ויזואליזציה של תגובות מושרות רעלן של חיידקים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי תא החי

Summary

שיטות לטיהור הכולסטרול המחייב הרעל streptolysin O מרקומביננטי

Abstract

רעלנים חיידקיים נקשרים לכולסטרול בממברנות, ויצרו נקבוביים המאפשרים זליגה של תכנים וזרם של חומרים מהסביבה החיצונית סלולריים. התא יכול להתאושש מהעלבון הזה, שדורש תהליכי תיקון קרום פעילים, אחרת ימות תלוי בכמות חשיפת רעל וסוג תא ^1. בנוסף, רעלים אלו לגרום לתגובות דלקתיות חזקות במארחים נגועים באמצעות הפעלה של תאים חיסוניים, כוללים מקרופאגים, אשר מייצרים מערך של ציטוקינים פרו דלקתיים ^2. חיידקים חיוביים גרמו רבים לייצר רעלים מחייבים כולסטרול אשר הוכח לתרום לארסיותם באמצעות מנגנוני uncharacterized במידה רבה.

שינויים המורפולוגיים בקרום הפלזמה של תאים שנחשפו לרעלים אלו כוללים קיבוע שלהם לתוך בליטות על פני שטח כולסטרול מועשרים, שניתן לשפוך לתוך חלל החוץ התאי, דבר המצביע הגנה סלולרית פנימיתמנגנון ^3,4. תהליך זה מתרחש בכל התאים בהיעדר הפעילות המטבולית, ויכול להיות חזותי באמצעות EM לאחר ⁴ קיבעון כימי. בתאי מערכת חיסון כגון מקרופאגים אשר מתווכים דלקת בתגובה לחשיפת רעל, שלפוחית ​​קרום מושרה הם הציעו מכילות ציטוקינים של משפחת IL-1 ויכולה להיות אחראי לשפיכה הוא רעל והפצת ציטוקינים אלו פרו דלקתי ^5,6,7. קשר בין השחרור IL-1β וסוג מסוים של מות תאים, pyroptosis כינה הוצע, כמו גם תהליכים caspase-1 תלוי ^8. כדי למיין את המורכבות של התגובה הזאת macrophage, הכוללת קשירת רעל, שפיכת השלפוחית ​​בממברנה, שחרור ציטוקין, ומוות פוטנציאלי תא, פתחו טכניקות ושיטות תיוג מיקרוסקופ פלואורסצנטי המאפשרות הדמיה בזמן אמת של אינטראקציות רעל תאים, כולל מדידות של תפקוד ומוות (איור 1). להשתמששל הדמית תא חייה הוא הכרחי בשל מגבלות בטכניקות אחרות. גישות ביוכימיות לא יכולות לפתור את תופעות המתרחשות בתאים בודדים, ואילו זרימה cytometry אינו מציע רזולוציה גבוהה הדמיה, בזמן אמת של תאים בודדים. השיטות שתוארו כאן יכולות להיות מיושמת על ניתוח הקינטית של תגובות הנגרמות על ידי גירויים אחרים הקשורות בשינויים פנוטיפי מורכבים בתאים.

Protocol

1. טיהור Streptolysin O (slo)

