Visualisering av bakterietoxin Inducerade svar Använda Live Mikroskopi Cell Fluorescens

Summary

Metoder för rening av kolesterol bindande toxinet streptolysin O från rekombinant

Abstract

Bakteriella toxiner binder till kolesterol i membran, bildar porer som tillåter läckage av cellulära innehåll och inflöde av material från den yttre miljön. Cellen kan antingen återhämta sig från denna förolämpning, som kräver aktiva processer membran reparation, annars dör beroende på mängden av toxin exponering och celltyp ^1. Dessutom är dessa toxiner inducera starka inflammatoriska svar i infekterade värdar genom aktivering av immunceller, inkluderande makrofager, som producerar en rad av proinflammatoriska cytokiner ^2. Många grampositiva bakterier producerar kolesterol bindande toxiner som har visat sig bidra till deras virulens genom i stort sett okarakteriserade mekanismer.

Morfologiska förändringar i plasmamembranet hos celler som exponeras för dessa toxiner inkluderar sin sekvestrering i kolesterolrika yta utsprång, som kan utsöndras i det extracellulära utrymmet, vilket tyder på en inneboende cellulär försvarmekanismen ^3,4. Denna process sker på alla celler i frånvaro av metabolisk aktivitet, och kan visualiseras med användning av EM efter kemisk fixering ^4. I immunceller såsom makrofager som medierar inflammation som svar på toxin exponering induceras membranvesiklar föreslås innehålla cytokiner av IL-1-familjen och kan vara ansvarig både för att kasta toxin och sprida dessa proinflammatoriska cytokiner ^5,6,7. En koppling mellan IL-1β utsläpp och en viss typ av celldöd, har kallas pyroptosis föreslagits, eftersom båda är kaspas-1 beroende processer ^8. Att reda ut komplexiteten i denna makrofag svar, som inkluderar toxin bindande, utsöndring av membranvesiklar, cytokinfrisättning, och potentiellt celldöd, har vi utvecklat märkning tekniker och fluorescens metoder mikroskopi som möjliggör realtid visualisering av toxin-cell-interaktioner, inklusive mätningar av dysfunktion och död (figur 1). Användav levande cell imaging är nödvändigt på grund av begränsningar i andra tekniker. Biokemiska metoder kan inte lösa effekter som uppträder i enskilda celler, medan flödescytometri inte erbjuda hög upplösning, realtid visualisering av individuella celler. De metoder som beskrivs här kan tillämpas på kinetisk analys av svar som induceras av andra stimuli involverar komplexa fenotypiska förändringar i celler.

