Summary
रीकॉम्बीनैंट से कोलेस्ट्रॉल बाध्यकारी विष streptolysin हे सफ़ाई के लिए तरीके
Protocol
1. Streptolysin हे के शुद्धीकरण (SLO)
- BL21 सोने की 0.5 एल लेग शोरबा में प्लाज्मिड pBADgIII - SLOhis 9 युक्त कोशिकाओं के 20 मिलीलीटर रातोंरात संस्कृति टीका लगाना और 500 μl 50 मिलीग्राम / एमएल एम्पीसिलीन जोड़ें. 225 rpm पर 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति शेक = 600 आयुध डिपो तक 0.6, आमतौर पर 1.5 घंटा ~. 10,000 XG 5 मिनट में 1 मिलीलीटर बैक्टीरिया (0 टी माना जाता है) अपकेंद्रित्र, 140 μl 1x एसडीएस नमूना बफर / 1 आयुध डिपो में गोली भंग करने और प्रोटीन शुद्धता विश्लेषण के लिए कतरनी डीएनए sonicate.
- 5 मिलीग्राम 20% संस्कृति को arabinose के अलावा साथ बैक्टीरिया पैदा करने के लिए, 3 घंटा के लिए कमरे Temp पर 225 rpm पर हिला. बैक्टीरिया की 1 मिलीग्राम ले लीजिए, अपकेंद्रित्र और 1x एसडीएस नमूना बफर के रूप में टी 3 शुद्धता विश्लेषण के लिए समय बिंदु को भंग करने के लिए ऊपर.
- 500 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र बोतल में शेष बैक्टीरिया ले लीजिए, 12 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस (8500 rpm Sorvall रोटर जीएस 3) में 12,000 XG स्पिन. -80 पर तैरनेवाला, दुकान गोली पसाना ° C रातोंरात या अब अगर जरूरत है.
- Fr Resuspend10 मिलीलीटर में बर्फ पर ozen गोली lyse / बफर धोने (50 मिमी नाह 2 4 पीओ, 300 मिमी NaCl, 10 मिमी imidazole, पीएच 8.0) 400 μl 25% X-100 ट्राइटन 100 μl 100 मिलीग्राम / मिलीलीटर lysozyme, 50 के साथ पूरक μl 200 मिमी phenylmethylsulfonyl फ्लोराइड (PMSF). 50 मिलीलीटर ओक रिज ट्यूब resuspended गोली स्थानांतरण.
- 30 सेकंड के लिए 30 सेकंड के अंतराल के साथ बर्फ पर 5 बार lysate Sonicate. स्पिन +३९,००० XG पर 20 मिनट के लिए 4 ° C (अठारह हज़ार rpm Sorvall एसएस 34 रोटर) में ओक रिज ट्यूब में lysate sonicated.
- जबकि lysate कताई है 1 मिलीग्राम, 10 मिलीग्राम के साथ नी NTA agarose धो lyse / 4 में 5 मिनट के लिए 1200 rpm पर धो बफर और स्पिन ° सी. (सभी आगे washes / elutions इन शर्तों के तहत centrifugation का उपयोग करें). धो लो Aspirate.
- 1.5 कदम से नी NTA agarose बैक्टीरियल तैरनेवाला जोड़ें, 2.5 घंटे के लिए धीरे 4 में हिला डिग्री सेल्सियस स्पिन तैरनेवाला इकट्ठा. तैरनेवाला के 30 μl 10 μ 4x एसडीएस नमूना बफर के साथ मिश्रण है और शुद्धता विश्लेषण के लिए बचाने के लिए. मोती lyse / बफर धोने और 4 बार धोएं/ Tris नमक बफर (50 मिमी Tris, 300 मिमी NaCl, पीएच 8.0) CE.