1. לחסן תרבות לילה מ"ל 20 מתוך BL21 תאים המכילים זהב pBADgIII-SLOhis פלסמיד ⁹ לתוך מרק LB L 0.5 ולהוסיף 500 μl 50 מ"ג / המ"ל אמפיצילין. Shake התרבות ב 225 סל"ד ב 37 ° C עד ₆₀₀ OD = 0.6, בדרך כלל 1.5 ~ שעות. צנטריפוגה 1 מ"ל (חיידקים נחשב T ₀₎ ב -10,000 XG 5 דקות, לפזר גלולה במאגר 140 μl 1x SDS מדגם / 1 OD וsonicate ל-DNA גזירה לניתוח טוהר חלבון.
2. לגרום לחיידקים בתוספת המ"ל arabinose 5 20% לתרבות, לנער ב 225 סל"ד בטמפ 'החדר במשך 3 שעות. איסוף 1 מ"ל של חיידקים, צנטריפוגה ומתמוסס בחיץ מדגם SDS 1x כאמור לנקודת זמן T ₃ עבור ניתוח טוהר.
3. לאסוף חיידקים שנותרו בבקבוק 500 מ"ל צנטריפוגה, הספין 12000 XG עבור 12 דקות ב 4 ° C (8500 סל"ד Sorvall הרוטור GS-3). למזוג supernatant, חנות הגלולה ב-80 ° C למשך הלילה או יותר במידת צורך.
4. Resuspend frאוזן גלולה על קרח ב10 מ"ל lyse / לשטוף חיץ (50 mM nah ₂ PO _4, 300 המ"מ NaCl, 10 mM imidazole, 8.0 pH) בתוספת 400 μl 25% Triton X-100, 100 μl 100 מ"ג / המ"ל Lysozyme, 50 פלואוריד μl 200 מ"מ phenylmethylsulfonyl (PMSF). להעביר את הכדור לצינור resuspended רידג' 50 מיליליטר אלון.
5. Sonicate lysate 5 פעמים למשך 30 שניות על קרח עם 30 מרווחים שניים. ספין sonicated lysate בצינור רכס אלון ב39000 XG במשך 20 דקות ב 4 ° C (SS-34 הרוטור 18000 סל"ד Sorvall).
6. בעוד lysate מסתובב, לשטוף 1 המ"ל Ni-נ.ת. ע agarose עם 10 מ"ל lyse / לשטוף חיץ וספין בסל"ד 1200 למשך 5 דקות ב 4 ° C. (כל הכביסות / elutions הנוספות להשתמש בצנטריפוגה בתנאים אלה). לשאוב לשטוף.
7. הוסף supernatant חיידקים משלב 1.5 ל Ni-נ.ת. ע agarose, ללחוץ בעדינות במשך 2.5 שעות ב 4 ° C. ספין כדי לאסוף supernatant. שלב 30 μl של supernatant עם חיץ 10 μ 4x SDS מדגם ולשמור על טוהר ניתוח. שטוף את החרוזים 4 פעמים בlyse / לשטוף חיץ ועלce בטריס / מלח חיץ (50 mM טריס, 300 mM NaCl, pH 8.0).
8. Elute 3 פעמים על ידי הוספת 1 מיליליטר חיץ elution (250 המ"מ imidazole במאגר טריס / מלח) ו 5 μl M dithiothreitol 1 (DTT) לחרוזים, דוגר על קרח למשך 10 דקות, מסתובב ואוסף את supernatant. Slo הוא חלבון מאוד חיזור רגיש, ויש לשמור על קרח בכל העת. הופחת פעם, החלבון יהיה במהירות לאבד את פעילותו אם חמם עד 37 מעלות צלזיוס, אפילו לתקופה קצרה של זמן.
9. שטוף 500 agarose μl polymixin מצומדות במאגר elution, ספין ב -10,000 XG ל1 דקות ב 4 ° C וresuspend ב 500 μl. כדי לרוקן אנדוטוקסין, להוסיף 200 חרוזי μl לכל elution ולנער 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. ספין ב -10,000 XG ל1 דקות ב 4 ° C, ולשמור את supernatant. שלב 30 μl של כל elution עם חיץ 10 μl 4x SDS מדגם לניתוח SDS-PAGE.
10. לבדוק את טוהר elutions ידי SDS-PAGE. דגימות מרתיחות הצילו לניתוח ג'ל ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ו 10 μl עומס על ג'ל 10%. כתם geאני עם Coomassie לדמיין חלבון (איור 2 א). Slo הוא 69 kDa. בצע Assay רדפורד לקבוע ריכוז חלבון (תשואה אופיינית היא 4 מ"ג / מ"ל ​​לשתי elutions הראשון, אך עשוי להשתנות בהתאם לזן חיידקים ופלסמיד בשימוש).
11. בדוק את הפעילות של כל elution המוליטית (ראה להלן). elutions ברכה בי טוהר, ריכוז והמוליטית פעילות היא משביעי רצון. Slo aliquot בaliquots שימוש יחיד (בדרך כלל 5-10 μl), להקפיא בקרח היבש ולאחסן ב -80 ° C.

