Визуализация бактериальный токсин индуцированные ответы с помощью флуоресцентной микроскопии Онлайн сотовых

Summary

Методы очистки холестерина обязательного токсина стрептолизин O из рекомбинантных

Abstract

Бактериальные токсины связываются с холестерином в мембране, образуя поры, которые позволяют утечка клеточного содержимого и притоком материалов из внешней среды. Клетка может либо выйти из этой оскорбление, которое требует активных процессов ремонта мембран, либо умирают в зависимости от количества воздействия токсинов и клетки ^1-го типа. Кроме того, эти токсины вызывают сильную воспалительную реакцию в зараженных хостов через активацию иммунных клеток, включая макрофаги, которые производят множество провоспалительных цитокинов ^2. Многие грамположительных бактерий производить холестерин обязательным токсины, которые, как было показано, способствует их вирулентность в значительной степени через неохарактеризованных механизмов.

Морфологические изменения в плазматической мембране клетки подвергаются воздействию этих токсинов включают их поглощение холестерина в обогащенной поверхности выступов, которые могут быть пролита в межклеточное пространство, что предполагает внутреннюю клеточную защитуМеханизм ^3,4. Этот процесс происходит во всех клетках в отсутствие метаболической активностью и могут быть визуализированы с помощью EM после химической ⁴ фиксации. В иммунных клеток, таких как макрофаги, которые опосредуют воспаление в ответ на воздействие токсинов, индуцированные мембранных везикул предложили, чтобы содержать цитокины IL-1 семья и может быть ответственность как за сброс токсинов и распространения этих провоспалительных цитокинов ^5,6,7. Связь между IL-1β выпуска и определенный тип гибели клеток, называемых pyroptosis была предложена, так как являются каспазы-1 зависимых процессов ^8. Чтобы разобраться в сложностях этого макрофагов ответ, который включает в себя токсины обязательным, упав на мембранных везикул, высвобождение цитокинов и, возможно, гибели клеток, мы разработали методы маркировки и флуоресцентной микроскопии, которые позволяют визуализации реального времени токсина межклеточных взаимодействий, в том числе Измерения дисфункции и смерти (рис. 1). Использоватьиз живых клеток необходимо в связи с ограничениями в других методов. Биохимические подходы не могут решить эффектов, происходящих в отдельных клетках, в то время проточной цитометрии не предлагает высокое разрешение, визуализации в реальном времени отдельных клеток. Методы, описанные здесь, могут быть применены к кинетического анализа ответов индуцированных другие стимулы включают в себя сложные фенотипические изменения в клетках.

Protocol

1. Очистка стрептолизина O (SLO)