- मोती 1 मिलीलीटर क्षालन बफर (250 मिमी Tris / नमक बफर में imidazole) और 5 μl 1 एम dithiothreitol (डीटीटी) जोड़ने, 10 मिनट के लिए बर्फ पर incubating, कताई और तैरनेवाला इकट्ठा द्वारा 3 बार Elute. SLO एक प्रोटीन बहुत redox के प्रति संवेदनशील है, और सभी समय पर बर्फ पर रखा जाना चाहिए. एक बार कम है, प्रोटीन तेजी से अपनी गतिविधि खो अगर समय की एक छोटी अवधि के लिए भी 37 डिग्री सेल्सियस, गरम जाएगा.
- क्षालन बफर, स्पिन में 500 μl polymixin संयुग्मित agarose 4 में 1 मिनट के लिए 10,000 XG पर धो डिग्री सेल्सियस और 500 μl में resuspend. Endotoxin खलाना, प्रत्येक क्षालन 200 μl मोती जोड़ सकते हैं और 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस हिला. 1 मिनट में 4 डिग्री सेल्सियस, और सतह पर तैरनेवाला बचाने के लिए 10,000 XG पर स्पिन. प्रत्येक क्षालन के 30 μl 10 μl एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण के लिए 4x एसडीएस नमूना बफर के साथ जुडा है.
- एसडीएस पृष्ठ द्वारा elutions की शुद्धता का परीक्षण करें. उबाल लें नमूने 95 डिग्री सेल्सियस पर जेल के विश्लेषण के लिए 5 मिनट के लिए और एक 10% जेल पर लोड 10 μl बचाया. जीई दागCoomassie साथ एल प्रोटीन कल्पना (2A चित्रा). SLO 69 केडीए है. ब्रैडफोर्ड प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण (ठेठ उपज 4 मिलीग्राम / मिलीलीटर पहले दो elutions के लिए है, लेकिन बैक्टीरियल तनाव और प्लाज्मिड प्रयोग किया जाता द्वारा भिन्न हो सकते हैं) परख प्रदर्शन.
- प्रत्येक क्षालन में hemolytic गतिविधि (देखें नीचे) का परीक्षण करें. पूल elutions जहां शुद्धता, एकाग्रता, और रक्तलायी गतिविधि संतोषजनक रहे हैं. एकल उपयोग aliquots (आमतौर पर 5-10 μl) में अशेष भाजक SLO, सूखी बर्फ और -80 पर दुकान डिग्री सेल्सियस पर स्थिर
2. Hemolytic परख
- आरबीसी परख बफर (0.3% गोजातीय सीरम albumin (BSA), 2 मिमी 2 CACL, 10 मिमी HEPES, पीएच 7.4), 5 मिनट के लिए 1200 rpm पर स्पिन में धो भेड़ लाल रक्त कोशिकाओं (RBCs) में 2.5% लाल रक्त कोशिकाओं में resuspend 10 मिलीलीटर आरबीसी परख बफर.
- 10 μl आरबीसी परख बफर / 96-अच्छी तरह से बर्फ पर वी के नीचे प्लेट में अच्छी तरह से जोड़ें. Serially दो प्रतियों में प्रत्येक क्षालन को कमजोर. ठेठ कमजोर पड़ने पर्वतमाला 1:1,000 1:512,000 हैं. 10 के साथ कोई विष के साथ 3 कुओं और 3 कुओं शामिलμl 2% न्यूनतम और अधिकतम कुओं के रूप में X-100, क्रमशः ट्राइटन.
- थाली और सेते कवर 37 ° C 30 मिनट. 5 मिनट के लिए 1200 rpm पर अपकेंद्रित्र. एक फ्लैट नीचे 96 अच्छी तरह से थाली तैरनेवाला के 70 μl स्थानांतरण. एक 405 पढ़ें. एक इकाई विष के कमजोर पड़ने लाल रक्त कोशिकाओं के 50% lysis के लिए आवश्यक है. विष गतिविधि इकाई 1 * कमजोर पड़ने factor/0.01 मिलीलीटर है.