Protocol

1. Rening av streptolysin O (SLO)

1. Inokulera 20 ml nattgammal kultur av BL21 GOLD celler innehållande pBADgIII-SLOhis plasmiden ⁹ i 0,5 L LB-buljong och tillsätt 500 pl 50 mg / ml ampicillin. Skaka kultur vid 225 rpm vid 37 ° C tills OD ₆₀₀ = 0,6, vanligtvis ~ 1,5 timmar. Centrifugera 1 ml bakterier (anses T ₀₎ vid 10.000 xg 5 minuter, lös pelleten i 140 ul 1x SDS provbuffert / 1 OD och sonikera att klippa DNA för protein renhet analys.
2. Inducera bakterier med tillsats av 5 ml 20% arabinos till kultur, skaka vid 225 rpm vid rumstemperatur under 3 timmar. Samla 1 ml bakterier, centrifugera och lös i 1x SDS-provbuffert som ovan för T ₃ tidpunkt för renhet analys.
3. Samla kvarvarande bakterier i 500 ml centrifugflaska, snurra 12.000 xg i 12 minuter vid 4 ° C (8500 rpm Sorvall GS-3 rötor). Dekantera supernatanten, lagra pelleten vid -80 ° C över natten eller längre om det behövs.
4. Resuspendera frOzen pelleten på is i 10 ml Lyse / Tvättbuffert (50 mM NaH ₂ PO _4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol, pH 8,0) kompletterad med 400 | il 25% Triton X-100, 100 ^ 100 mg / ml lysozym, 50 il 200 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF). Överför den återsuspenderade pelleten till 50 ml Oak Ridge rör.
5. Sonikera lysatet 5 gånger i 30 sekunder på is med 30 sek intervall. Spin sonikerades lysat i Oak Ridge rör vid 39.000 xg under 20 minuter vid 4 ° C (18.000 rpm Sorvall SS-34 rötor).
6. Medan lysatet spinning, tvätta 1 ml Ni-NTA-agaros med 10 ml Lyse / Tvättbuffert och centrifugering vid 1.200 rpm under 5 minuter vid 4 ° C. (Alla ytterligare tvättar / elueringar använder centrifugering under dessa förhållanden). Aspirera tvätta.
7. Lägg bakteriell supernatant från steg 1,5 till Ni-NTA-agaros, skaka försiktigt i 2,5 timmar vid 4 ° C. Spin samla supernatanten. Kombinera 30 pl av supernatanten med 10 μ 4x SDS provbuffert och spara för renhet analys. Tvätta pärlorna 4 gånger i Lyse / Tvättbuffert ochce i Tris / salt-buffert (50 mM Tris, 300 mM NaCl, pH 8,0).
8. Eluera 3 gånger genom tillsats av 1 ml buffert Eluering (250 mM imidazol i Tris / saltbuffert) och 5 pl 1 M ditiotreitol (DTT) till pärlor, inkubering på is under 10 minuter, spinning och uppsamling av supernatanten. SLO är en mycket redox-känsliga protein och måste hållas på is hela tiden. När minskas, kommer proteinet förlorar snabbt sin aktivitet om värmdes till 37 ° C, även under en kort tidsperiod.
9. Tvätta 500 pl polymixin-konjugerad agaros i elueringsbuffert, centrifugera vid 10.000 x g under 1 min vid 4 ° C och återsuspendera i 500 pl. Att tömma endotoxin, tillsätt 200 ul pärlor till varje eluering och skaka 4 ° C under 30 minuter. Centrifugering vid 10.000 x g under 1 min vid 4 ° C, och spara supernatanten. Kombinera 30 pl av varje eluering med 10 pl 4x SDS provbuffert för SDS-PAGE-analys.
10. Testa renhet elueringar genom SDS-PAGE. Koka proverna sparas för gelanalys vid 95 ° C under 5 min och belastningen 10 pl på en 10% gel. Fläck geL med Coomassie att visualisera protein (Figur 2A). SLO är 69 kDa. Utför en Bradford-analys för att bestämma proteinkoncentration (typiskt utbyte är 4 mg / ml för de första två elueringar, men kan variera beroende på bakteriestam och plasmid används).
11. Testa den hemolytiska aktiviteten hos varje eluering (se nedan). Pool elueringar där renhet, koncentration och hemolytisk aktivitet är tillfredsställande. Alikvotera SLO i engångsbruk alikvoter (normalt 5-10 ul), frysa på torris och förvara vid -80 ° C.

2. Hemolytisk analys

1. Tvätta får röda blodkroppar (RBC) i RBC Analysbuffert (0,3% bovint serumalbumin (BSA), ₂ mM CaCl2, 10 mM Hepes, pH 7,4), centrifugering vid 1.200 rpm under 5 minuter, och återsuspendera vid 2,5% RBC i 10 ml RBC Analysbuffert.
2. Tillsätt 10 | il RBC analysbuffert / brunn i 96-brunnars V-botten platta på is. Seriellt späd varje eluering i två exemplar. Typiska utspädning intervall är 1:1000 till 1:512,000. Inkludera 3 brunnar utan toxin och 3 brunnar med 10pl 2% Triton X-100 som minsta och största brunnar, respektive.
3. Täck plattan och inkubera vid 37 ° C 30 minuter. Centrifugera vid 1.200 rpm under 5 minuter. Överför 70 pl supernatant till en flatbottnad 96-brunnsplatta. Läs A _405. En enhet är utspädningen av toxin som erfordras för 50% lys av RBC. Toxinaktivitet är 1 enhet * utspädning factor/0.01 ml.

