Summary
Os métodos para a purificação do colesterol de ligação da toxina a partir de estreptolisina O recombinante
Abstract
Toxinas bacterianas ligar ao colesterol em membranas, formando poros que permitem o vazamento do conteúdo celular e influxo de materiais a partir do ambiente externo. A célula pode recuperar-se este insulto, o que requer processos de reparação activos de membrana, ou morrem, dependendo da quantidade de exposição a uma toxina e tipo de célula 1. Além disso, estas toxinas induzir fortes respostas inflamatórias em hospedeiros infectados através da activação de células imunitárias, incluindo macrófagos, que produzem uma variedade de citocinas pró-inflamatórias 2. Muitas bactérias Gram-positivas produzem toxinas colesterol vinculativos que foram mostrados para contribuir para a sua virulência através de mecanismos largamente descaracterizados.
Alterações morfológicas na membrana plasmática das células expostas a estas toxinas incluem a sua sequestração em saliências colesterol enriquecidas de superfície, que podem ser derramadas para o espaço extracelular, sugerindo uma defesa celular intrínsecomecanismo de 3,4. Este processo ocorre em todas as células na ausência de actividade metabólica, e pode ser visualizada usando EM após 4 a fixação química. Em células do sistema imunológico, tais como os macrófagos, que medeiam a inflamação em resposta a exposição a uma toxina, vesículas de membrana induzidas são sugeridos para conter citocinas da família IL-1, e pode ser responsável tanto para o derramamento de toxinas e disseminação destas citoquinas pró-inflamatórias 5,6,7. A ligação entre a IL-1β libertação e um tipo específico de morte celular, denominado pyroptosis tem sido sugerido, como ambos os processos são dependentes da caspase-1 8. Para resolver as complexidades desta resposta de macrófagos, que inclui a ligação da toxina, o derramamento de vesículas de membrana, a libertação de citoquinas, e da morte de células potencialmente, desenvolvemos técnicas de etiquetagem e de métodos de microscopia de fluorescência que permitem a visualização em tempo real da toxina de células-interacções, incluindo medidas de disfunção e morte (Figura 1). Usarde imagens de células vivas é necessária devido às limitações das outras técnicas. Abordagens bioquímicas não pode resolver os efeitos que ocorrem em células individuais, ao passo que a citometria de fluxo não oferece alta resolução, a visualização em tempo real das células individuais. Os métodos descritos aqui podem ser aplicados a análise cinética de respostas induzidas por estímulos que envolvem complexos alterações fenotípicas em células.
Protocol
1. Purificação de Estreptolisina O (SLO)
- Inocular 20 mL de cultura durante a noite de células BL21 contendo ouro pBADgIII-SLOhis plasmídeo 9 em 0,5 L de caldo LB e adicionar 500 ul de 50 mg / ml de ampicilina. Agitar a cultura a 225 rpm a 37 ° C até DO600 = 0,6, geralmente ~ 1,5 horas. Centrifugar 1 ml (bactérias consideradas T 0) a 10.000 xg 5 min, dissolver o granulado em 140 ul de tampão de amostra SDS 1x / 1 OD e sonicar a DNA de cisalhamento para análise de pureza da proteína.
- Induzir bactérias, com a adição de 5 ml de 20% de arabinose a cultura, agitar a 225 rpm à temperatura ambiente durante 3 hr. Colete 1 ml de cultura bacteriana, centrifugar e dissolver em 1x tampão de amostra de SDS como acima para T de tempo 3 para análise de pureza.
- Recolher as bactérias remanescentes no frasco de 500 ml de centrífuga, girar 12000 xg durante 12 min a 4 ° C (8.500 rpm rotor Sorvall GS-3). Decantar o sobrenadante, armazenar pelete a -80 ° C durante a noite ou mais tempo, se necessário.
- Ressuspender o frozen pellet em gelo em 10 ml de Lise / O tampão de lavagem (50 mM de NaH 2 PO 4, 300 mM NaCl, 10 mM de imidazole, pH 8,0) suplementado com 400 ul de 25% de Triton X-100, 100 uL de 100 mg / ml de lisozima, 50 200 ul mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF). Transferir o sedimento ressuspenso para tubo de 50 ml de Ridge Oak.
- Sonicar lisado 5 vezes durante 30 segundos em gelo, com intervalos de 30 seg. Spin-lisado sonicado em carvalho cume tubo a 39.000 xg durante 20 min a 4 ° C (18.000 rpm Sorvall SS-34 rotor).