2. Assay המוליטית

1. שטוף את תאי דם אדומים (כבשי RBCs) בחיץ RBC Assay (0.3% שור אלבומין (BSA), 2 המ"מ CaCl _2, 10 Hepes מ"מ, pH 7.4), ספין בסל"ד 1200 למשך 5 דקות, וresuspend בRBCs 2.5% ב 10 חיץ Assay RBC מ"ל.
2. הוסף חיץ assay RBC μl 10 / גם בצלחת 96-V-תחתונה גם על קרח. סדרתי לדלל כל elution בשני עותקים. טווחי דילול אופייניים הם 1:1,000 ל1:512,000. כולל 3 בארות ללא רעל ו3 בארות עם 10μl 2% Triton X-100 כבארות מינימום ומקסימום, בהתאמה.
3. כיסוי צלחת ולדגור על 37 מעלות צלזיוס 30 דקות. צנטריפוגה בסל"ד 1200 למשך 5 דקות. העברת 70 μl של supernatant לצלחת שטוחה תחתונה 96 כן. נקראו _405. יחידה אחת היא הדילול של רעל הנדרש לתמוגה 50% מRBCs. פעילות הרעלן הנה יחידת 1 * דילול factor/0.01 מ"ל.

3. Assay התא ממוסס

1. תאי קציר, ספירה, ספין. Resuspend ב2x10 ⁶ / מ"ל במאגר R / B (RPMI עם 2 מ"מ CaCl _2, 0.5% BSA) ו20 מיקרוגרם יודיד / המ"ל propidium. הוסף 100 תאי μl לצלחת גם 96-V-תחתונה.
2. סדרתי לדלל slo ל2x ריכוז סופי במאגר R / B, להוסיף רעל μl 100 או חיץ μl 100 R / B לתאים. דגירת 5 דקות 37 ° C. מגוון טיפוסי סופי ריכוזים מ2000 / מיליליטר U כדי 31.25 U / ml.
3. הפעלת תאים בcytometer זרימה ולאסוף נתונים עם מסננים לphycoerythrin (PE). שינוי-log אחת מייצג cel permeabilized transientlyls תוך שינוי יומן 3 מצביע על תאים מתים ^4. חישוב תמוגה הספציפית של תאים על ידי הפחתת אחוז התאים מתים בשליטה (% PI ^הגבוה _CTL) מ(% _exp PI ^הגבוה) הניסיוני, כדלקמן: תמוגה ספציפית = (% _exp PI ^הגבוה -% PI ^הגבוה _CTL) / (100 -% PI ^הגבוה _CTL) * 100

4. Micropipette משלוח של רעלן לתאים במנות תרבות

1. יום קודם לניסוי, 2x10 ⁵ מקרופאגים צלחת על צלחת מ"מ קולגן מצופת זכוכית תחתונה 35 אחד.
2. הפעל מיקרוסקופ וmicroinjector. לאפשר זמן שלב מחומם כדי לחמם עד 37 מעלות צלזיוס הבחירה של מיקרוסקופ בדרך כלל תלויה במה שהוא באופן מקומי זמין. מיקרוסקופ צריך שלב הפוך, שלב מסוגל לחמם את הכלים עד 37 מעלות צלזיוס, קוביות מסנן עירור / פליטה מתאימות לצבע נבחרים, והמרחב פיזי להתחבר microinjector. עדשת רטרנדהוא מועיל לmicroinjection, אבל לא חובה. מחשב נהיגת מיקרוסקופ צריך מספיק זיכרון כדי לאסוף ולאחסן נתונים.
3. תאי תווית עבור 30 דקות עם צבע ב 37 ° C. בהתאם assay, תיוג יכול להיעשות עם 5 Fura2 μl AM במ"ל PBS 1 או 2 calcein μl AM ב1 מיליליטר תקשורת מלאה. לFura2, עירור / פליטה נאסף עבור 340/510 ננומטר וננומטר 380/510, ואת היחס של 340/380 אותות קובע שטף הסידן. לcalcein, עירור / פליטה הוא ננומטר 495/515 ואילו ethidium homodimer הוא 525/620 ננומטר וAPC הוא 650/660 ננומטר. תוויות אחרות, ניתן לבחור גם כן.
4. שטפו תאים עם PBS ומקום במ"ל RPMI 1 בתוספת 2 מ"מ CaCl _2. ההר במיקרוסקופ.
5. דלל רעל וdextran במים, וצנטריפוגה ב 10 דקות 20000 XG ל4 ° C. בדרך כלל, 1 ו 4 slo μl μl 10 מ"ג / מיליליטר dextran-555 מדוללים במי μl 6. Dextran או מולקולת נוזל שלב נוסף ניאון משמש כדי לוודא שFEMTO טיפ ולא סתום, וinjeCTS כרצוי.
6. טען FEMTO-טיפ אחורי עם 0.07 μl של רעל מדולל באמצעות microloader.
7. טען FEMTO-טיפ על microinjector. התאמת זווית של מזרק כך שהקצה יהיה לשבת מעל מרכז התאים עם המקום לזוז לכל הכיוונים. נקה Z-גבול. הגדרות הזרקה יש להזריק ל0.5 שניות ב 120 psi עם לחץ אחורי psi 20. הנמך קצה עד שזה נכנס לבינוני.
8. השימוש ברטרנד העדשה, מרכז הקצה ובצע את הטיפ שמוריד אותו קרוב יותר לתאים. ברגע שאתה מאבד את המיקוד, לחזור לאופטיקה הנורמלית. צל המחט צריך להיות ברור בתחום. התמקד מעל התאים ולהנמיך את המחט עד שהוא בפוקוס. תתמקד בחזרה על התאים ולהביא את המחט הסמוכה לתא בזהירות. הגדר את Z-הגבול להזרקה. תחל הדמיה, להעביר טיפ למיקום רצוי, להזריק לשחרור רעל בנקודת הזמן הרצוי. הרם את המחט, לעבור לאזור חדש של תאים ולהזריק. העבר מחט לעמדת הבית כדי למנוע כל לא רצוידליפת רעל מהמחט.