3. Cell lytisk analys

1. Harvest celler, räkna, spin. Återsuspendera vid 2x10 ⁶ / ml i buffert R / B (RPMI med ₂ mM CaCl2, 0,5% BSA) och 20 | ig / ml propidiumjodid. Tillsätt 100 fil celler till en 96-brunns V-botten platta.
2. Seriellt utspädda SLO till 2x slutlig koncentration i buffert R / B, tillsätt 100 ^ toxin eller 100 ul buffert R / B celler. Inkubera 5 min 37 ° C. Typiska slutlig koncentrationer intervallet från 2.000 U / ml till 31,25 U / ml.
3. Kör celler på flödescytometern och samla in data med filter för fykoerytrin (PE). En en-log skift representerar övergående permeabiliseras celÄr medan en 3 log skift indikerar döda celler ^4. Beräkna specifik lys av cellerna genom att subtrahera den procentuella andelen döda celler i kontrollen (% PI ^hög _CTL) från den experimentella (% PI ^hög _exp), enligt följande: specifik lys = (% PI ^hög _exp -% PI ^hög _CTL) / (100 -% PI ^hög _CTL) * 100

4. Mikropipett Leverans av toxin till celler i odlingsskålar

1. En dag före att experimentera, plattan 2x10 ⁵ makrofager på en kollagen-belagt glas-botten 35 mm skål.
2. Slå på mikroskop och microinjector. Tillåt uppvärmd steget tid att värma till 37 ° C. Valet av mikroskopet beror vanligtvis på vad som lokalt tillgängliga. Mikroskopet behöver en inverterad fas, en fas som kan värma rätter till 37 ° C, excitation / emission filter kuber lämpliga för den valda färgen, och utrymmet för att fysiskt ansluta microinjector. En Bertrand linsär till hjälp för mikroinjektion, men krävs inte. Datorn kör mikroskop behöver tillräckligt med minne för att samla in och lagra data.
3. Label celler för 30 min med färgämne vid 37 ° C. Beroende på analysen får märkning ske med 5 ul fura2 AM i 1 ml PBS eller 2 pl calcein AM i 1 ml fullt medier. För fura2 är excitering / emission uppsamlades för 340/510 nm och 380/510 nm, och förhållandet 340/380 signaler bestämmer kalciumflöde. För kalcein är excitation / emission 495/515 nm, medan etidium homodimer är 525/620 nm och APC är 650/660 nm. Andra markörer kan väljas också.
4. Tvätta cellerna med PBS och plats i 1 ml RPMI kompletterat med ₂ mM CaCl2. Montera på mikroskop.
5. Späd toxin och dextran i vatten, och centrifugera vid 20.000 xg 10 min för 4 ° C. Typiskt 1 il SLO och 4 pl 10 mg / ml dextran-555 utspätt i 6 pl vatten. Dextran eller annan fluorescerande vätska-fas-molekylen används för att kontrollera att femto-tip inte är igensatt och InjeCTS önskas.
6. Fyll femto-tips bakifrån med 0,07 pl utspätt toxin med en microloader.
7. Fyll femto-tip på microinjector. Justera vinkeln på injektorn så att spetsen sitter över mitten av cellerna med utrymme att röra sig i alla riktningar. Rensa z-gräns. Injection inställningar ska injicera i 0,5 sekunder vid 120 psi med 20 psi mottryck. Nedre spetsen tills den inträder i mediet.
8. Använda Bertrand linsen, centrera spetsen och följer spetsen när den sänks närmare till cellerna. När du förlorar fokus, växla tillbaka till normal optik. Nålen skugga bör vara uppenbara inom området. Fokus ovanför cellerna och sänka nålen tills den är i fokus. Fokus tillbaka på cellerna och försiktigt föra nålen intill en cell. Ställ z-gränsen för injektion. Påbörja avbildning, flytta tips till önskat läge, injicera släppa toxin vid önskad tidpunkt. Höj nålen, flytta till en ny region av celler och injicera. Flytta nålen till startläget för att förhindra oönskadtoxin läckage från nålen.

Representative Results

Typiskt 10 ⁷ -10 ⁸ U / ml SLO kan erhållas med en proteinkoncentration av 4 mg / ml. Den mängd av toxin som krävs för cellys varierar beroende celltyp, men är vanligen 125-500 U / ml SLO (Figur 2B). Celltyper som makrofager kan vara mer motståndskraftiga (4000 U / ml) men andra (speciellt T-cellinjer) är mer känsliga. Dessa känsligheter motsvarar kommersiellt tillgänglig SLO. Toxin aktivitet minskar ungefär 2-faldigt med varje frys-tö, så hemolytiska analyser med varje parti eller tinar av toxin som behövs för att kontrollera toxinaktivitet. Toxin är också mycket känsliga för värme och oxidation ¹⁰ i frånvaro av kolesterol-innehållande membran, så måste försiktighet tas när man arbetar med proteinet.