- Enquanto o lisado está girando, lave 1 ml de Ni-NTA agarose com 10 ml de Lise / tampão de lavagem e centrifugação a 1.200 rpm durante 5 min a 4 ° C. (Todas as lavagens adicionais / eluições utilizar a centrifugação sob estas condições). Aspirar lavar.
- Adicionar sobrenadante bacteriano a partir do passo 1.5 a Ni-NTA agarose, agitar durante 2,5 horas a 4 ° C. Gire para recolher o sobrenadante. Combine 30 ul de sobrenadante com 10 tampão de amostra μ 4x SDS e salvar para análise de pureza. Lavar as pérolas 4 vezes em Lyse / tampão de lavagem e emce em Tris / sal tampão (50 mM Tris, 300 mM NaCl, pH 8,0).
- Eluir 3 vezes por adição de 1 ml de tampão de eluição (250 mM de imidazole em Tris / tampão salino) e 5 ul de 1 M de ditiotreitol (DTT) a grânulos, incubação em gelo durante 10 min, centrifugação e recolhendo o sobrenadante. SLO é uma proteína muito sensível redox, e devem ser mantidos em gelo em todos os momentos. Uma vez reduzida, a proteína perderá rapidamente a sua actividade, se aquecido a 37 ° C, mesmo durante um curto período de tempo.
- Lave 500 ul polimixina-conjugado de agarose em tampão de eluição, rotação a 10000 xg durante 1 min a 4 ° C e ressuspender em 500 ul. Para esgotar endotoxina, adicionar 200 ul de contas de cada eluição e agitar 4 ° C durante 30 min. Centrifugação a 10000 xg durante 1 min a 4 ° C, e guardar o sobrenadante. Combinar 30 ul de cada um de eluição com tampão de amostra de 10 ul 4x SDS para SDS-PAGE análise.
- Testar a pureza de eluições por SDS-PAGE. Ferver as amostras guardadas para análise em gel a 95 ° C durante 5 min e 10 ul de carga sobre um gel a 10%. Mancha gel com Coomassie para visualizar proteína (Figura 2A). SLO é de 69 kDa. Executar um ensaio de Bradford para a determinação da concentração de proteína (rendimento típico é de 4 mg / ml para os primeiros dois eluições, mas pode variar de acordo com estirpe bacteriana e do plasmídeo utilizado).
- Testar a actividade hemolítica de cada eluição (ver abaixo). Eluições piscina onde a atividade de concentração, pureza e hemolítica são satisfatórios. SLO alíquota em alíquotas de utilização única (ul tipicamente 5-10), em gelo seco congelar e armazenar a -80 ° C.
2. Ensaio hemolítico
- Lavar glóbulos vermelhos de ovelha (RBC) em RBC tampão de ensaio (0,3% de albumina de soro bovino (BSA), 2 mM de CaCl2, 10 mM de Hepes, pH 7,4), centrifugação a 1.200 rpm durante 5 min, e ressuspender em 2,5% em RBCs 10 ml de tampão de ensaio RBC.
- Adicionar 10 ul de tampão de ensaio RBC / poço em placas de 96 poços de fundo em V de gelo. Série diluir cada eluição em duplicata. Gamas de diluição típicos são de 1:1.000 1:512,000. Incluem 3 poços sem toxina e 3 com 10 poçosul de Triton X-2% 100 como poços mínimo e máximo, respectivamente.
- Cobrir a placa e incubar a 37 ° C 30 min. Centrifugar a 1200 rpm durante 5 min. Transferir 70 uL de sobrenadante para uma placa de fundo plano de 96 poços. Leia A 405. Uma unidade é a diluição da toxina necessária para a lise de 50% dos glóbulos vermelhos. Atividade toxina é uma unidade * diluição factor/0.01 ml.
3. Ensaio de célula Lytic
- Células de colheita, a contagem, spin. Ressuspender a 2x10 6 / ml em tampão de R / B (RPMI com CaCl2 2 mM, BSA 0,5%) e 20 ug / ml de iodeto de propídio. Adicionar 100 ul de células de uma placa de 96 poços de fundo em V.
- Seriadamente diluído SLO para 2x a concentração final em tampão de R / B, adicionar 100 ul de toxina ou 100 ul de tampão P / B às células. Incubar 5 min a 37 ° C. Gama típica de concentrações finais de 2,000 U / ml para 31,25 U / mL.