Representative Results

בדרך כלל 10 ⁷ -10 ⁸ U / ml slo ניתן להשיג עם ריכוז חלבון של 4 מ"ג / מ"ל. כמות הרעל הדרוש לתמוגה תא משתנית בהתאם לסוג התא, אך היא בדרך כלל 125-500 U / ml slo (איור 2 ב '). סוגי תאים כמו מקרופאגים יכולים להיות עמידים יותר (4000 U / ml) למרות שאחרים (שורות תאים T בעיקר) הם רגישים יותר. רגישויות אלה מתאימות slo הזמין מסחרי. פעילות רעל מפחיתה בערך 2-לקפל בכל הקפאה, הפשרה, מבחנים כך המוליטית עם כל אצווה או הפשרה של רעלן נדרשים כדי לאמת את פעילות רעל. רעל הוא גם רגיש מאוד לחום וחמצון ¹⁰ בהעדר קרומים המכילים כולסטרול, ולכן יש להקפיד בעת עבודה עם החלבון.

Microdelivery של הרעלן מאפשר השוואה של תאים שלא טופלו בתאי רעל שטופלו באותה המנה. הוא גם מספק בקרה פנימית לפעילות רעלן, שכן שיפוע דיפוזיה יהיה established מקצה micropipette. אזורים קרובים לmicropipette יציגו מוות של תאים, מאופיין באובדן calcein וספיגת homodimer ethidium, ואילו אזורים רחוקים יותר מהקצה יציגו שום ניזק (איור 3). בהתחשב בעוצמתו של הרעלן המשמש, כמויות קטנות שדולפות מmicropipette אפילו בנוכחות של לחץ אחורי יכולות להרוס תאים כקצו נע לאורך השדה (איור 3). שימוש באפשרות הבטיחות בmicroinjector יהיה למנוע אובדן זה.

Microdelivery של הרעלן גם מאפשר הבדיקה של אירועים בזמן אמת, כגון שטף סיד (איור 4). שטף זה לא ניתן לצפות בתאים קבועים, ואספקה ​​המקומית של הרעלן מאפשרת לימוד של איך שטף סיד מושרה זה מופץ דרך תרבית תאים. יש להקפיד שלא לפגוע בתאים עם micropipette עצמו, כפי שזה גם יכול לגרום לסידן ¹¹ שטף.