1. Инокулировать 20 мл ночной культуры BL21 ЗОЛОТО клеток, содержащих pBADgIII-SLOhis плазмиды ⁹ в 0,5 бульоне LB L и добавить 500 мкл 50 мг / мл ампициллина. Встряхнуть культуры на 225 оборотов в минуту при 37 ° С до OD ₆₀₀ = 0,6, как правило, ~ 1,5 часа. Центрифуга 1 мл бактерий (считается T ₀₎ при 10000 XG 5 мин, растворить осадок в 140 мкл 1x SDS буфера для образцов / 1 OD и разрушать ультразвуком сдвига ДНК для анализа белков чистоты.
2. Вызвать бактерий с добавлением 5 мл 20% арабинозы к культуре, трясти при 225 оборотов в минуту при комнатной температуре в течение 3 часов. Сбор 1 мл бактерий, центрифуги и раствориться в 1х буфере образца SDS, как указано выше для T _{3 раза} точкой для чистоты анализа.
3. Соберите оставшиеся бактерии в 500 мл бутылке центрифуги, спина 12000 х г в течение 12 мин при 4 ° С (8500 оборотов в минуту Sorvall GS-3 ротора). Слейте супернатант, магазин гранул при температуре -80 ° С в течение ночи или дольше, если необходимо.
4. Ресуспендируют птОзен гранул на льду в 10 мл Lyse / промывочного буфера (50 мМ NaH ₂ PO _4, 300 мМ NaCl, 10 мМ имидазола, рН 8,0) дополнено с 400 мкл 25% Triton X-100, 100 мкл 100 мг / мл лизоцима, 50 мкл 200 мМ фенилметилсульфонилфторида (PMSF). Передача Ресуспендированный осадок в 50 мл трубки Ок-Ридже.
5. Разрушать ультразвуком лизата 5 раз в течение 30 секунд на льду с 30-секундными интервалами. Спин ультразвуком лизат в трубке Ок-Ридж в 39000 х г в течение 20 мин при 4 ° C (18.000 оборотов в минуту Sorvall SS-34 ротор).
6. В то время как лизат спиннинг, мыть 1 мл Ni-NTA агарозы с 10 мл Lyse / промывочного буфера и спина на 1200 мин в течение 5 мин при 4 ° C. (Все дальнейшие моет / ELUTIONS использовать центрифугирования в этих условиях). Аспирируйте мыть.
7. Добавить бактериальной супернатант с шага от 1,5 до Ni-NTA агарозы, слегка встряхнуть в течение 2,5 ч при 4 ° C. Побочные собрать супернатант. Комбинат 30 мкл супернатанта с 10 μ 4x буфера для образцов SDS и сохранить для чистоты анализа. Вымойте бисером 4 раза в Lyse / промывочного буфера исе в Tris / соли буфера (50 мМ Трис, 300 мМ NaCl, рН 8,0).
8. Элюировать 3 раза добавлением 1 мл буфера элюции (250 мМ имидазола в Tris / соли буфера) и 5 ​​мкл 1 М ДТТ (DTT) в бисер, инкубации на льду в течение 10 мин, спиннинг и сбором супернатанта. SLO очень редокс-чувствительных белков, и должны быть на льду в любое время. Как только снижается, белок быстро теряют свою активность, если нагревали до 37 ° С, даже на короткий период времени.
9. Вымойте 500 мкл полимиксина-сопряженных агарозы в буфере элюирования, спина при 10000 х г в течение 1 мин при 4 ° С и ресуспендируют в 500 мкл. Для разрушающих эндотоксин, добавить 200 мкл бисером каждого элюирования и встряхнуть 4 ° С в течение 30 мин. Спин при 10000 х г в течение 1 мин при 4 ° С, и сохраните супернатант. Комбинат 30 мкл каждого элюирования с 10 мкл образца 4x SDS буфера для SDS-PAGE анализа.
10. Проверьте чистоту элюирования на SDS-PAGE. Отварить образцы сохраняются для анализа гель при 95 ° С в течение 5 мин и нагрузке 10 мкл на 10% гель. Пятно GEл Кумасси визуализировать белки (рис. 2A). SLO составляет 69 кДа. Выполнение анализа Брэдфорда, чтобы определить концентрацию белка (типичный выход составляет 4 мг / мл в течение первых двух элюирования, но может варьироваться в зависимости от штамма бактерий и плазмид использовали).
11. Проверьте гемолитической активностью каждого элюирования (см. ниже). Бассейн элюирования, где чистоты, концентрации и гемолитической активностью являются удовлетворительными. Алиготе SLO в одноразовой порции (обычно 5-10 мкл), заморозить на сухом льду и хранят при температуре -80 ° C.

2. Гемолитическая анализа

1. Вымойте овец красных кровяных телец (эритроцитов) в РБК Аналитический буфер (0,3% бычьего сывороточного альбумина (БСА), 2 мМ CaCl _2, 10 мМ Hepes, рН 7,4), спина при 1200 оборотов в минуту в течение 5 минут, и ресуспендируют на 2,5% эритроцитов в 10 мл РБК буфере для анализа.
2. Добавить 10 мкл анализе РБК буфера / лунку в 96-луночные V-нижнюю пластину на льду. Серийно разбавления каждого элюирования в двух экземплярах. Типичный диапазон разбавления 1:1000 до 1:512,000. Включите 3 скважины, не токсин и 3 скважины по 10мкл 2% Triton X-100 как минимальное и максимальное скважин, соответственно.
3. Крышка и инкубировать при 37 ° С 30 мин. Центрифуга при 1200 оборотов в минуту в течение 5 мин. Передача 70 мкл супернатанта к плоским дном 96-луночный планшет. Прочитано _405. Один блок является разбавление токсинов требуется на 50% лизис эритроцитов. Токсин деятельности 1 шт * разбавления factor/0.01 мл.