- Executar células em citômetro de fluxo e recolher dados com filtros de ficoeritrina (PE). Uma mudança de um log-cel representa transitoriamente permeabilizadasls, enquanto um desvio de log 3 indica as células mortas 4. Calcula-se a lise específica de células, subtraindo a percentagem de células mortas no controlo (% PI elevado ctl) a partir da (exp% PI elevado) experimental, como se segue: a lise específica = (% exp PI elevado -% PI elevado ctl) / (100 -% PI elevado ctl) * 100
4. Micropipeta Entrega de Toxina de células em placas de cultura
- Um dia antes da experiência, placa 2x10 5 macrófagos em um colágeno revestido prato milímetros com fundo de vidro-35.
- Ligue microscópio e microinjetor. Permitir tempo fase aquecida a aquecer até 37 ° C. A escolha do microscópio geralmente depende do que está localmente disponível. O microscópio de fase invertida precisa de uma, uma fase capaz de aquecer os pratos a 37 ° C, os cubos de excitação / emissão de filtro apropriadas para o corante escolhido, e o espaço de ligar fisicamente o microinjector. Uma lente Bertrandé útil para a micro-injecção, mas não exigida. O computador dirigir o microscópio precisa de memória suficiente para coletar e armazenar dados.
- Células do rótulo para 30 min com corante, a 37 ° C. Dependendo do ensaio, etiquetagem pode ser feita com 5 uL Fura2 AM em 1 ml de PBS ou 2 ul de calceína AM em 1 ml de meio completo. Para Fura2, excitação / emissão é recolhida para 340/510 nm e 380/510 nm e a razão de 340/380 determina os sinais de fluxo de cálcio. Para calceína, excitação / emissão é 495/515 nm, enquanto etídio homodímero é 525/620 nm e APC é 650/660 nm. Outros rótulos podem ser escolhidos também.
- Lavar as células com PBS e colocar em 1 ml de RPMI suplementado com 2 mM de CaCl 2. Montar em microscópio.
- Diluir a toxina e o dextrano em água e centrifugar a 20000 xg durante 10 min 4 ° C. Tipicamente, uma SLO ul e 4 uL de 10 mg / ml de dextrano-555 é diluído em 6 ul de água. Dextrano ou outra molécula de fase fluida fluorescente é usado para verificar que o femto-ponta não estiver obstruído, e injects, como desejado.
- Carregar femto ponta da parte traseira com 0,07 ul de toxina diluída utilizando uma microloader.
- Carregar femto-ponta na microinjetor. Ajustar o ângulo do injector de modo a que a ponta se sentar sobre o centro das células, com espaço para se mover em todas as direções. Limpar z-limite. Configurações de injeção deve ser para injetar 0,5 segundos a 120 psi com pressão de 20 psi de volta. Diminuir ponta até que entra no meio.
- Usando a lente Bertrand, centro da ponta e seguem a ponta, uma vez que é reduzida mais perto das células. Depois de perder o foco, voltar a ótica normais. A sombra da agulha deve ser aparente no campo. Concentre-se as células acima e abaixe a agulha até que esteja em foco. Concentre-se novamente as células e cuidadosamente trazer a agulha adjacente a uma célula. Definir o z-limite para a injeção. Iniciar imaging, mover a ponta para a posição desejada, injectar a libertar a toxina no ponto de tempo desejado. Levante a agulha, passar para uma nova região de células e injectar. Mover agulha para a posição inicial para evitar indesejadavazamento toxina da agulha.
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Representative Results
Tipicamente 10 7 -10 8 U / ml SLO pode ser obtida com uma concentração de proteína de 4 mg / ml. A quantidade de toxina necessária para a lise das células varia com o tipo de célula, mas é geralmente 125-500 U / ml SLO (Figura 2B). Tipos de células, como os macrófagos podem ser mais resistentes (4000 U / ml), embora outras linhas de células (especialmente T) são mais sensíveis. Estas sensibilidades corresponder com SLO comercialmente disponível. A actividade da toxina diminui cerca de 2 vezes com cada um de congelamento-descongelamento, para que os ensaios de hemólise com cada lote ou descongelamento de toxina são necessárias para determinar a actividade da toxina. A toxina é muito sensível ao calor e à oxidação 10, na ausência de membranas contendo colesterol, assim deve ser tomado cuidado quando se trabalha com a proteína.