בנוסףלמיקרוסקופיה הסטנדרטית שדה רחב, microdelivery יכול להיות משולב עם מיקרוסקופיה מהירות גבוהה 3D confocal. היתרון של מיקרוסקופ confocal מעל השדה הרחב הוא היכולת לפתור אירועים בZ-הממד ולנתח מטוסים בודדים. עם טכנולוגיות נוכחיות, שימוש בconfocal הדיסק ספינינג הוא הכרחי כדי להשיג את המהירויות הגבוהות דרושות. יתרונות אלה מאפשרים הדמיה של microparticles שהזיל מתאים דנדריטים לאחר הזרקת רעלן (איור 5). microparticles אלה לשפוך כחלק מתהליך התיקון ⁴ הסלולריים. מולקולות רעל מרוכזים בblebs, אשר הזיל לחסל רעל ^4. בלי הדמית confocal, איתור microparticles יהיה קשה, ולהוביל למסקנה שהרעל לא בוטל באופן זה.

איור 1. באופן כלליעבודה להפקה וניצול רעלים בהדמית תא חייה. הרעלן מטוהר, נתון לבקרת איכות קפדנית, ולאחר מכן מועבר באמצעות micropipette לתאים שכותרתו קודם לכן עם צבעי כדאיות, מחווני סיד או נוגדנים לחלבוני שטח. נתונים נרכשים במיקרוסקופ ולאחר מכן נותחו באמצעות תוכנה, כגון Metamorph או אלמנטים.

איור 2. בקרת איכות של המטוהרים slo. () דוגמאות של חיידקים לפני (ט ₀₎ ואחרי ₍₃ T) אינדוקצית רעל, הטיהור הבאה supernatant (S), וכל אחת משלוש elutions (E _{3 1-E)} נפתרו על ידי-PAGE SDS ומוכתם בCoomassie כחול . (ב) בכל מקרה D2 הדנדריטים תא הקו או תא הקו T27A לוקמיה היה תיגר עם ריכוזים שונים של slo למשך 5 דקות על 37 מעלות צלזיוס בנוכחות יודיד propidium ונבחן על ידי cytometry זרימה. תמוגה המסוימת נקבעה על פי הנוסחא הבאה: תמוגה ספציפית = (% _exp PI ^הגבוה -% PI ^הגבוה _CTL) / (100 -% PI ^הגבוה _CTL) * 100

איור 3. מוות של תאים שמוצג על ידי אובדן האות והספיגה של EtBr בfibroblasts עור אדם לאחר חשיפה מקומית לFibroblasts חיידקי הרעלן anthrolysin טו calcein הודגרו עם calcein AM וethidium homodimer באמצעות ערכה מתה חייה מחיים טכנולוגיים. 100 עמ 'של הכולסטרול מחייב רעל anthrolysin O ¹³ (מתנה ממנוחת ד"ר ריצ'רד, אוניברסיטת דרקסל) נמסר על ידי micropipette למרכז צלחת התרבות, ותמונות פלואורסצנציה widefield נאספו באמצעות אובייקטיבי 40X לאחר 30 דקות. תמונות משדות מרובים שולבו כדי ליצור את התמונה המוגדלת מוצגת באמצעות המטרופוליטן אמורפית.

איור 4. זרם סידן לcytosol של תאי דנדריטים אנושיים שנחשפו לslo רעלן של החיידקים. תאים הועמסו עם fura2 AM לפני המסירה של פתרון של slo בריכוז של 80 U / μl וקצב זרימה של 1 nl / דקה. קצה micropipette משמש למשלוח מצוין בשלב 0 באמצעות כוכבית צהובה. תמונות נאספו ברציפות במצב widefield על 340 ו380 אורכי גל עירור ננומטר, והיחס של פליטות ששמשו לקביעת רמות הסידן cytosolic. מעבר מירוק לכחול pseudocolor מצביע על עלייה ברמות הסידן cytosolic. סימן הזמן בכל לוח מציין שניות לאחר תחילת תוספת של הרעלן. סרגל קנה מידה הוא 20 מיקרומטר. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

EP-together.within עמודים = "תמיד">
איור 5. שחרור microvesicles מפני השטח של תאי דנדריטים החשופים לslo. תאים מראש מודגרות עם אנטי CD11c מצומדת לAPC לתייג את קרום הפלזמה, אחרי המסירה של בולוס של U ^-3 3x10 של slo. שחזורי 3-D נוצרו מ- ערימות z confocal שנאספו בכל נקודת זמן מצוין בדקות. קצה microinjector זוהה באמצעות הדמית דסק"ש ומצוין על ידי החץ הצהוב. סרגל קנה מידה הוא 20 מיקרומטר.