Microdelivery av toxinet medger jämförelsen av obehandlade celler med toxin-behandlade celler i samma skålen. Det ger också en intern kontroll till toxinaktivitet eftersom en diffusionsgradient blir inrättandetetablerade från mikropipetten spets. Regioner nära till mikropipett visar celldöd, kännetecknas av kalcein förlust och etidium homodimer upptag, medan regioner längre bort från spetsen kommer att visa någon skada (Figur 3). Med tanke på styrkan av den använda toxinet, kan små mängder som läcker från mikropipetten även i närvaro av mottryck förstöra celler som spetsen förflyttas längs fältet (Figur 3). Använda säkerhet alternativ på microinjector kommer att undvika denna förlust.

Microdelivery av toxinet medger också granskning av händelser i realtid, såsom kalciumflöde (Figur 4). Detta flöde kan inte observeras i fixerade celler, och den lokala leveransen av toxinet medger studiet av hur denna inducerade kalciumflöde fortplantas genom en cellkultur. Man måste vara försiktig att inte skada cellerna med mikropipett själv, eftersom detta kan också leda till kalciumflöde ^11.

Dessutomstandard breda fält mikroskopi, kan microdelivery kombineras med hög hastighet 3D konfokalmikroskopi. Fördelen med ett konfokalt mikroskop över brett fält är förmågan att lösa händelser i z-dimensionen och analysera enskilda plan. Med dagens teknik är användningen av en roterande skiva konfokal nödvändigt för att uppnå de höga behövs hastigheter. Dessa fördelar tillåter visualisering av mikropartiklar som fälls från dendritiska celler efter toxininjektion (figur 5). Dessa mikropartiklar fälls som del av det cellulära reparationsprocessen ^4. Toxinmolekyler är koncentrerade till blåsor, som fäller att eliminera toxin ^4. Utan konfokal avbildning skulle upptäcka mikropartiklarna vara svåra och potentiellt leda till slutsatsen att toxin inte elimineras på detta sätt.

Figur 1. Övergripandearbetsflöde för att generera och utnyttja toxiner i levande cell imaging. Toxin renas, utsätts för rigorös kvalitetskontroll, och sedan levereras via mikropipett till celler som tidigare har märkts med livskraft färgämnen, indikatorer kalcium eller antikroppar mot ytproteiner. Data förvärvas på mikroskopet och sedan analyseras med programvara, t.ex. Metamorph eller Elements.

Figur 2. Kvalitetskontroll av renat SLO. (A) Prover av bakterier innan (T ₀₎ och efter (T ₃₎ toxin induktion, supernatanten efter rening (S), och var och en av de tre elueringar (E _{1-E 3)} upplöstes genom SDS-PAGE och färgades med Coomassie blue . (B) antingen dendritiska cellinjen D2 eller leukemi cellinje T27A provocerades med olika koncentrationer av SLO för 5 minuter vid 37 ° C i närvaro av propidiumjodid ochundersöktes genom flödescytometri. Den specifika lys bestämdes genom följande formel: specifik lys = (% PI ^hög _exp -% PI ^hög _CTL) / (100 -% PI ^hög _CTL) * 100

Figur 3. Celldöd visas genom förlust av kalcein signal och upptag av EtBr i humana dermala fibroblaster efter lokal exponering för de bakteriella toxin anthrolysin O. Fibroblaster inkuberades med kalcein AM och etidium homodimer med en levande död kit från Life Technologies. 100 pg av kolesterol bindande toxin anthrolysin O ¹³ (en gåva från Dr Richard Rest, Drexel University) levererades av mikropipett i mitten av kultur skålen och Widefield fluorescensbilder in med en 40x objektiv efter 30 min. Bilder från flera fält kombinerades för att generera större bild visas med Metamorph.

Figur 4. Kalciuminflödet i cytosol av humana dendritiska celler exponerade för den bakteriella toxinet SLO. Celler laddades med fura2 AM före leverans av en lösning av SLO i en koncentration av 80 U / ^ och en flödeshastighet av 1 Nl / min. Spetsen på mikropipett som används för leverans indikeras vid tidpunkten 0 genom en gul asterisk. Bilder uppsamlades kontinuerligt i Widefield läge vid 340 och 380 våglängder nm excitation, och förhållandet av utsläpp används för att bestämma cytosoliska kalciumhalter. Skift från grönt till blått pseudofärger indikerar en ökning i cytosoliska kalciumnivåer. Tiden märket i varje panel visar sekunder efter början tillsats av toxin. Skala bar är 20 nm. Klicka här för att se större bild .