3. Сотовые Литические анализа

1. Урожай клеток, граф, спина. Ресуспендируют на 2х10 ⁶ / мл в буфере R / B (RPMI с добавлением 2 мМ CaCl _2, 0,5% BSA) и 20 мкг / мл пропидия йодида. Добавить 100 мкл клеток в 96-и V-нижней пластине.
2. Поочередно разводить SLO в 2 раза конечной концентрации в буфере R / B, добавить 100 мкл токсина или 100 мкл буфера R / B в клетки. Инкубировать 5 мин 37 ° C. Типичные окончательного диапазона концентраций от 2.000 ед / мл до 31,25 Ед / мл.
3. Выполнить клеток на проточном цитометре и собирать данные с фильтрами для фикоэритрин (PE). Одного журнала сдвиг представляет временно пермеабилизованной челLs в то время как 3-журнал сдвиг указывает мертвых клеток ^4. Рассчитать специфического лизиса клеток путем вычитания доли мертвых клеток в контроле (% PI ^{высокой} _CTL) из экспериментальных (% PI ^{высокого} _опыта), а именно: специфического лизиса = (% PI ^{высокой} _ехр -% PI ^{высокой} _CTL) / (100 -% PI ^{высокой} _CTL) * 100

4. Микропипетки доставки токсинов в клетки в культуре посуды

1. За день до эксперимента, пластины 2x10 ⁵ макрофагов на коллагена покрытием со стеклянным дном 35 мм блюдо.
2. Включите микроскопа и микроинъектор. Позвольте с подогревом время этапа нагреваться до 37 ° С. Выбор микроскопа обычно зависит от того, что на местном рынке. Микроскоп необходимо перевернутой этапе, этапе могут нагревать блюда до 37 ° C, возбуждение / излучение светофильтров подходит для красителя выбрали, и пространства для физического подключения микроинъектор. Линзы Бертранаявляется полезным для микроинъекции, но не обязательно. Компьютер вождения микроскопа необходимо достаточно памяти для сбора и хранения данных.
3. Этикетка клетки в течение 30 мин с красителем при 37 ° C. В зависимости от анализа, маркировка может быть сделано с 5 мкл Fura2 утра в 1 мл PBS или 2 мкл кальцеин утра в 1 мл полной среды. Для Fura2, возбуждение / излучение, собранных для 340/510 нм и 380/510 нм, а отношение 340/380 сигналов определяет кальция потока. Для кальцеин, возбуждение / излучение 495/515 нм, в то время как этидия гомодимером является 525/620 нм и является APC 650/660 нм. Другие лейблы могут быть выбраны, как хорошо.
4. Вымойте клетки с PBS и место в 1 мл RPMI с добавлением 2 мМ CaCl _2. Монтируется на микроскопе.
5. Развести токсинов и декстрана в воде, и центрифуге при 20000 х г 10 мин в течение 4 ° C. Как правило, 1 мкл SLO и 4 мкл 10 мг / мл декстрана-555 разбавляют в 6 мкл воды. Декстран или другой жидкости флуоресцентный фазе молекулы используются для проверки того, что фемто-чаевые не засорен, и InjeCTS как хотелось бы.
6. Загрузите фемто-наконечник из заднего с 0,07 мкл разведенного токсина использованием microloader.
7. Загрузите фемто-наконечника на микроинъектор. Регулировка угла инжектора так, чтобы кончик будет сидеть по центру ячейки с номером, чтобы двигаться во всех направлениях. Очистить г-предел. Инъекции параметры должны быть инъекционных за 0,5 сек при 120 фунтов на квадратный дюйм с 20 обратного давления фунтов на квадратный дюйм. Нижний наконечник, пока он входит в среду.
8. Использование линза Бертрана, в центре кончика и следуйте чаевые, как опускается ближе к клеткам. Как только вы теряете фокус, вернуться к нормальной оптикой. Иглу тени должны быть очевидны в этой области. Фокус над клетками и опустить иглу, пока он находится в фокусе. Задний фокус на клетки и тщательно принести иглу, прилегающих к клетке. Установите г-лимит для инъекций. Начать изображения, переместите наконечник в нужное положение, вводят выпустить токсин в нужной точке времени. Поднимите иглу, переехать в новый регион клеток и инъекции. Перемещение иглы в исходное положение, чтобы предотвратить любые нежелательныеТоксин утечки из иглы.

Representative Results

Обычно 10 ⁷ -10 ⁸ ед / мл SLO может быть получена с белком концентрации 4 мг / мл. Количество токсина необходимых для лизиса клеток меняется в зависимости от типа клеток, но, как правило, 125-500 ЕД / мл SLO (рис. 2В). Сотовый типов, таких как макрофаги могут быть более устойчивыми (4000 ЕД / мл), хотя другие (особенно Т клеточных линий) являются более чувствительными. Эти чувства соотносятся с коммерчески доступными SLO. Токсин активность снижается примерно в 2 раза с каждой замораживания-оттаивания, так гемолитической пробы с каждой партии или оттепель токсина необходимы для проверки токсина деятельности. Токсин также очень чувствительны к нагреванию и окислению ¹⁰ в отсутствие холестерина содержащих мембран, поэтому необходимо соблюдать осторожность при работе с белком.