Microdelivery da toxina permite a comparação de células não tratadas com toxina em células tratadas com o mesmo prato. Ele também proporciona um controlo interno para a actividade da toxina, uma vez que um gradiente de difusão será estabelecido a partir da ponta micropipeta. Regiões próximas da micropipeta mostrará a morte celular, caracterizada pela perda de calceína homodímero de etídio e absorção, ao passo que as regiões mais afastadas da ponta vai mostrar nenhum dano (Figura 3). Dada a potência da toxina usado, pequenas quantidades que vazam da micropipeta, mesmo na presença de contra-pressão pode destruir células como a ponta é movida ao longo do campo (Figura 3). Usando a opção de segurança no microinjetor vai evitar essa perda.
Microdelivery da toxina também permite o exame de eventos em tempo real, tais como o fluxo de cálcio (Figura 4). Este fluxo não podem ser observados em células fixadas, e a entrega localizada da toxina permite o estudo de como este fluxo de cálcio induzida é propagada através de uma cultura de células. Cuidados devem ser tomados para não ferir as células com a micropipeta em si, pois isso também pode induzir fluxo de cálcio 11.
Aléma microscopia de campo amplo padrão, Microdelivery pode ser combinada com alta velocidade de microscopia confocal 3D. A vantagem de um microscópio confocal sobre o campo de largura é a capacidade de resolver os eventos no z dimensão e analisar planos individuais. Com as tecnologias actuais, o uso de um disco giratório confocal é necessário para atingir as altas velocidades necessárias. Estas vantagens permitem a visualização de micropartículas a ser derramado a partir de células dendríticas a seguir à injecção da toxina (Figura 5). Estas micropartículas são eliminados como parte do processo de reparação celular 4. Moléculas de toxina são concentrados em bolhas, que são eliminados para eliminar toxina 4. Sem imagem confocal, detectando as micropartículas seria difícil e potencialmente levar à conclusão de que a toxina não é eliminada desse modo.
Figura 1. Geralfluxo de trabalho para a geração e utilização de toxinas em imagens de células vivas. A toxina é purificada, sujeitos a um controlo de qualidade rigoroso e, em seguida entregue através de micropipeta de células que tenham sido previamente marcadas com corantes de viabilidade, indicadores de cálcio ou anticorpos para as proteínas de superfície. Os dados são adquiridos no microscópio e em seguida analisados por meio de software, tais como Metamorph ou Elements.
Figura 2. Controle de qualidade de purificada SLO. (A) As amostras de bactérias antes (T 0) e após (T 3) Indução da toxina, a purificação seguinte sobrenadante (S) e, em cada uma de três eluições (E 1-E 3) foram resolvidas por SDS-PAGE e coradas com azul de Coomassie . (B) Uma ou outra linha de células dendríticas D2 ou leucemia de células da linha T27A foram desafiadas com várias concentrações de SLO por 5 min a 37 ° C, na presença de iodeto de propídio eexaminadas por citometria de fluxo. A lise específica foi determinada através da seguinte fórmula: lise específica = (% exp PI elevado -% PI elevado ctl) / (100 -% PI elevado ctl) * 100
Figura 3. Morte celular demonstrado por perda de calceína sinal e absorção de EtBr em fibroblastos dérmicos humanos, após a exposição localizada para a toxina bacteriana Fibroblastos anthrolysin O. foram incubadas com calceina AM e homodímero de etídio usando um kit vivo morto da Life Technologies. 100 pg do colesterol de ligação da toxina anthrolysin O 13 (uma oferta do Dr. Richard Resto, Drexel University) foi entregue por micropipeta para o centro do prato de cultura, e as imagens de fluorescência Widefield recolhidos usando uma objectiva de 40x, após 30 min. Imagens de vários campos foram combinados para gerar a imagem maior mostrado usando Metamorfo.
Figura 4. Influxo de cálcio em citosol de células dendríticas humanas expostas ao SLO toxina bacteriana. As células foram carregadas com fura2 AM, antes da entrega de uma solução de SLO, numa concentração de 80 U / ul e uma taxa de fluxo de 1 nl / min. A ponta da micropipeta usado para a entrega é indicado no tempo 0 por um asterisco amarelo. As imagens foram recolhidas continuamente no modo de campo amplo a 340 e 380 nm, comprimentos de onda de excitação, e o rácio de emissões usados para determinar os níveis de cálcio citosólico. Mudança de verde para azul pseudo indica um aumento nos níveis de cálcio citosólico. A marca de tempo em cada painel indica segundos depois de começar a adição de toxina. Barra de escala é de 20 um. Clique aqui para ver maior figura .