3. सेल lytic परख
- हार्वेस्ट कोशिकाओं, गिनती, स्पिन. 2x10 में Resuspend बफर में 6 मिलीग्राम / / आर एंड बी (2 मिमी के साथ RPMI CACL 2, 0.5% BSA) और 20 ग्राम / मिलीलीटर propidium आयोडाइड. एक 96 अच्छी तरह से थाली वी के नीचे 100 μl कोशिकाओं जोड़ें.
- Serially SLO पतला बफर / आर एंड बी में अंतिम एकाग्रता 2x, कोशिकाओं को में 100 μl विष या 100 μl बफर / आर एंड बी जोड़ने. सेते हैं 5 मिनट 37 डिग्री सेल्सियस ठेठ अंतिम सांद्रता रेंज 2000 से 31.25 यू मिलीग्राम / यू / एमएल.
- प्रवाह cytometer कोशिकाओं पर चलाने के लिए और phycoerythrin के लिए फिल्टर (पीई) के साथ डेटा इकट्ठा. एक बदलाव एक लॉग transiently permeabilized cel का प्रतिनिधित्व करता हैरास जबकि एक 3 लॉग बदलाव मृत कोशिकाओं 4 इंगित करता है. प्रयोगात्मक (% PI उच्च ऍक्स्प) से नियंत्रण में मृत कोशिकाओं का प्रतिशत (% PI उच्च सीटीएल) subtracting द्वारा कोशिकाओं के विशिष्ट lysis की गणना, के रूप में इस प्रकार है: विशिष्ट lysis = (% PI उच्च ऍक्स्प% PI उच्च सीटीएल) / (100% PI उच्च सीटीएल) * 100
4. विष की संस्कृति बर्तन में कोशिकाओं को डिलिवरी micropipette
- एक दिन पहले प्रयोग, थाली 2x10 एक कोलेजन लेपित गिलास नीचे 35 मिमी पकवान पर 5 मैक्रोफेज.
- खुर्दबीन और microinjector पर चालू. गर्म चरण समय 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करने की अनुमति माइक्रोस्कोप के चुनाव आमतौर पर क्या स्थानीय स्तर पर उपलब्ध है पर निर्भर करता है. खुर्दबीन एक औंधा मंच की जरूरत है, एक मंच पर 37 व्यंजन हीटिंग के लिए सक्षम डिग्री सेल्सियस, / उत्तेजना उत्सर्जन फिल्टर चुना डाई, और अंतरिक्ष शारीरिक microinjector कनेक्ट करने के लिए उपयुक्त cubes. एक बर्ट्रेंड लेंसmicroinjection के लिए उपयोगी है, लेकिन जरूरी नहीं है. खुर्दबीन ड्राइविंग कंप्यूटर पर्याप्त स्मृति करने के लिए इकट्ठा की जरूरत है और डाटा स्टोर.
- डाई के साथ 30 मिनट के लिए 37 पर लेबल कोशिकाओं डिग्री सेल्सियस परख पर निर्भर करता है, लेबलिंग 5 μl Fura2 एक मिलीलीटर पीबीएस या दो μl calcein AM एक मिलीलीटर पूरा मीडिया में के साथ किया जा सकता है. Fura2 के लिए, 340/510 एनएम और 380/510 एनएम / उत्तेजना उत्सर्जन के लिए एकत्र किया जाता है, और 340/380 संकेतों के अनुपात कैल्शियम प्रवाह निर्धारित करता है. Calcein / उत्तेजना उत्सर्जन 495/515 एनएम है जबकि ethidium homodimer / 620 525 एनएम और APC 650/660 एनएम है. अन्य लेबल के रूप में अच्छी तरह से चुना जा सकता है.
- 1 मिलीग्राम RPMI में PBS और जगह के साथ कोशिकाओं धोयें 2 मिमी 2 CACL के साथ पूरक. माइक्रोस्कोप पर माउंट.