Figur 5. Frisättning av mikrovesiklar från ytan av dendritiska celler som exponerats för SLO. Cellerna förinkuberades med anti-CD11c konjugerad till APC att märka plasmamembranet, följt av tillförsel av en bolus av 3x10 ^-3 U SLO. 3-D rekonstruktioner genererades från konfokal z-stackar som samlats vid varje tidpunkt som anges i minuter. Spetsen på microinjector identifierades med användning av DIC avbildning och indikeras av den gula pilen. Skala bar är 20 um.

Discussion

De tekniker som beskrivs här tillåta undersökning av svaren från immunceller till bakteriella toxiner. Det mest kritiska steget är hantering och dosering av toxinet. Toxinaktivitet kan vara extremt varierande, även mellan olika alikvoter av samma beredning, på grund av dess bräcklighet. Detta kräver antingen testa varje alikvot av toxin mot en referens cellinje eller RBC eller använda toxin gradienter. Toxin gradienter, som levereras av mikropipett, låt hela spektrumet av toxin-inducerade aktiviteter som skall iakttas i realtid, men inte lämpar sig för biokemisk analys.

Mikropipett leverans av toxinet kan vara en utmaning. Till skillnad från vanliga mikroinjektion, emellertid, är penetrering av cellen inte krävs för denna analys. I själva verket måste man inte skadar cellerna med nålen i sig, eftersom detta kommer att framkalla en liknande reaktion membran reparation ^12. I immunceller, särskilt kalcium flödena som genereras avnål kontakten propagera genom nanorör till andra celler i kulturen ^11. Inte injicera celler kommer också förlänga livslängden på nålen. Likaså avlägsnar använda en Bertrand lins att följa nålens nedstigningen till cellerna viss osäkerhet i positioneringen av mikropipetten. Även skadade nålar läcker toxin snabbare än intakta nålar, kan de fortfarande användas för att generera preliminära resultat. Det microinjector systemet kan för flera injektioner, bör en högre toxin lutning önskas. Alternativt kan insprutningens varaktighet också modifieras för att ändra den levererade dosen. Den microinjector ger också flera experiment som ska utföras inom en maträtt. Vidare kan effekten av återinsättning studeras. Även om vi beskriver experiment undersöker immunceller kan dessa metoder anpassas till andra cellinjer också.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ni-NTA agarose	Qiagen	30210
polymixin-agarose	Sigma	P1411-5ML
Zeba Desalt Spin col	Fisher	PI-89891
sheep RBCs	Fisher	50-415-688
pBADgIII-SLO	N/A	N/A	see ref9
Cy5 monoreactive dye	GE Healthcare	PA25001
Fura2-AM	Life Technologies	F1221
Calcein AM/ Ethidium homodimer	Life Technologies	L3224
Anti-CD11c-APC	BD Biosciences	550261
collagen-coated glass-bottom dish	Mattek	P35GCol-1.5-10-C
femto-tip II	Fisher	E5242957000
Microloader	Fisher	E5242956003
dextran Alexa 555	Life Technologies	D34679
Injectman NI 2	Eppendorf	920000029
FemtoJet	Eppendorf	5247 000.013
Table 1. List and source of specific reagents and equipment needed. Specific equipment and reagents used in this protocol, along with company and catalogue number are listed.
Buffer Composition Step Used Lyse/Wash 50 mM NaH2PO4 300 mM NaCl 10 mM imidazole, pH 8.0 1.4 Tris/salt 50 mM Tris, pH 8.0 300 mM NaCl 1.7 Elution buffer 50 mM Tris, pH 8.0 300 mM NaCl 250 mM imidazole 1.8 RBC Assay buffer 0.3% BSA 2 mM CaCl2 10 mM HEPES, pH 7.4 2.1 buffer R/B RPMI cell culture medium 2 mM CaCl2 0.5% BSA 3.1
Table 2. List of buffers used in this protocol. The buffers used, their composition and the first step at which they are used in the protocol are listed.