Figura 5. Lançamento de microvesículas a partir da superfície das células dendríticas expostas a SLO. As células foram pré-incubados com anti-CD11c conjugado com APC para rotular a membrana do plasma, seguindo-se a entrega de um bolus de U -3 3x10 de SLO. Reconstruções 3-D foram gerados a partir confocal z pilhas recolhidas em cada ponto de tempo indicado em minutos. A ponta do microinjector foi identificada utilizando imagiologia DIC e é indicado pela seta amarela. Barra de escala é de 20 um.
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Discussion
As técnicas descritas aqui permitem a análise das respostas de células imunes para as toxinas bacterianas. A etapa mais crítica é o manuseamento e a dosagem da toxina. A actividade da toxina pode ser extremamente variável, mesmo entre diferentes alíquotas da mesma preparação, devido à sua fragilidade. Isto requer tanto o teste de cada aliquota de toxina contra uma linha de células de referência, ou RBCs ou utilizando gradientes de toxina. Gradientes de toxina, tal como entregue por micropipeta, permitir que o espectro total da toxina actividades induzidas a serem observados em tempo real, mas não se presta para a análise bioquímica.
Micropipeta entrega da toxina pode ser um desafio. Ao contrário de microinjecção padrão, no entanto, a penetração da célula não é necessária para este ensaio. Na verdade, deve ser tomado cuidado para não danificar as células com a própria agulha, pois isso irá provocar uma resposta semelhante de reparação da membrana 12. Em células do sistema imune, em particular, os fluxos de cálcio gerado pelaagulha de contato irá propagar através de nanotubos a outras células dentro da cultura 11. Células não injectada também aumentar a vida útil da agulha. Da mesma forma, a utilização de uma lente de Bertrand seguir descida da agulha para as células remove alguma incerteza no posicionamento da micropipeta. Apesar de agulhas danificadas vai vazar toxina mais rapidamente do que as agulhas intactas, eles ainda podem ser usados para gerar resultados preliminares. O sistema permite que microinjector para múltiplas injecções, se um gradiente superior a toxina ser desejado. Alternativamente, o tempo de injecção pode também ser modificada para alterar a dose aplicada. O microinjector também permite que múltiplas experiências de ser realizada dentro de um prato. Além disso, o efeito de reexposição pode ser estudada. Embora descrevemos experiências examinam as células imunitárias, estes métodos podem ser adaptados a outras linhas celulares também.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer Resto Richard pelo dom generoso de anthrolysin O, Michael Caparon pelo dom generoso dos francos SLO plasmídeo e Jonathon de assistência técnica. Este trabalho foi financiado pelo NIH T32CA82084 (PAK), e R01AI072083 (RDS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||||||
| Ni-NTA agarose | Qiagen | 30210 | |||||||||||||||||||
| polymixin-agarose | Sigma | P1411-5ML | |||||||||||||||||||
| Zeba Desalt Spin col | Fisher | PI-89891 | |||||||||||||||||||
| sheep RBCs | Fisher | 50-415-688 | |||||||||||||||||||
| pBADgIII-SLO | N/A | N/A | see ref9 | ||||||||||||||||||
| Cy5 monoreactive dye | GE Healthcare | PA25001 | |||||||||||||||||||
| Fura2-AM | Life Technologies | F1221 | |||||||||||||||||||
| Calcein AM/ Ethidium homodimer | Life Technologies | L3224 | |||||||||||||||||||
| Anti-CD11c-APC | BD Biosciences | 550261 | |||||||||||||||||||
| collagen-coated glass-bottom dish | Mattek | P35GCol-1.5-10-C | |||||||||||||||||||
| femto-tip II | Fisher | E5242957000 | |||||||||||||||||||
| Microloader | Fisher | E5242956003 | |||||||||||||||||||
| dextran Alexa 555 | Life Technologies | D34679 | |||||||||||||||||||
| Injectman NI 2 | Eppendorf | 920000029 | |||||||||||||||||||
| FemtoJet | Eppendorf | 5247 000.013 | |||||||||||||||||||
Table 1. List and source of specific reagents and equipment needed. Specific equipment and reagents used in this protocol, along with company and catalogue number are listed. |
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Table 2. List of buffers used in this protocol. The buffers used, their composition and the first step at which they are used in the protocol are listed. |
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References
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