- 20,000 XG 10 मिनट में 4 डिग्री सेल्सियस के लिए विष और पानी में dextran, और अपकेंद्रित्र पतला आमतौर पर, 1 μl SLO और 4 μl 10 मिलीग्राम / एमएल dextran 555 6 μl पानी में पतला है. Dextran या एक और फ्लोरोसेंट अणु द्रव चरण सत्यापित करने के लिए प्रयोग किया जाता है कि femto टिप नहीं भरा हुआ है, और injects के रूप में वांछित.
- Femto-टिप लोड पीछे से पतला विष का उपयोग कर एक microloader 0.07 μl के साथ.
- Microinjector femto की नोक पर लोड. इंजेक्टर का कोण समायोजित करें ताकि नोक पर सभी दिशाओं में स्थानांतरित करने के लिए कमरे के साथ कोशिकाओं के बीच बैठेंगे. Z सीमा साफ़. इंजेक्शन सेटिंग्स 120 साई में 0.5 सेकंड के लिए किया जाना चाहिए 20 साई वापस दबाव के साथ इंजेक्शन. टिप कम जब तक यह माध्यम में प्रवेश करती है.
- बर्ट्रेंड लेंस केंद्र, टिप का उपयोग और टिप का पालन के रूप में यह कोशिकाओं को करीब उतारा है. एक बार जब आप ध्यान खो देते हैं, सामान्य प्रकाशिकी वापस स्विच. सुई छाया क्षेत्र में स्पष्ट होना चाहिए. कोशिकाओं के ऊपर फोकस और सुई कम जब तक यह ध्यान में है. कोशिकाओं पर वापस फोकस और ध्यान से एक सेल के निकट सुई लाने. Z इंजेक्शन के लिए सीमा निर्धारित करें. इमेजिंग शुरू, इच्छित स्थान पर टिप चाल, वांछित समय बिंदु पर विष जारी इंजेक्षन. सुई उठाएँ, कोशिकाओं के एक नए क्षेत्र के लिए ले जाने के लिए और इंजेक्षन. घर की स्थिति के लिए सुई को स्थानांतरित करने के लिए किसी भी अवांछित रोकासुई से विष रिसाव.
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Representative Results
10 आमतौर पर 7 -10 8 यू / मिलीलीटर SLO 4 मिलीग्राम / एमएल के एक प्रोटीन एकाग्रता के साथ प्राप्त किया जा सकता है. विष की सेल के लिए आवश्यक राशि कोशिका प्रकार से भिन्न होता है, लेकिन आम तौर पर है यू 125-500 मिलीग्राम / SLO (चित्रा 2B). मैक्रोफेज तरह सेल प्रकार के और अधिक प्रतिरोधी (4000 यू / मिलीलीटर) हालांकि दूसरों (खासकर टी सेल लाइनों) और अधिक संवेदनशील हैं कर सकते हैं. इन संवेदनशीलता को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध SLO साथ अनुरूप हैं. विष गतिविधि लगभग प्रत्येक फ्रीज पिघलना के साथ 2 गुना कम हो जाती है, या विष के प्रत्येक बैच पिघलना साथ रक्तलायी assays विष गतिविधि को सत्यापित करने की जरूरत है. विष भी बहुत और कोलेस्ट्रॉल युक्त झिल्ली के अभाव में 10 ऑक्सीकरण गर्मी के प्रति संवेदनशील है, तो ध्यान जब प्रोटीन के साथ काम कर लिया जाना चाहिए.
विष के Microdelivery एक ही थाली में विष का इलाज कोशिकाओं के साथ अनुपचारित कोशिकाओं की तुलना की अनुमति देता है. यह भी विष गतिविधि के लिए एक आंतरिक नियंत्रण प्रदान करता है, के बाद से एक प्रसार ढाल स्थापित होगाmicropipette टिप से lished. Micropipette के करीब क्षेत्र कोशिका मृत्यु दिखाई देगा, calcein घटाने और ethidium homodimer तेज द्वारा typified, जबकि आगे सिरे से दूर क्षेत्रों में कोई नुकसान (3 चित्रा) दिखा देंगे. इस्तेमाल विष की शक्ति को देखते हुए, छोटी मात्रा है कि वापस दबाव की उपस्थिति में भी micropipette से रिसाव की कोशिकाओं को नष्ट करने के रूप में टिप क्षेत्र (चित्रा 3) के साथ ले जाया जाता है. Microinjector पर सुरक्षा विकल्प का उपयोग इस नुकसान से बचने जाएगा.
