 3x10 de SLO. 3-D reconstructions ont été générés à partir confocale z piles collectées à chaque temps indiqué en minutes. La pointe de la micro-injecteur a été identifié en utilisant l'imagerie DIC et est indiqué par la flèche jaune. La barre d'échelle est de 20 um.
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Discussion
Les techniques décrites ici permettent l'examen des réponses des cellules immunitaires à des toxines bactériennes. L'étape la plus critique est la manipulation et le dosage de la toxine. Activité de la toxine peut être extrêmement variable, même entre différentes aliquotes de la même préparation, en raison de sa fragilité. Cela nécessite soit l'essai de chaque aliquote de la toxine contre une lignée cellulaire de référence ou globules rouges ou en utilisant des gradients de toxines. Gradients de toxines, tel que livré par micropipette, permettre à l'ensemble des activités induites par la toxine à observer en temps réel, mais ne se prête pas à l'analyse biochimique.
Micropipette livraison de la toxine peut être difficile. Contrairement à la micro-injection standard, cependant, la pénétration de la cellule n'est pas nécessaire pour ce test. En fait, il faut prendre soin de ne pas endommager les cellules avec l'aiguille elle-même, car cela va provoquer une réaction similaire de réparation membrane 12. Dans les cellules immunitaires, en particulier, les flux de calcium produit paraiguille de contact va se propager via des nanotubes à d'autres cellules dans la culture 11. Cellules non injectables permettra également d'étendre la durée de vie de l'aiguille. De même, l'utilisation d'une lentille de Bertrand de suivre la descente de l'aiguille vers les cellules enlève une certaine incertitude dans le positionnement de la micropipette. Bien aiguilles endommagées fuira toxine plus rapidement que les aiguilles intactes, ils peuvent encore être utilisés pour générer des résultats préliminaires. Le système de micro-injecteur permet d'injections multiples, si un gradient supérieur toxine désirer. Sinon, la durée d'injection peut également être modifiée pour modifier la dose délivrée. Le microinjecteur permet également de multiples expériences à effectuer dans un plat. En outre, l'effet de la reprise du traitement peut être étudiée. Bien que nous décrivons des expériences examinant les cellules immunitaires, ces méthodes pourraient être adaptées à d'autres lignées cellulaires ainsi.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier Richard Reste pour le don généreux de anthrolysin O, Michael Caparon pour le don généreux des Francs SLO plasmide et Jonathon d'assistance technique. Ce travail a été financé par des subventions du NIH T32CA82084 (PAK), et R01AI072083 (RDS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||||||
| Ni-NTA agarose | Qiagen | 30210 | |||||||||||||||||||
| polymixin-agarose | Sigma | P1411-5ML | |||||||||||||||||||
| Zeba Desalt Spin col | Fisher | PI-89891 | |||||||||||||||||||
| sheep RBCs | Fisher | 50-415-688 | |||||||||||||||||||
| pBADgIII-SLO | N/A | N/A | see ref9 | ||||||||||||||||||
| Cy5 monoreactive dye | GE Healthcare | PA25001 | |||||||||||||||||||
| Fura2-AM | Life Technologies | F1221 | |||||||||||||||||||
| Calcein AM/ Ethidium homodimer | Life Technologies | L3224 | |||||||||||||||||||
| Anti-CD11c-APC | BD Biosciences | 550261 | |||||||||||||||||||
| collagen-coated glass-bottom dish | Mattek | P35GCol-1.5-10-C | |||||||||||||||||||
| femto-tip II | Fisher | E5242957000 | |||||||||||||||||||
| Microloader | Fisher | E5242956003 | |||||||||||||||||||
| dextran Alexa 555 | Life Technologies | D34679 | |||||||||||||||||||
| Injectman NI 2 | Eppendorf | 920000029 | |||||||||||||||||||
| FemtoJet | Eppendorf | 5247 000.013 | |||||||||||||||||||
Table 1. List and source of specific reagents and equipment needed. Specific equipment and reagents used in this protocol, along with company and catalogue number are listed. |
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Table 2. List of buffers used in this protocol. The buffers used, their composition and the first step at which they are used in the protocol are listed. |
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References
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