Microdelivery от токсинов позволяет сравнивать необработанных клетках организма токсинов обработанных клеток в том же блюде. Она также обеспечивает внутренний контроль, чтобы токсин деятельности, поскольку диффузии градиент будет установlished от кончика микропипетки. Регионы близко к микропипетки покажет гибели клеток, характерны кальцеин потери и этидия гомодимером поглощения, в то время как регионы дальше от кончика покажет отсутствие повреждения (рис. 3). Учитывая активность токсина использовали небольшие количества, вытекающие из микропипетки даже при наличии обратного давления может разрушать клетки, как наконечник перемещается вдоль поля (рис. 3). Использование опции безопасности на микроинъектор позволит избежать этих потерь.

Microdelivery от токсинов также позволяет исследовать события в реальном времени, такие как кальций потока (рис. 4). Этот поток не может быть обнаружено в фиксированных клетках, и локализованные доставки токсина позволяет изучать, как это индуцированного потока кальция распространяется по культуре клеток. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы не повредить клетки с микропипетки себя, так как это может также вызвать кальция потока ^11.

В дополнениек стандартной широкого поля микроскопию, microdelivery могут быть объединены с высокой скоростью 3D конфокальной микроскопии. Преимущество конфокальной микроскопии более широкого поля является способность решать событий в Z-измерение и анализ отдельных плоскостях. При нынешних технологиях, использование вращающегося диска конфокальной необходимо для достижения высоких скоростей необходимы. Эти преимущества позволяют визуализации микрочастиц льется из дендритных клеток после инъекции токсина (рис. 5). Эти микрочастицы пролить как часть сотовой связи ⁴ процессу ремонта. Токсин молекул сосредоточены на пузырьки, которые пролили для устранения токсинов ^4. Без конфокальной микроскопии, обнаружения микрочастиц будет трудно, и потенциально может привести к заключению, что токсин не устранены таким образом.

Рисунок 1. Общаярабочий процесс для создания и использования токсинов в живых клеток. Токсин очищают, подвергаются строгому контролю качества, а затем доставляется через микропипетки к клеткам, которые были ранее помечены жизнеспособность красители, кальция, показателей или антитела к поверхностным белкам. Данные, приобретенные на микроскоп и затем анализируются с помощью программного обеспечения, таких как Metamorph или элементов.

Рисунок 2. Контроль качества очищенной SLO. (A) Образцы бактерий до (T ₀₎ и после (T ₃₎ токсин индукции, супернатант после очистки (S), и каждая из трех элюирования (E _{1-E 3)} были решены SDS-PAGE и окрашивали кумасси синим . (B) Либо дендритных D2 линии клеток лейкемии или клеточной линии T27A заражали различными концентрациями SLO течение 5 мин при 37 ° C в присутствии йодида и пропидиярассмотрены проточной цитометрии. Специфического лизиса определяется по следующей формуле: специфического лизиса = (% PI ^{высокой} _ехр -% PI ^{высокой} _CTL) / (100 -% PI ^{высокой} _CTL) * 100

Рисунок 3. Гибель клеток показали потерю кальцеин сигнала и поглощения EtBr в фибробластов кожи человека после локализованного воздействия бактериальных токсинов anthrolysin О. фибробласты инкубировали с кальцеин AM и этидия гомодимером использованием живых мертвецов комплект от Life Technologies. 100 пг холестерина обязательного токсина anthrolysin O ¹³ (подарок от доктора Ричарда отдыха, Drexel University) выступил микропипетки в центре культуры блюдо, и широкопольных флуоресцентных изображений собранных с помощью 40x цель через 30 мин. Изображения из нескольких полей были объединены для создания большого изображения отображаются с использованием Metаморфный.