विष के Microdelivery भी कैल्शियम प्रवाह के रूप में वास्तविक समय की घटनाओं, (4 चित्रा) की परीक्षा की अनुमति देता है. इस प्रवाह निश्चित कोशिकाओं में मनाया नहीं कर सकते हैं, और विष के स्थानीयकृत प्रसव कैसे इस प्रेरित कैल्शियम प्रवाह एक सेल संस्कृति के माध्यम से प्रचारित किया है अध्ययन परमिट. देखभाल micropipette के साथ ही कोशिकाओं घायल नहीं लिया जाना चाहिए, क्योंकि यह भी कैल्शियम 11 प्रवाह पैदा कर सकते हैं.
इसके अलावामानक व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोपी, microdelivery उच्च गति 3 डी confocal माइक्रोस्कोपी के साथ जोड़ा जा सकता है. व्यापक क्षेत्र पर एक confocal खुर्दबीन का लाभ z आयाम में घटनाओं को हल करने के लिए और व्यक्ति विमानों का विश्लेषण करने की क्षमता है. मौजूदा प्रौद्योगिकियों के साथ, कताई डिस्क confocal का उपयोग करने के लिए उच्च गति की जरूरत को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है. ये लाभ विष इंजेक्शन (5 चित्रा) के बाद वृक्ष के समान कोशिकाओं से शेड microparticles के दृश्य की अनुमति. इन microparticles सेलुलर मरम्मत की प्रक्रिया 4 का हिस्सा के रूप में बहा रहे हैं. विषैला अणुओं blebs, है जो 4 विष को खत्म करने के लिए बहा रहे हैं पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं. Confocal इमेजिंग के बिना, पता लगाने microparticles मुश्किल हो सकता है, और संभावित निष्कर्ष है कि विष इस तरीके से नहीं समाप्त हो रहा है करने के लिए नेतृत्व.
चित्रा 1 कुल मिलाकर.सृजन और जीना सेल इमेजिंग में विषाक्त पदार्थों का उपयोग करने के लिए कार्यप्रवाह. विष शुद्ध है, कठोर गुणवत्ता नियंत्रण के अधीन करने के लिए है, और फिर कोशिकाओं है कि पहले किया गया है व्यवहार्यता रंजक, कैल्शियम संकेतक सतह प्रोटीन या एंटीबॉडी के साथ लेबल micropipette के माध्यम से दिया. डेटा खुर्दबीन पर हासिल कर ली है और फिर Metamorph या तत्वों के रूप में इस तरह के सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण किया.