Discussion

הטכניקות מתוארות כאן מאפשרים בחינת תגובותיהם של תאי מערכת חיסון לרעלים חיידקיים. השלב הקריטי ביותר הוא הטיפול ומינון של הרעל. פעילות רעלן יכולה להיות שונה מאוד, אפילו בין aliquots השונה של אותו התכשיר, עקב שבירותה. זה מחייב גם בדיקה של כל aliquot של רעל נגד קו או RBCs תא הפניה או באמצעות גרדיאנטים הרעלן. שיפועי רעל, שכנשא micropipette, לאפשר מכלול תחומי פעילות הרעלן המושרית שנצפתה בזמן אמת, אבל לא להשאיל את עצמו לניתוח ביוכימי.

משלוח micropipette של הרעל יכול להיות מאתגר. בניגוד microinjection הסטנדרטי, לעומת זאת, חדירה של התא אינה נדרשת לבדיקה זו. למעשה, יש להקפיד שלא לגרום ניזק לתאים עם המחט עוצמה, כפי שזה יעורר תגובת תיקון קרום דומה ^12. בתאי מערכת חיסוניים, במיוחד, את נתיבי סידן נוצרו על ידימחט קשר יהיה להפיץ באמצעות צינורות לתאים אחרים בתוך התרבות ^11. תאים לא הזרקה גם להאריך את חייו של המחט. כמו כן, שימוש בעדשת רטרנד לעקוב מוצא של המחט לתאים מסיר חוסר ודאות מסוימת במיצוב של micropipette. למרות מחטים פגומות תדלופנה רעל במהירות רבה יותר מאשר מחטים ללא פגע, הם עדיין עשויים לשמש ליצירת תוצאות ראשוניות. המערכת מאפשרת לmicroinjector זריקות מרובות, צריך שיפוע רעל גבוה יותר להיות רצוי. לחלופין, משך הזרקה יכול גם להיות שונה כדי לשנות את המינון נמסר. Microinjector גם מאפשר ניסויים מרובים כדי להתבצע בתוך צלחת אחת. יתר על כן, ההשפעה של rechallenge אפשר ללמוד. למרות שאנו מתארים את הניסויים שבדקו תאי חיסון, שיטות אלה יכולים להיות מותאמות לשורות תאים אחרות גם כן.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ni-NTA agarose	Qiagen	30210
polymixin-agarose	Sigma	P1411-5ML
Zeba Desalt Spin col	Fisher	PI-89891
sheep RBCs	Fisher	50-415-688
pBADgIII-SLO	N/A	N/A	see ref9
Cy5 monoreactive dye	GE Healthcare	PA25001
Fura2-AM	Life Technologies	F1221
Calcein AM/ Ethidium homodimer	Life Technologies	L3224
Anti-CD11c-APC	BD Biosciences	550261
collagen-coated glass-bottom dish	Mattek	P35GCol-1.5-10-C
femto-tip II	Fisher	E5242957000
Microloader	Fisher	E5242956003
dextran Alexa 555	Life Technologies	D34679
Injectman NI 2	Eppendorf	920000029
FemtoJet	Eppendorf	5247 000.013
Table 1. List and source of specific reagents and equipment needed. Specific equipment and reagents used in this protocol, along with company and catalogue number are listed.
Buffer Composition Step Used Lyse/Wash 50 mM NaH2PO4 300 mM NaCl 10 mM imidazole, pH 8.0 1.4 Tris/salt 50 mM Tris, pH 8.0 300 mM NaCl 1.7 Elution buffer 50 mM Tris, pH 8.0 300 mM NaCl 250 mM imidazole 1.8 RBC Assay buffer 0.3% BSA 2 mM CaCl2 10 mM HEPES, pH 7.4 2.1 buffer R/B RPMI cell culture medium 2 mM CaCl2 0.5% BSA 3.1
Table 2. List of buffers used in this protocol. The buffers used, their composition and the first step at which they are used in the protocol are listed.