Рисунок 4. Приток кальция в цитоплазме клеток человека дендритных подвергается бактериальной SLO токсина. Клетки были загружены fura2 AM до сдачи решение SLO в концентрации 80 ед / мкл и скорости потока 1 л / мин. Кончика микропипетки использоваться для доставки указана на момент 0 желтой звездочкой. Изображения были собраны непрерывно в режиме широкопольных при 340 и 380 нм длины волны возбуждения, а отношение объема выбросов используется для определения уровня цитозольного кальция. Переход от зеленого до синего псевдо указывает на увеличение уровня цитозольного кальция. Время знака в каждой панели указывает секунд после начала добавления токсина. Шкала бар 20 мкм. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Рисунок 5. Выпуск микровезикулы от поверхности дендритных клеток воздействию SLO. Клетки предварительно инкубировали с анти-CD11c конъюгированных с APC для обозначения плазматической мембраны, а затем доставку болюса 3х10 ^-3 U из SLO. 3-D реконструкций были получены от конфокальной Z-стеки собраны в каждый момент времени указывается в минутах. Кончик микроинъектор была определена использованием DIC изображений и указывает желтая стрелка. Шкала бар 20 мкм.

Discussion

Описанные здесь методы позволяют рассмотрении реакции иммунных клеток к бактериальным токсинам. Самым важным шагом является обработка и дозировки токсина. Токсин деятельности может быть чрезвычайно разнообразен, даже между различными аликвоты того же препарата, из-за его хрупкости. Это требует либо тестирования каждой аликвоты токсин против линии ссылкой на ячейку или эритроцитов или с использованием токсинов градиентов. Токсин градиенты, сданным микропипетки, позволяют полный спектр токсина видах деятельности, которые должны соблюдаться в режиме реального времени, но не поддается биохимическому анализу.

Микропипетки поставки токсин может быть сложной задачей. В отличие от стандартных микроинъекции, однако, проникновение ячейки не требуется для этого анализа. В самом деле, необходимо соблюдать осторожность, чтобы не повредить клетки с самой иглы, так как это вызовет подобную реакцию ремонт мембраны ^12. В иммунных клеток, в частности, кальция потоков порожденныхиглу контакт будет распространяться через нанотрубки с другими клетками в культуре ^11. Не инъекционных клетки также продлить срок службы иглы. Аналогичным образом, использование линз Бертрана следовать спуска иглы к клеткам снимает некоторую неопределенность в позиционировании микропипетки. Хотя повреждения иглы будет вытекать токсинов быстрее, чем нетронутыми иглы, они все же могут быть использованы для создания предварительных результатов. Система микроинъектор позволяет несколько инъекций, должны более высокий градиент токсина желать лучшего. Кроме того, продолжительность впрыска может быть изменен, чтобы изменить дозу доставлены. Микроинъектор также позволяет использовать несколько экспериментов, которые будут выполняться в течение одного блюда. Кроме того, эффект перевызов могут быть изучены. Хотя мы описывают эксперименты, изучение иммунных клеток, эти методы могут быть адаптированы для других клеточных линий, а также.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ni-NTA agarose	Qiagen	30210
polymixin-agarose	Sigma	P1411-5ML
Zeba Desalt Spin col	Fisher	PI-89891
sheep RBCs	Fisher	50-415-688
pBADgIII-SLO	N/A	N/A	see ref9
Cy5 monoreactive dye	GE Healthcare	PA25001
Fura2-AM	Life Technologies	F1221
Calcein AM/ Ethidium homodimer	Life Technologies	L3224
Anti-CD11c-APC	BD Biosciences	550261
collagen-coated glass-bottom dish	Mattek	P35GCol-1.5-10-C
femto-tip II	Fisher	E5242957000
Microloader	Fisher	E5242956003
dextran Alexa 555	Life Technologies	D34679
Injectman NI 2	Eppendorf	920000029
FemtoJet	Eppendorf	5247 000.013
Table 1. List and source of specific reagents and equipment needed. Specific equipment and reagents used in this protocol, along with company and catalogue number are listed.
Buffer Composition Step Used Lyse/Wash 50 mM NaH2PO4 300 mM NaCl 10 mM imidazole, pH 8.0 1.4 Tris/salt 50 mM Tris, pH 8.0 300 mM NaCl 1.7 Elution buffer 50 mM Tris, pH 8.0 300 mM NaCl 250 mM imidazole 1.8 RBC Assay buffer 0.3% BSA 2 mM CaCl2 10 mM HEPES, pH 7.4 2.1 buffer R/B RPMI cell culture medium 2 mM CaCl2 0.5% BSA 3.1
Table 2. List of buffers used in this protocol. The buffers used, their composition and the first step at which they are used in the protocol are listed.