चित्रा 2 शुद्ध SLO की गुणवत्ता नियंत्रण. (ए) (0 टी) पहले बैक्टीरिया के नमूने और बाद विष (टी 3) प्रेरण, तैरनेवाला निम्नलिखित शुद्धि (एस), और प्रत्येक तीन elutions (ई 3 1 - ई) के एसडीएस पृष्ठ और दाग द्वारा Coomassie नीले रंग के साथ हल कर रहे थे . (बी) या तो वृक्ष के समान सेल लाइन D2 या लेकिमिया सेल लाइन T27A 5 मिनट के लिए SLO के विभिन्न सांद्रता के साथ 37 डिग्री सेल्सियस में चुनौती दी थी और propidium आयोडाइड की उपस्थिति मेंप्रवाह cytometry द्वारा जांच की. / (100% PI उच्च सीटीएल) 100 * विशिष्ट lysis = (% PI उच्च सीटीएल% PI उच्च ऍक्स्प): विशिष्ट lysis निम्नलिखित सूत्र द्वारा निर्धारित किया गया था
चित्रा 3 सेल calcein संकेत और बैक्टीरिया विष anthrolysin ओ Fibroblasts स्थानीयकृत प्रदर्शन के बाद मानव त्वचीय fibroblasts में EtBr के तेज की हानि से दिखाया मौत calcein AM और ethidium homodimer के साथ incubated रहे थे जीवन टेक्नोलॉजीज से एक जीवित मृत किट का उपयोग कर. कोलेस्ट्रॉल बाध्यकारी विष anthrolysin 13 हे (डॉ. रिचर्ड रेस्ट, Drexel विश्वविद्यालय से एक उपहार) के 100 स्नातकोत्तर micropipette द्वारा संस्कृति डिश के केंद्र में दिया गया था, और widefield प्रतिदीप्ति छवियों 30 मिनट के बाद एक 40x उद्देश्य का उपयोग कर एकत्र. कई क्षेत्रों से छवियाँ बड़ा मेट का उपयोग कर दिखाया छवि उत्पन्न करने के लिए संयुक्त थेamorph.
चित्रा 4 मानव वृक्ष के समान बैक्टीरियल विष SLO उजागर कोशिकाओं की cytosol में कैल्शियम बाढ़. SLO का एक समाधान के 80 यू / μl और 1 nl / मिनट की एक प्रवाह दर के एक एकाग्रता में प्रसव से पहले कोशिकाओं fura2 AM साथ भरी हुई थी. प्रसव के लिए इस्तेमाल micropipette की नोक 0 समय में एक पीले रंग की तारक ने संकेत दिया है. छवियाँ लगातार widefield मोड में एकत्र किए गए थे, 340 और 380 एनएम उत्तेजना तरंगदैर्य पर और साइटोसोलिक कैल्शियम के स्तर को निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता उत्सर्जन का अनुपात. हरे रंग से नीले pseudocolor Shift साइटोसोलिक कैल्शियम के स्तर में वृद्धि हुई है इंगित करता है. प्रत्येक पैनल में समय निशान विष के अलावा शुरुआत के बाद सेकंड इंगित करता है. स्केल बार 20 सुक्ष्ममापी है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 5 SLO उजागर करने के लिए वृक्ष के समान कोशिकाओं की सतह से microvesicles की रिहाई. कोशिकाओं रहे थे विरोधी CD11c APC संयुग्मित प्लाज्मा झिल्ली, SLO की 3x10 -3 यू के एक सांस की डिलीवरी के बाद लेबल के साथ पूर्व incubated. 3-D पुनर्निर्माण confocal प्रत्येक मिनट में संकेत बिंदु पर एकत्र z-ढेर से उत्पन्न किया गया. microinjector की नोक डीआईसी इमेजिंग का उपयोग पहचान की थी और पीले तीर द्वारा संकेत है. स्केल बार 20 सुक्ष्ममापी है.
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Discussion
तकनीक यहाँ वर्णित जीवाणु विषाक्त पदार्थों को प्रतिरक्षा कोशिकाओं की प्रतिक्रियाओं की परीक्षा के लिए अनुमति देते हैं. सबसे महत्वपूर्ण कदम से निपटने और विष के dosing है. विष गतिविधि अत्यंत चर उसी तैयारी के विभिन्न aliquots, अपनी कमजोरी के कारण के बीच भी हो सकता है. यह जरूरी है कि या तो एक संदर्भ सेल लाइन या लाल रक्त कोशिकाओं के खिलाफ विष के प्रत्येक अशेष भाजक परीक्षण या विष gradients का उपयोग. विष gradients, micropipette द्वारा दिया, विष से प्रेरित करने के लिए वास्तविक समय में देखा जा गतिविधियों की पूर्ण स्पेक्ट्रम की अनुमति है, लेकिन जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए खुद को उधार नहीं करता है नहीं.
विष के micropipette वितरण चुनौतीपूर्ण हो सकता है. मानक microinjection के विपरीत, तथापि, इस परख के लिए सेल के प्रवेश की आवश्यकता नहीं है. वास्तव में, देखभाल करने के लिए सुई के साथ ही कोशिकाओं को नुकसान नहीं है, के रूप में यह एक समान झिल्ली की मरम्मत 12 प्रतिक्रिया बटोर लिया जाना चाहिए. प्रतिरक्षा कोशिकाओं में, विशेष रूप से, कैल्शियम फलाक्सेस द्वारा उत्पन्नसुई संपर्क 11 संस्कृति के भीतर अन्य कोशिकाओं के लिए नैनोट्यूब के माध्यम से प्रचार करेंगे. नहीं इंजेक्शन लगाने कोशिकाओं को भी सुई के जीवनकाल का विस्तार होगा. इसी तरह, एक बर्ट्रेंड लेंस का उपयोग करने के लिए कोशिकाओं को सुई वंश का पालन micropipette की स्थिति में कुछ अनिश्चितता को हटा. हालांकि क्षतिग्रस्त सुइयों विष बरकरार सुइयों से अधिक तेजी से रिसाव हो जाएगा, वे अभी भी प्रारंभिक परिणाम उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. microinjector प्रणाली की अनुमति देता है कई इंजेक्शन के लिए, एक उच्च विष ढाल वांछित किया जाना चाहिए. वैकल्पिक रूप से, इंजेक्शन अवधि भी वितरित खुराक में परिवर्तन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है. microinjector भी कई प्रयोगों एक डिश के भीतर निष्पादित करने की अनुमति देता है. इसके अलावा, rechallenge के प्रभाव का अध्ययन किया जा सकता है. हालांकि हम प्रतिरक्षा कोशिकाओं की जांच के प्रयोगों का वर्णन है, इन तरीकों अन्य सेल लाइनों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है के रूप में अच्छी तरह से.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
लेखकों के लिए उदार उपहार के लिए तकनीकी सहायता के लिए SLO प्लाज्मिड और Jonathon फ्रैंक्स के anthrolysin हे, माइकल Caparon के उदार उपहार के लिए रिचर्ड रेस्ट धन्यवाद देना चाहूंगा. यह काम NIH अनुदान T32CA82084 (पाक), और R01AI072083 (RDS) द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||||||
| Ni-NTA agarose | Qiagen | 30210 | |||||||||||||||||||
| polymixin-agarose | Sigma | P1411-5ML | |||||||||||||||||||
| Zeba Desalt Spin col | Fisher | PI-89891 | |||||||||||||||||||
| sheep RBCs | Fisher | 50-415-688 | |||||||||||||||||||
| pBADgIII-SLO | N/A | N/A | see ref9 | ||||||||||||||||||
| Cy5 monoreactive dye | GE Healthcare | PA25001 | |||||||||||||||||||
| Fura2-AM | Life Technologies | F1221 | |||||||||||||||||||
| Calcein AM/ Ethidium homodimer | Life Technologies | L3224 | |||||||||||||||||||
| Anti-CD11c-APC | BD Biosciences | 550261 | |||||||||||||||||||
| collagen-coated glass-bottom dish | Mattek | P35GCol-1.5-10-C | |||||||||||||||||||
| femto-tip II | Fisher | E5242957000 | |||||||||||||||||||
| Microloader | Fisher | E5242956003 | |||||||||||||||||||
| dextran Alexa 555 | Life Technologies | D34679 | |||||||||||||||||||
| Injectman NI 2 | Eppendorf | 920000029 | |||||||||||||||||||
| FemtoJet | Eppendorf | 5247 000.013 | |||||||||||||||||||
Table 1. List and source of specific reagents and equipment needed. Specific equipment and reagents used in this protocol, along with company and catalogue number are listed. |
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Table 2. List of buffers used in this protocol. The buffers used, their composition and the first step at which they are used in the protocol are listed. |
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References
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